生物技術新進展和食品安全和質量檢測及其應用

1、生物技術新進展和食品安全和質量檢測及其應用第一節(jié) 新進展概述第二節(jié) 生物傳感器技術與應用第三節(jié) 生物芯片技術與應用第四節(jié) 免疫技術及其應用 第二節(jié) 生物傳感器與食品安全檢測1 生物傳感器的基本概念 生物傳感器通常是指由一種生物敏感部件和轉化器緊密結合,對特定種類化學物質或生物活性物質具有選擇性和可逆響應的分析裝置。 它是發(fā)展生物技術必不可少的一種先進的檢測與監(jiān)控方法,也是對食品質量在分子水平上進行快速和微量分析的方法。生物傳感器工作原理待測物質經擴散作用進入固定生物膜敏感層，經分子識別而發(fā)生生物學作用，產生的信息如光、熱、音等被相應的信號轉換器變?yōu)榭啥亢吞幚淼碾娦盘?，再經二次儀表放大并輸出，

2、以電極測定其電流值或電壓值，從而換算出被測物質的量或濃度。 .1 將化學變化轉變成電信號 如酶傳感器,酶催化特定底物發(fā)生反應,從而使特定生成物的量有所增減。 用能把這類物質的量的改變轉換為電信號的裝置和固定化酶耦合,即組成酶傳感器,常用轉換裝置有氧電極、過氧化氫。 2.2 將熱變化轉換成電信號 固定化的生物材料與相應的被測物作用時常伴有熱的變化。例如大多數(shù)酶反應的熱焓變化量在25-100kJ/mol的范圍.這類生物傳感器的工作原理是把反應的熱效應借熱敏電阻轉換為阻值的變化,后者通過有放大器的電橋輸入到記錄儀中。 . 將光信號轉變?yōu)殡娦盘?例如，過氧化氫酶,能催化過氧化氫/魯米諾體系發(fā)光,因此如

3、設法將過氧化氫酶膜附著在光纖或光敏二極管的前端,再和光電流測定裝置相連,即可測定過氧化氫含量. 還有很多細菌能與特定底物發(fā)生反應,產生熒光.也可以用這種方法測定底物濃度.上述三類傳感器原理的共同點： 都是將分子識別元件中的生物敏感物質與待測物發(fā)生化學反應,將反應后所產生的化學或物理變化再通過信號轉換器轉變?yōu)殡娦盘栠M行測量,這種方式統(tǒng)稱為間接測量方式. .4 直接產生電信號方式這種方式可以使酶反應伴隨的電子轉移、微生物細胞的氧化直接(或通過電子遞體的作用)在電極表面上發(fā)生。根據所得的電流量即可得底物濃度。生物傳感器發(fā)展歷程開端于 20 世紀 60 年代。1962 年克拉克等人報道了用葡萄糖氧化酶

4、與氧電極組合檢測葡萄糖的結果 ,可認為是最早提出了生物傳感器(酶傳感器)的原理。1967年Updike等人實現(xiàn)了酶的固定化技術 ,研制成功酶電極 ,這被認為是世界上第一個生物傳感器。 20世紀70年代中期后,生物傳感器技術的成功主要集中在對生物活性物質的探索、活性物質的固定化技術、生物電信息的轉換以及生物傳感器等研究 ,并獲得了較快的進展 。1977年,鈐木周一等發(fā)表了關于對生化需氧量(BOD)進行快速測定的微生物傳感器的報告 , 正式提出了對生物傳感器的命名。 生物傳感器分類 4.1 根據傳感器輸出信號的產生方式,可分為生物親合型生物傳感器、代謝型或催化型生物傳感器;* 4.2 根據生物傳感

5、器的信號轉換器可分為電化學生物傳感器、半導體生物傳感器、測熱型生物傳感器、測光型生物傳感器、測聲型生物傳感器等 4.3 根據生物傳感器中生物分子識別元件上的敏感材料可分為酶傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器、組織傳感器、基因傳感器、細胞及細胞器傳感器。 每一類名稱又都包含許多種具體的生物傳感器例如，酶電極類:根據所用酶的不同就有幾十種，如葡萄糖電極、尿素電極、尿酸電極、膽固醇電極、乳酸電極、丙酮酸電極等等葡萄糖電極也并非只有一種，有用pH電極或碘離子電極作為轉換器的電位型葡萄糖電極，有用氧電極或過氧化氫電極作為轉換器的電流型葡萄糖電極等實際上還可再細分。 生物親合型傳感器 被測物質與分子識別元件

6、上的敏感物質具有生物親合作用，即二者能特異地相結合，同時引起敏感材料的分子結構和/或固定介質發(fā)生變化。例如：電荷、溫度、光學性質等的變化。反應式可表示為： S（底物）+ R（受體） = SR 代謝型傳感器 底物（被測物）與分子識別元件上的敏感物質相作用并生成產物，信號轉換器將底物的消耗或產物的增加轉變?yōu)檩敵鲂盘枺@類傳感器稱為代謝型傳感器，其反應形式可表示為 S（底物）R（受體）= SR P（生成物） 生物傳感器優(yōu)點：由于具有較高的選擇性，因此不需對被測組分進行分離，即不用對樣品進行預處理。結構簡單，體積小，使用方便，特別是便攜式的生物傳感器，非常有利干食品質量的市場快速評價；可以實現(xiàn)連續(xù)的在

7、線檢測，使食品加工過程的質量控制變得簡便；響應速度快，樣品用量少；與其他大型分析儀器相比，生物傳感器的制作成本低，且可反復使用。6 生物傳感器組成部分一 是生物分子識別元件(感受器),是具有分子識別能力的生物活性物質(如組織切片、細胞、細胞器、細胞膜、酶、抗體、核酸、有機物分子等);二 是信號轉換器(換能器),主要有電化學電極(如電位、電流的測量)、光學檢測元件、熱敏電阻、場效應晶體管、壓電石英晶體及表面等離子共振器件等，當待測物與分子識別元件特異性結合后,所產生的復合物(或光、熱等)通過信號轉換器變?yōu)榭梢暂敵龅碾娦盘?、光信號?從而達到分析檢測的目的。（一）生物識別元件它是酶、抗原(體)、細

8、胞器、組織切片和微生物細胞等生物分子經固定化后形成的一種膜結構，對被測定的物質有選擇性的分子識別能力.（二）換能器它能將識別元件上進行的生化反應中消耗或生成的化學物質，或產生的光或熱等轉換為電信號，在一定條件下，產生的電信號強度和反應中物質的變化量或光、熱等的強度呈現(xiàn)一定的比例關系。換能器(信號轉換器)將分子識別元件進行識別時所產生的化學的或物理的變化轉換成可用信號生物傳感器的信號轉換器已有許多種，其中到目前為止用得最多的且比較成熟的是電化學電極，用它組成的生物傳感器稱為電化學生物傳感器（三）信號處理放大裝置主要負責信號的分析處理和放大輸出。它能將換能器產生的電信號進行處理、放大和輸出。手掌型

9、葡萄糖(glucose)分析儀 6.2 傳感器類型(1) 酶傳感器(EnzymeSensor) 酶的活力單位（酶單位）標準酶單位 國際生物化學協(xié)會酶委員會規(guī)定了酶單位的標準形式為：一個酶單位（U）是在特定的條件下lmin內催化形成1mol產物的酶量（或轉化1mo1底物的酶量） 特定條件一般是指選定的條件，如溫度為25，30，37，最適pH,底物為飽和溶液 酶傳感器它將活性物質酶覆蓋在電極表面,酶與被測的有機物或無機物反應,形成一種能被電極響應的物質。1967年Updick和Hicks將固定化的葡萄糖氧化酶膜結合在氧電極上,做成了第一支葡萄糖電極；此后,這類酶傳感器通常是通過檢測產物H2O2的濃

10、度變化或氧的消耗量來檢測底物。葡萄糖電極缺點:(1)溶解氧的變化可能引起電極響應的波動;(2)由于氧的溶解度有限,當溶解氧貧乏時,響應電流明顯下降而影響檢測限;(3)傳感器響應性能受溶液pH值和溫度影響較大依據信號轉換器的類型,酶傳感器大致可分為酶電極(主要包括離子選擇電極、氣敏電極、氧化還原電極等電化學電極)、酶場效應晶體管傳感器(FET-酶)和酶熱敏電阻傳感器等 (2) 組織傳感器(TissueSensor)組織傳感器是以動植物組織薄片中的生物催化層與基礎敏感膜電極結合而成,該催化層以酶為基礎,基本原理與酶傳感器相同.與酶傳感器比較，組織傳感器具有如下優(yōu)點：1.酶活性較離析酶高.2.酶的穩(wěn)

11、定性增大.3.材料易于獲得.肝組織電極 動物肝組織中含有豐富的H2O2酶，可與氧電極組成測定H2O2及其它過氧化物的組織電極1981年Mascini等研究了數(shù)種哺乳動物和其它動物（鳥、魚、龜）的肝組織電極，翌年，報道了基于牛肝組織的H2O2電極 若向溶液中通以氮氣，以降低氧的溶解度，減少空氣平衡溶液中氧的殘余電流（約10A）至十分之幾微安，檢測下限可降低至1X10-5molL，相關系數(shù) R=0.997(n9) 植物組織膜電極結構圖解 b一果皮, c-中果皮,d-內果皮1-中果皮組織薄片2-固定化骨架3-透氣健, 4-墊圈5-內電解質6-復合PH電極7-塑料電極體二氧化碳氣敏電極結構 (3) 微

12、生物傳感器微生物傳感器分為兩類：一類是利用微生物在同化底物時消耗氧的呼吸作用；另一類是利用不同的微生物含有不同的酶。裝置：由適合的微生物電極與氧電極組成。原理：利用微生物的同化作用耗氧,通過測量氧電極電流的變化量來測量氧氣的減少量,從而達到測量底物濃度的目的.例如,熒光假單胞菌,能同化葡萄糖；蕓苔絲孢酵母可同化乙醇,因此可分別用來制備葡萄糖和乙醇傳感器，這兩種細菌在同化底物時,均消耗溶液中的氧,因此可用氧電極來測定基于不同類型的信號轉換器,常見的微生物傳感器有電化學型、光學型、熱敏電阻型、壓電高頻阻抗型和燃料電池型， (4) 核酸傳感器依據生物體內核苷酸順序相對穩(wěn)定,核苷酸堿基順序互補的原理而

13、設計出核酸探針傳感器,即基因傳感器?；騻鞲衅饕话阌?030個核苷酸的單鏈核酸分子,能夠專一地與特定靶序列進行雜交從而檢測出特定的目標核酸分子。根據換能器種類不同可分為電化學型、光學型、壓電免疫傳感器及表面等離子體共振型基因傳感器，這種傳感器可用于檢測食品中的病原體,為食品中病原體的鑒定提供了新的手段。7 生物傳感器的應用在食品分析中的應用在發(fā)酵工程中的應用在環(huán)境監(jiān)測中的應用在生物醫(yī)學上的應用在軍事上的應用在食品分析的應用食品成分分析食品添加劑的分析農藥和抗生素殘留量分析微生物和生物毒素的檢驗食品鮮度的檢測（一）食品鮮度的測定1、魚鮮度傳感器 魚鮮度傳感器在日本、拿大等國廣泛用于魚類鮮度的測定

14、。魚死后體內ATP經酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸、鮮度可用K值表示：K=肌苷+次黃嘌呤/ (ATP +ADP+AMP+IMP +肌苷+次黃嘌呤+尿酸)當K20時，魚極新鮮，可供生食。K在2040之問為新鮮，必須熟食。K大于40，不新鮮，不宜食用，這與嗅覺檢驗結果相一致。 由于大多數(shù)魚死后520h，ATP，ADP 和AMP已分解盡，超過24h，鮮度主要取決于IMP-肌苷-次黃嘌呤-尿酸。 基于此，Karube等催化將這3個步驟的三種酶（5核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶）固定在氧電極上，制成魚鮮度測定儀。2.肉鮮度傳感器肉類在腐敗過程中會產生各種胺類，故胺類測定也

15、能反映肉類的新鮮程度。用腐胺氧化酶與過氧化氫電極構成多胺生物傳感器，測定肉在貯藏過程中的鮮度，反應時間40s，測定腐胺線性范圍為3 10-4 molL。用單胺氧化酶膜和氧電極組成的酶傳感器測定可以豬肉新鮮度，響應時間為4min，單胺測定線性范圍為502010 -4 molL。3.食品添加劑的分析過量的食品添加劑通常會對人體造成危害，因此對食品中添加劑含量進行分析和監(jiān)測是非常必要的。亞硫酸鹽是常用的食品防腐劑和漂白劑，但是亞硫酸鹽容易引起哮喘，因此美國FDA規(guī)定了其在新鮮水果和蔬菜等食品中的含量不得超過110-6mol/L。Groom等人將亞硫酸氧化酶固定于玻璃電極上，制成了測定亞硫酸鹽的生物傳

16、感器，其靈敏度（檢出下限）達到5nmol/L，線形范圍為0-5mmol/L，電極在3mol/L的硫酸鹽溶液中4oC保存2個月活性不變。天冬酰苯丙氨酸甲酯，又稱甜味素，是人工合成的低熱量甜味劑。Guilbault等將天冬氨酸酶固定于氨電極上，制成生物傳感器，其檢測線性范圍為。4.污染微生物的檢測1）腐敗菌的檢測Matssunage等人開發(fā)出一種基于微生物在代謝過程中能產生電子，電子直接在陽極上放電產生電流，通過測定電流大小從而測定微生物濃度的傳感器。用該傳感器能很好地檢測釀酒酵母和乳酸菌等微生物的數(shù)量2 病原菌的檢測常見的污染食品的病原菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、產氣莢膜

17、梭菌和蠟樣芽孢桿菌等。采用生物傳感器則能迅速地測定它們的數(shù)量。用來測定病原菌的生物傳感器主要是光纖生物傳感器、免疫生物傳感器和DNA生物傳感器。發(fā)酵罐主機計算機 7.2 在發(fā)酵工業(yè)中的應用-為發(fā)酵自動控制提供了新的基礎平臺1)、發(fā)酵中葡萄糖測定 過去用操作繁瑣時間長的還原糖方法只能近似地估計葡萄糖的變化。 現(xiàn)在提供了快速而準確的固定化酶的測定方法，發(fā)酵中可根據糖消耗確定微生物的生長速率，觀察是否染菌，隨時與產物的產生一起估算轉化率，確定補料效果和及時判斷發(fā)酵結束的時間。 發(fā)酵過程或設備異?，F(xiàn)象通過葡萄糖分析得到及時預報。 2)、谷氨酸發(fā)酵液的分析在谷氨酸發(fā)酵中，隨時跟蹤目標產物的產生?？焖佾@得

18、主控參數(shù)的變化信息，使時間縮短了幾十倍。在發(fā)酵前期及時知道產酸出現(xiàn)時間在發(fā)酵中期可根據谷氨酸產生速率，預知最終的產量，并獲得補氨是否均勻的信息在發(fā)酵后期，可根據谷氨酸產生速率變慢情況確定放罐時間和今后配料的調整在我國發(fā)酵工廠普及應用的谷氨酸-葡萄糖雙功能分析儀工廠發(fā)酵車間化驗員正在分析樣品3、乳酸傳感器在發(fā)酵上的應用 乳酸測定是生物傳感器出現(xiàn)后新增加的控制參數(shù)。實踐中發(fā)現(xiàn)它的控制是獲得發(fā)酵高產的關鍵。 乳酸是需氧發(fā)酵產物轉化過程中的中間產物，是過程控制的敏感參數(shù)，與生物素的加入量、補糖、活菌數(shù)、菌活力、空氣補給等控制直接相關。 發(fā)酵旺盛期，乳酸必然產生，適度的乳酸濃度是高產罐的重要指示。此時單純地通過通風是達不到乳酸下降的目的，反而引起能源的浪費及減產。發(fā)酵后期、放罐前應控制乳酸下降，才能達到高產。乳酸傳感器的應用現(xiàn)狀是體育上耐力項目科學訓練的常用設備已在抗疲勞保健食品檢測中普及應用，許多省級衛(wèi)生防疫站成功地用這項新技術實現(xiàn)了在同一小實驗動物體內多次采血檢測，簡化了