第3章-病毒和亞病毒因子說課

1、第3章-病毒和亞病毒因子說課第一節(jié) 病毒一. 病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)病毒的發(fā)現(xiàn) 1892年，科學(xué)家伊萬諾夫斯基在研究煙草花葉病的病因時，推想是由細菌引起的。但研究結(jié)果表明煙草花葉病是由一種可以穿過細菌濾器的病原體引起的。1898年，荷蘭細菌學(xué)家貝杰林克證實了這一結(jié)果，將這種病原體稱為“病毒”(virus)。 （真）病毒：至少含核酸和蛋白質(zhì)二種組分亞病毒類病毒：只含具侵染性的RNA組分衛(wèi)星RNA：只含有不具侵染性的RNA組分朊病毒：只含蛋白質(zhì)非細胞生物病毒無細胞結(jié)構(gòu)病毒造成的人類疾病病毒造成的動植物疾病患花葉病的胡蘿卜患黃矮病的水稻禽流感口蹄疫病毒的定義及分類病毒是一類核酸和蛋白質(zhì)等少數(shù)幾種成分組成的

2、超顯微非細胞生物，本質(zhì)是一種只含DNA或RNA的遺傳因子，能以感染態(tài)和非感染態(tài)兩種狀態(tài)存在，只在宿主細胞中才具有生命特征。 分類寄主：動物病毒、植物病毒、噬菌體遺傳物質(zhì)：DNA病毒、RNA病毒形態(tài)：桿狀 (螺旋狀）、多面體、復(fù)合型病毒的特征1.形態(tài)極其微小2.無細胞構(gòu)造的分子生物3.只含一種核酸4.高度的寄生性5.通過裝配方式進行繁殖6.離體可保持長期的侵染活性7.對抗生素通常不敏感8.有些能夠整合到寄主的基因組中病毒眾生相艾滋病毒SARS病毒煙草花葉病毒T噬菌體流感病毒狂犬病毒典型病毒粒的構(gòu)造病毒粒的基本構(gòu)造和特殊構(gòu)造衣 殼核 酸包 膜刺 突病毒粒(Virion)核衣殼(nucleocaps

3、id)基本構(gòu)造包膜(envelope)刺突(spike)核酸(nucleic acid)DNA or RNA衣殼(capsid )衣殼粒特殊構(gòu)造衣殼粒概念：為病毒的最小形態(tài)單位，由16個多肽分子折疊纏繞成的蛋白質(zhì)亞單位（三級結(jié)構(gòu)）。特點：不同病毒，多肽分子的組成不同。簡單病毒只有12種衣殼粒，如：TMV就只含有1種衣殼粒；復(fù)雜病毒有20種左右 的衣殼粒。衣 殼概念:是衣殼粒以對稱形式有規(guī)律的排列形成的病毒外殼。內(nèi)包核酸，形狀多樣。 殼體蛋白是許多亞基借次級鍵或靜電引力互相聚合而成的具四級結(jié)構(gòu)的多聚體。特點:亞基的組成和數(shù)目的不同是區(qū)別不同殼體蛋白的標志。形成衣殼的意義a.具較大的靈活性和方便性

4、；b.減少形成畸形衣殼的可能性；c.避免因合成錯誤而破壞結(jié)構(gòu)；d.符合遺傳節(jié)約原則。包 膜概念：指核衣殼外包裹的由類脂、多糖或蛋白質(zhì)組成的一層構(gòu)造較復(fù)雜的包膜，亦稱被膜或外膜。 包膜的形成：a. 來源于宿主細胞膜或核膜: 如流感病毒；b. 在宿主細胞內(nèi)合成： 如痘苗病毒。帶狀皰疹病毒的包膜包膜的功能包膜的結(jié)構(gòu)具有高度穩(wěn)定性。功能：a. 維系病毒體結(jié)構(gòu)；b. 保護病毒核酸； c. 包膜型病毒感染所必需：包膜表面上的糖蛋白識別并結(jié)合宿主表面受體；病毒包膜與宿主細胞膜結(jié)合；病毒衣殼和病毒基因組進入宿主，完成感染過程。刺 突概念：病毒包膜或衣殼表面的突起物。圖中可見流感病毒的刺突。功能：a.可啟動感染

5、；b.可誘生免疫保護作用；c.可中和抗體；d.可促使病毒從宿主細胞上釋放. 血凝素（HA）：流感病毒包膜上呈棒狀突起的糖蛋白刺突。HA也是流感病毒吸附細胞的結(jié)構(gòu)，可刺激機體產(chǎn)生中和抗體。神經(jīng)氨酸酶（NA）：流感病毒包膜表面呈蘑菇狀突起的糖蛋白刺突。NA可水解病毒與細胞之間的黏附物質(zhì)神經(jīng)氨酸，因此可幫助病毒從感染細胞膜表面釋放。二者均易發(fā)生變異，大變異可造成亞型改變。病毒的核酸 dsDNA/ssDNA dsRNA/ssRNA 線狀/環(huán)狀， 閉環(huán)/缺口環(huán) 單分子/雙分子 /三分子/多分子 病毒核酸的功能儲存病毒的遺傳信息控制病毒的遺傳變異控制病毒的增殖控制病毒對宿主的感染性病毒的對稱形式螺旋對稱如

6、煙草花葉病毒二十面體對稱如腺病毒復(fù)合對稱如T偶數(shù)噬菌體二十面體對稱的結(jié)構(gòu)特征特點：1)球或近球形；2)高倍電鏡下為多面體, 具20個等邊三角形和12個頂點的物體；3)多面多角多棱,是多顆粒按一定方式對稱排列形成,在角上為五鄰體（penton) ，面上六鄰體(hexon)。 形成原因：1)從拓撲學(xué)看，廿面體容積最大；2)最小單位面所需亞基少，利于遺傳節(jié)約； 3)亞基易于對稱排列，等價或準等價成鍵結(jié)合；綜上，廿面體對稱結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定、更合理。 代表：腺病毒螺旋對稱的結(jié)構(gòu)特征形狀：多為桿狀、纖維狀、彎曲桿狀。 特點：長形的衣殼粒螺旋狀排列，形成 中空的圓柱體，衣殼粒間為準等價結(jié)合，直徑取決于蛋白亞基的特

7、征，長度取決于核酸分子的長度；核酸埋嵌在衣殼粒之間的壁內(nèi)，以多個弱鍵與蛋白質(zhì)亞基相連。此方式可控制螺旋排列，同時增加殼體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。此形狀多為RNA病毒，具螺旋對稱的動物病毒多有包膜。代表：煙草花葉病毒復(fù)合對稱的結(jié)構(gòu)特征大腸桿菌的T4噬菌體是由橢圓形的二十面體頭部和螺旋對稱的尾部組合而成，是病毒中復(fù)合對稱的代表。病毒的群體形態(tài)包涵體空斑枯斑蝕（噬）斑測定(plaque assay)：以病毒感染性作為病毒數(shù)目測定的依據(jù)。在生長的宿主表面，鋪上細菌或動物病毒，在單層細胞上形成的蝕（噬）斑，可以認為由單個病毒增殖產(chǎn)生的。由此，可以通過蝕（噬）斑形成單位(pfu)來計算單位體積樣品中病毒的數(shù)量。二.

8、 四類病毒的繁殖方式原核生物的病毒植物病毒人和脊椎動物的病毒昆蟲病毒噬菌體的形態(tài)與組成基本形態(tài):蝌蚪形復(fù)合對稱結(jié)構(gòu)微球形廿面體對稱結(jié)構(gòu)纖絲形螺旋對稱結(jié)構(gòu)其中約95%為蝌蚪形。噬菌體的形態(tài)類型dsDNA, 蝌蚪狀，非收縮性尾；B. dsDNA, 蝌蚪狀，非收縮性長尾；C. dsDNA, 非收縮性短尾；D. ssDNA, 球狀，大頂衣殼粒；E. ssRNA, 球狀，小頂衣殼粒；F. ssDNA, 絲狀，無頭尾噬菌體的結(jié)構(gòu)頭部廿面體對稱結(jié)構(gòu)； 組成：蛋白質(zhì)、小肽、多 胺、內(nèi)含DNA。頸環(huán)六角形薄盤狀、連接頭尾的結(jié)構(gòu)；附頸須。尾鞘(tail sheath): 長95nm, 衣殼粒螺旋對稱；可伸縮,伸展

9、時24轉(zhuǎn)，收縮時12轉(zhuǎn)。尾管(tail tube): 長80-100nm，中空，DNA可由此進入細胞?；?base plate): 六角形盤狀物，中空，其角上有刺突、尾絲。刺突(spike): 長20nm，有吸附功能。尾絲(tail fiber): 長140nm，有識別吸附功能，可專一性的吸 附在敏感細胞表面相應(yīng)受體上。尾部噬菌體的增殖主要內(nèi)容烈性噬菌體的裂解周期一步生長曲線溫和噬菌體的溶源性反應(yīng)噬菌體的增殖根據(jù)噬菌體與宿主的關(guān)系，可將噬菌體分為2類：烈性噬菌體（virulent phage)：指感染后短時間內(nèi)能連續(xù)完成繁殖過程而使宿主細胞裂解的噬菌體.溫和噬菌體(temperat phag

10、e)：噬菌體感染細胞后，將其基因組核酸整合（附著）到宿主的基因組上，并隨宿主基因組的復(fù)制而同步，但不引起宿主細胞裂解，而是導(dǎo)致溶源性發(fā)生的噬菌體。(一)烈性噬菌體的增殖烈性噬菌體的增殖亦稱裂解性周期或增殖性周期。其裂解周期為：1)吸附(adsorption,attachment)2)侵入(entory,penetration,injection,induction)3)復(fù)制(生物合成biosynthesis） /增殖(replication)4)成熟(maturation)/裝配(assembly)5)(裂解)釋放(release)1. 吸 附噬菌體特異性識別專性的細菌細胞的過程。吸附蛋白(在

11、尾絲上)功能：啟動感染,特異性識別宿主細胞,與宿主細胞表面受體發(fā)生結(jié)合.細胞受體(圖中紅箭頭示)G+細胞壁上的肽聚糖、磷壁酸，G細胞壁上的LPS以及鞭毛、莢膜、菌毛上均有噬菌體吸附的位點。 2. 侵 入核酸注入細胞的過程。A.無收縮尾部: 由引導(dǎo)蛋白引導(dǎo)核酸進入細胞。B.有收縮尾部：當(dāng)尾絲牢固吸附在受體上后，靠刺突“釘”在細胞表面，在細胞表面“鉆孔”（刺突上常含酶類物質(zhì)，可降解細胞表面）；尾鞘收縮；頭部蛋白質(zhì)構(gòu)象改變；頭部蛋白質(zhì)與核酸結(jié)合松散；核酸注入細胞。3. 增 殖 核酸復(fù)制和蛋白質(zhì)合成期，表現(xiàn)為時序性。 此時，細胞表面不見噬菌體，故又稱為隱蔽期。4. 成 熟成熟(maturity)，即自

12、我裝配(self assembly)過程。是分期、分批進行的。5. 裂 解多種酶類(脂肪酶、溶菌酶等)作用，促進細胞裂解，釋放子代噬菌體。自外裂解：大量噬菌體吸附在同一宿主細胞表面并釋放眾多溶菌酶而導(dǎo)致的細胞裂解，僅是一種單純的溶菌作用，不會導(dǎo)致大量子代噬菌體產(chǎn)生。快速增殖過程（三）噬菌體效價的測定效價:生物制品活性（數(shù)量）高低的標志，通常采用生物學(xué)方法測定。噬菌體效價：又稱噬菌斑形成單位（pfu）數(shù),指每毫升試樣中含有侵染性噬菌體的粒子數(shù)。優(yōu)點：1) 彌補平板不平2) 噬菌斑位于同個平面，較清晰3) 上層為半固體培養(yǎng)基，有利噬菌體擴散（四）一步生長曲線 定量描述烈性噬菌體生長規(guī)律的實驗曲線，

13、用于反映各種噬菌體潛伏期、裂解期和裂解量的特征曲線。實驗設(shè)計依據(jù)：1個菌體被1個噬菌體感染,避免二次吸附(可引起自外裂解)。細菌群體被噬菌體同步感染。一步生長曲線的實驗過程1、用噬菌體的稀釋液感染高濃度的宿主細胞；2、數(shù)分鐘后，加入抗噬菌體的抗血清（中和未吸附的噬菌體）；3、將上述混合物用培養(yǎng)物大量稀釋，終止抗血清的作用和防止新釋放的噬菌體感染其它細胞；4、保溫培養(yǎng)并定期檢測培養(yǎng)物中的噬菌體效價（對噬菌體含量進行計數(shù)）；5、以感染時間為橫坐標，病毒的感染效價為縱坐標，繪制出病毒特征性的繁殖曲線；一步生長曲線潛伏期(侵入到裝配)：隱晦期+胞內(nèi)積累期 (eclipse period)裂解期 (ly

14、sis period)穩(wěn)定期 (steady period)可分以下階段：潛伏期：是指病毒侵入宿主細胞到病毒粒子釋放出胞外前的一段時間。曲線平行于橫軸。 潛伏前期又稱隱蔽期，是指病毒的核酸侵入宿主細胞后至第一個病毒粒子裝配前的一段時間，此時宿主細胞內(nèi)不含有完整的、有侵染力的成熟病毒粒子。 潛伏后期，病毒粒子裝配成熟，胞內(nèi)具侵染性的成熟病毒粒子數(shù)目逐漸增，但沒有釋放出胞外。寄主細胞的裂解標志著潛伏期的結(jié)束。此期為病毒復(fù)制所需的最短時間。為病毒復(fù)制的特征性數(shù)據(jù)。 噬菌體以分鐘計； 動植物病毒以小時、天計。裂解期：是指宿主細胞迅速裂解，溶液中病毒粒子急劇上升的一段時間。病毒沒有個體生長，其宿主細胞裂

15、解也是突發(fā)的。曲線表現(xiàn)為直線上升。穩(wěn)定期：是指感染病毒的宿主細胞全部裂解，溶液中病毒效價達到最高點以后的時期。曲線呈一個平頂。一步生長曲線的特征數(shù)據(jù)兩個特征性數(shù)據(jù)潛伏期：是病毒顆粒吸附于細胞到受染細胞釋放出子代病毒顆粒所需的最短時間，不同病毒的潛伏期長短不同，噬菌體以分鐘計，動物病毒和植物病毒以小時或天計。裂解量：是每個受染細胞所產(chǎn)生的子代病毒顆粒的平均數(shù)目，其值等于潛伏期受染細胞的數(shù)目除穩(wěn)定期受染細胞所釋放的全部子代病毒數(shù)目，即等于穩(wěn)定期病毒效價與潛伏期病毒效價之比。通過一步生長曲線測定，噬菌體的裂解量一般為幾十到上百個，植物病毒和動物病毒可達數(shù)百乃至上萬個。一步生長曲線的意義1) 可獲知潛

16、伏期；裂解期。2) 裂解量(burst size):每一受感染細胞所產(chǎn)生的子代 virion的平均數(shù)。數(shù)值上等于： 裂解量=穩(wěn)定期噬菌斑數(shù)潛伏期噬菌斑數(shù)（五）溫和噬菌體與溶源性某些噬菌體侵染細菌后，將自身基因組整合到細菌細胞染色體上，隨宿主細胞分裂而同步復(fù)制，并不引起細菌裂解釋放噬菌體，因而被稱作溫和噬菌體（temperate phage）。 這種噬菌體與細菌共存的特性稱為溶原性（lysogeny）， 被侵染的細胞被稱作溶原性細胞或溶原菌（lysogen），整合到細菌細胞染色體上的病毒被稱作前病毒或前噬菌體（prophage）。溫和噬菌體的特點溫和噬菌體：能導(dǎo)致溶源性反應(yīng)的噬菌體。 1）特點:

17、 a. 均為dsDNA。 b. 不同類型的溫和噬菌體與宿主DNA的結(jié)合位點不同。 2）狀態(tài)： a. 游離態(tài) 成熟后被釋放并具有侵染性的游離噬菌體粒子。 b. 整合態(tài) 即整合在宿主基因組上的前噬菌體狀態(tài)。 c. 營養(yǎng)態(tài) 前噬菌體因自發(fā)或經(jīng)外界理化因子誘導(dǎo)后，脫離宿主核基因組而處于積極復(fù)制、合成和裝配的狀態(tài)。噬菌體的溶原和裂解周期細胞反復(fù)分裂溶原途徑 裂解途徑 溶原性是一種比裂解反應(yīng)更有利于噬菌體持續(xù)和傳播的生存方式;可隨之復(fù)制可傳至宿主后代的特性。噬菌體的整合過程溶原性的特點溶原性轉(zhuǎn)變（lysogenic conversion）：溫和噬菌體在菌體細胞內(nèi)以前噬菌體形式存在可導(dǎo)致宿主細胞的表型改變，

18、這種改變與其生命周期是否完成沒有直接關(guān)系，這種改變稱為溶原性轉(zhuǎn)變。 免疫作用：前噬菌體基因還導(dǎo)致溶原性細菌對同類型噬菌體的侵染具有免疫作用，阻止攜帶與溶原性菌體所含的前噬菌體DNA相同的噬菌體的吸附和生物合成。但這種免疫作用不能阻止溶原菌體被別種類型的溫和噬菌體或烈性噬菌體所侵染。前噬菌體基因的表達可以產(chǎn)生一種阻遏蛋白，抑制該病毒自身在菌體內(nèi)的復(fù)制作用。溶原性的特點致病性改變：某些溶原菌體還因所含的前噬菌體的作用導(dǎo)致致病性改變。如白喉棒狀桿菌(Corynebecterium diphtheriae)和肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)一旦被相應(yīng)的溫和噬菌體侵染，含有

19、了編碼毒素基因的前噬菌體后，就從不產(chǎn)生毒素的菌株轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)毒素的菌株，造成侵染組織的損傷，分別引發(fā)白喉和肉毒中毒癥狀。溶原性可以是可逆的：前噬菌體可以自發(fā)地或在外界刺激誘導(dǎo)下被激活，裂解寄主細胞，進入裂解途徑。前噬菌體離開細菌基因組進入裂解途徑的幾率很低（約1/10000-1/100000）。 溶原菌的特點1. 概念：基因組上整合有前噬菌體的宿主菌。 可進行正常生長繁殖，而不被裂解。2. 特點： a.可穩(wěn)定遺傳； b.可誘導(dǎo)裂解:用化學(xué)、物理誘導(dǎo); c. 可自發(fā)裂解:10-210-5； d. 具有“免疫性”； e. 可復(fù)愈：自然遺失前噬菌體; f. 溶源轉(zhuǎn)變：產(chǎn)生新的生理特征。溶原菌的檢出培養(yǎng)U

20、V輻射（誘導(dǎo)裂解）復(fù)制培養(yǎng)（進入裂解周期）離心取上清與敏感菌倒平板菌落周圍出現(xiàn)透明圈即為溶源性細菌溶源菌獨特的噬菌斑形態(tài)形成原因：溶源菌在細胞分裂過程中有極少數(shù)個體會引起自發(fā)裂解，其釋放的噬菌體可不斷侵染溶源菌菌落周圍的指示菌菌苔。溶源菌獨特的噬菌斑形態(tài)三. 植物病毒與動物病毒-病毒粒子形態(tài)螺旋對稱-通過昆蟲、傷口等傳播途徑進入宿主細胞-核酸主要為ssRNA-引起花葉、黃化、從枝、枯斑等癥狀植物病毒的特點植物病毒的形態(tài)植物病毒的形態(tài)植物病毒的裝配TMV的裝配模式TMV的裝配模式動物病毒與人類疾病2008年諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理獎獲得者：楚爾.豪森發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒能導(dǎo)致宮頸癌動物病毒與人類疾病動物病毒

21、的核酸類型腺病毒 CAR蛋白（coxsackie/adenovirus receptor）HIV T-輔助細胞上的CD4流感病毒A型 黏膜細胞上含唾液酸的糖蛋白狂犬病毒 神經(jīng)元上乙酰膽堿 動物病毒與人類疾病動物病毒與人類疾病動植物病毒的復(fù)制周期吸附 (adsorption)侵入 (penetration)脫殼 (uncoating)生物合成 (biosynthesis)裝配和釋放吸附：病毒粒子與敏感細胞表面特異性受體的接觸、結(jié)合的過程?？赡嫖剑?由隨機碰撞、布朗運動、靜電引力引起。不可逆吸附: 病毒粒子與敏感細胞表面特異性的化學(xué)組分形成牢固的結(jié)合，病毒體結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生改變，則吸附病毒不再感染。

22、吸 附左：E.coli phage吸附在E.coli上；右：腺病毒吸附在雞紅細胞上1)內(nèi)吞作用：吞入的病毒在吞噬小泡中，與溶酶體結(jié)合后釋放。2) 受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用：受體與病毒（脊髓灰質(zhì) 炎病毒）多價的相互作用; 引起病毒結(jié)構(gòu)變化，病毒直接穿入，又稱為移位。3) 與細胞膜融合：由包膜病毒具有的細胞融合活 性的包膜糖蛋白介導(dǎo)，核衣殼進入。侵 入1. 動物病毒左：膜融合 （membrane fusion); 右：內(nèi)吞作用 (endocytosis)侵 入2. 植物病毒1) 攜帶病毒的介體在植物上取食 (具吸吮 口器的昆蟲)2) 自然或人為造成植物細胞壁破損 (如 摩擦接種)3) 經(jīng)植物細胞的胞外連

23、絲進入,增殖后經(jīng) 胞間連絲擴散。 多為受體介導(dǎo)，溫度為3538時，在宿主細胞水解酶和熱裂解酶作用下，在細胞質(zhì)內(nèi)完成。有四種情況：1)經(jīng)溶酶體酶的作用脫殼：如包膜病毒和 內(nèi)吞進入的病毒；2)病毒自己合成脫殼酶脫殼：如痘苗病毒；3)對蛋白酶敏感脫殼：殼體變形破損的病毒；4)個別病毒不完全脫殼：如呼腸孤病毒；脫 殼生物合成 利用宿主的RNA聚合酶合成病毒mRNA，再在細胞質(zhì)中進行轉(zhuǎn)譯并合成蛋白質(zhì)。動物病毒的裝配和釋放1）有包膜DNA病毒2）有包膜RNA病毒3）無包膜病毒1）有包膜DNA病毒a.包膜成分同核膜的 DNA復(fù)制在核內(nèi),蛋白質(zhì)在細胞之中合成后入核，裝配好后以出芽的方式再到細胞質(zhì)中，經(jīng)細胞通道

24、或裂解細胞釋放。b.包膜成分同細胞膜的： 出芽或排廢方式釋放動物病毒的裝配和釋放2) 有包膜的RNA病毒裝配釋放均在細胞質(zhì)中同步進行，以出芽方式通過細胞膜，包膜同細胞膜。3) 無包膜的病毒DNA病毒裝配分步進行；RNA病毒殼體的形成與核酸的結(jié)合幾乎同步進行；*二者均由細胞裂解釋放*包膜蛋白插入膜中，細胞膜出芽方式釋放病毒粒子。出芽方式釋放e.g.流感病毒：-ssRNA）病毒粒子的感染與釋放裂解感染持續(xù)感染潛伏感染正常細胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細胞潛伏感染正常細胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細胞動物病毒的感染結(jié)果動物病毒的感染結(jié)果動物病毒的感染結(jié)果HIV感染CD4淋巴細胞HIV的結(jié)構(gòu)及生活史HIV的感染過程HIV的感染過程HIV的發(fā)展過程HIV的發(fā)展過程疫苗昆蟲病毒 昆蟲病毒是引起昆蟲致病和死亡的重要病原體。最早關(guān)于昆蟲病毒的記載是中國，在1149年出版的農(nóng)書中，就記載有家蠶的“高節(jié)”“腳腫”病，這就是現(xiàn)在所稱的核型多角體病毒病。多角體：包裹著病毒粒子、光學(xué)顯微鏡 可見的堿溶性結(jié)晶蛋白質(zhì)。多角體-核型多角體病毒（NPV） 桿狀病毒科。在昆蟲細胞核內(nèi)增殖，具有蛋白質(zhì)包含體的