動物細胞培養(yǎng)技術小鼠脾臟細胞(共16頁)

1、 山東大學實驗報告 2014/11/4姓名：XX 系年級：2013級XX班 學號：201300XXXXXXX實驗題目: 動物細胞培養(yǎng) 同組者: XXXXX動物(dngw)細胞培養(yǎng)技術【實驗(shyn)目的】學習(xux)掌握細胞培養(yǎng)的基本原理以及具體方法，并對小鼠脾細胞進行原代培養(yǎng)；掌握無菌操作的具體過程及無菌操作臺的使用；學習掌握染色法鑒別細胞的生死狀態(tài)的原理及方法；學習使用血球計數(shù)板對細胞總數(shù)及活細胞數(shù)進行計數(shù)，計算細胞存活率；【實驗原理】（一）. 動物細胞培養(yǎng)技術動物細胞培養(yǎng)技術是指從動物體內取出組織或細胞，在體外模擬動物體內的生理壞境，在無菌，適當溫度和一定的營養(yǎng)條件下，使之生存，生長

2、和繁殖，并維持其結構和功能的方法。細胞培養(yǎng)的意義: = 1 * GB2 .具有其他生物技術無可比擬的優(yōu)點； = 2 * GB2 .培養(yǎng)條件易改變和控制，便于單因子分析； = 3 * GB2 .便于人們直接對細胞內結構、細胞生長及發(fā)育等過程的觀察； = 4 * GB2 .在生物學的各個領域（如分子生物學、細胞生物學、遺傳學、免疫學、腫瘤學及病毒學等）已被廣泛應用細胞培養(yǎng)的局限性：（1）.在脫離機體復雜環(huán)境下，細胞培養(yǎng)條件與軀體環(huán)境有一定距離；(2).觀察到的結果有時難以正確反映機體內的狀況；(3).細胞培養(yǎng)得到的產(chǎn)物少。培養(yǎng)細胞的生存條件有水的質量、無菌環(huán)境，最適溫度、滲透壓、氣體條件、最適PH

3、、營養(yǎng)條件和培養(yǎng)基質等。細胞培養(yǎng)的方法：1. 原代培養(yǎng)：直接從生物體內獲取細胞，組織或器官，進行體外培養(yǎng)直至第一次傳代為止。2. 傳代培養(yǎng)：當培養(yǎng)的細胞增殖達到一定密度之后，則需要再做培養(yǎng)，即將培養(yǎng)的細胞分散后，從一個容器以1:2或其他比例轉移到另一個容器中的擴大培養(yǎng)。原代細胞培養(yǎng)的方法有：單層細胞培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法細胞傳代培養(yǎng)包括：貼附生長細胞的傳代：洗細胞酶消化接種觀察 懸浮生長細胞的傳代：A.直接傳代 B.離心傳代單層培養(yǎng)細胞的生長過程分為：游離期，吸附期，繁殖期，維持期，衰退期培養(yǎng)細胞的形態(tài)分型：A. 貼附型 B.懸浮型（二）. 細胞死活鑒定細胞生死狀態(tài)的鑒別方法主要是化學染色法和熒

4、光染色法?；罴毎退劳黾毎谏砑寄芎托再|上主要存在一下差異： = 1 * GB3 細胞膜通透性的差異(chy)：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許(ynx)物質選擇性地通過；而細胞死后，細胞膜受損，其通透性增加。基于此，發(fā)展出了以臺盼藍、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、甲基藍以及熒光染料碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述染料能使死亡細胞著色，而活細胞不被著色。此外，應用植物質壁分離的性質也可鑒定植物細胞的生死狀態(tài)。活細胞的原生質具有選擇透過性，死細胞因其原生質的選擇透過(tu u)性已遭破壞，故與高滲透壓溶液接觸時不產(chǎn)生質壁分離。 = 2 * GB3 代謝

5、上的差異：活細胞中新陳代謝作用強，細胞內的酶具有較強的活性和還原能力。基于此，發(fā)展處了以熒光素二乙酸酯（FDA）、熒光素二丙酸酯、熒光素二丁酸酯或熒光素二苯甲酰酯等酯化的熒光素鑒別細胞生死狀態(tài)的方法，上述酯化的熒光素親脂性提高，容易被細胞吸收進入，活細胞內的酯酶具有較強的活性，可將酯化的熒光素分解而釋放出能發(fā)熒光的熒光素，該物質不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞膜內，熒光顯微鏡下顯示有明亮的綠色或黃綠色熒光；而死亡細胞內的酯酶因失去活性，不能分解酯化的熒光素，熒光顯微鏡下顯示不發(fā)光。另外，可用亞甲基藍為染料鑒定酵母細胞的生死狀態(tài)。亞甲基藍是一無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色?；罴毎蚓哂休^

6、強的還原能力，能使亞甲藍從藍色的氧化型變成無色的還原型，故活的酵母細胞在用亞甲基藍染色后顯示無色；死亡酵母細胞或代謝緩慢的衰老酵母細胞，因無還原能力或還原能力極弱，使亞甲藍仍處于氧化態(tài)，故呈現(xiàn)藍色或淡藍色。（三）. 血球計數(shù)板的使用血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個方格網(wǎng)(如圖3)。每個方格網(wǎng)共分9大格，其中間的一大格(又稱為計數(shù)室)常被用作微生物的計數(shù)。計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方

7、格。但是不管計數(shù)室是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即每個大方格都由400個小方格組成(圖4)。每個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，每個小方格的面積為1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為l4000mm3。使用血球計數(shù)板直接計數(shù)時，先要測定每個小方格(或中方格)中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數(shù)量。圖 SEQ 圖表(tbio) * ARABIC 1 血球(xuqi)計數(shù)板的構造（a、平面圖；b、側面圖）圖 SEQ 圖表 * ARABIC 2 血球計

8、數(shù)板網(wǎng)格的分區(qū)和分格【實驗(shyn)器材】1.超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、眼科剪、眼科鑷、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、微量加樣器、吸管、酒精燈；小鼠、培養(yǎng)基2.血球計數(shù)板、蓋玻片、滴管、顯微鏡；培養(yǎng)的小鼠脾臟細胞、臺盼藍、伊紅【實驗步驟】小鼠脾臟細胞的培養(yǎng)1）. 取材：取小白鼠一只，采用斷頭法處死，清水洗凈小白鼠并浸于75%酒精中滅菌3min，取出轉入超凈工作臺內的解剖盤內，無菌操作打開腹腔，取出脾臟，去除周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用PBS液自上而下沖洗1-2次，轉入無菌玻璃培養(yǎng)皿中，待用。2）. 分離(fnl)脾細胞：用滴管先向上述無菌玻璃培養(yǎng)皿中滴入PBS液30滴，再用L形針頭注射器在

9、皿內吸取PBS液0.2ml，然后將其沿脾臟長軸方向注射入脾內，用針尖在脾臟上扎眼，并用(bn yn)L形針頭輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的PBS液沖洗脾臟并吹散掛出的脾細胞，稍微傾斜并靜置1-2min，吸取上述靜置后的脾細胞懸液上清部分放入Eppendorf管，以3000轉/分離心1-2min。3）.培養(yǎng)(piyng)脾細胞：從超凈工作臺中區(qū)塑料培養(yǎng)皿一個，用“槍（1ml）”加入細胞培養(yǎng)液2ml，并在皿上做記號，待用。取上述離心后的Eppendorf管，在超凈工作臺內打開棄去上清液，用“槍（200l）”吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul，加入棄去上清液的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管

10、底的脾細胞，然后吸取200ul脾細胞懸液接種于上述塑料培養(yǎng)皿中，混勻，然后放入37，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（二）. 臺盼藍法堅定細胞的死活試劑配制：用生理鹽水配置0.4%臺盼藍染液，備用。細胞懸液制備：將生長有貼壁型細胞的培養(yǎng)瓶（皿）中的培養(yǎng)液倒入干凈試管中，向培養(yǎng)瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液1-2ml，靜置3-5min，待見到細胞變圓，彼此不連接為止，棄去混合消化液并將上述試管中的培養(yǎng)液倒回培養(yǎng)瓶中，用滴管輕輕吹打細胞，制成細胞懸液。染色制片：取0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合，2min后制成臨時裝片，鏡檢。染色

11、結果：死細胞染成藍色，活細胞不著色。（三）. 血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)染色計數(shù)：取上述步驟二所制備0.5ml細胞懸液放于干凈的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少許染色后的細胞懸液于放有蓋片的血球計數(shù)板的斜面上，使懸液自然充滿計數(shù)板小室（注意：不要使小室內有氣泡產(chǎn)生，否則要重新滴加；在普通光鏡10物鏡下計數(shù)四個大格內的細胞數(shù)，壓線者數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右）。根據(jù)染色(rns)結果計算活細胞率：依據(jù)死細胞(xbo)染成藍色、活細胞不著色的原則計數(shù)死細胞數(shù)和細胞總數(shù)，以如下公式計算細胞存活率：每毫升液體(yt)中細胞的數(shù)=每個大方格中的細胞數(shù)量*10000*稀釋倍數(shù)【實驗

12、結果】從培養(yǎng)箱拿出的培養(yǎng)基在倒置(dozh)顯微鏡下可以清晰的看到培養(yǎng)的細胞，細胞呈圓形，形狀規(guī)則(guz)，聚集在一起，有立體感。10倍物鏡(wjng)40倍物鏡(wjng)經(jīng)過臺盼藍染色(rns)后，死細胞的細胞膜因為沒有(mi yu)了選擇透過性，被染成藍色 經(jīng)過活細胞染色后，活細胞的細胞膜具有選擇透過性，染料不能進入細胞，所以細胞未被染成藍色左上右上中間左下右下活細胞數(shù)53566死細胞數(shù)2626282529細胞總數(shù)3129333135細胞存活率=（5+3+5+6+6）/(31+29+33+31+35)*100%=15.72%每毫升液體(yt)中細胞的數(shù)：（31+29+33+31+35）

13、*5*10000=7950000【實驗結果(ji gu)分析】培養(yǎng)基剛剛拿出來的時候(sh hou)是無色的，過了一段時間后變成粉紅色對于小鼠脾臟細胞的培養(yǎng)結果（1）.若所得的培養(yǎng)基呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，則說明有雜菌的侵入。（2）. 若所得培養(yǎng)基沒有明顯的顏色變化，則很有可能培養(yǎng)基中未接入細胞或接入的細胞很少，細胞未生長繁殖。（3）。 若所得的培養(yǎng)基透明度高，顏色微黃則證明細胞培養(yǎng)成功。生長狀態(tài)良好的細胞，細胞膜完整清晰，細胞質透明，顆粒狀物質少細胞核區(qū)域明顯。而死細胞含有空泡，顆粒狀物質多，細胞透明度下降，沒有立體感，核區(qū)域模糊，體積更大活細胞邊緣較明顯，由于細胞膜仍然具有選擇透過性，染料無法通過細

14、胞膜，所以呈現(xiàn)透明無色死細胞因為細胞膜已經(jīng)失去選擇透過性，染料進入細胞內，將細胞染色，且死細胞的邊緣不明顯。本次實驗，我們組所得的細胞存活率較低，分析原因可能是：無菌操作時實驗操作不規(guī)范，導致細胞被破壞，影響了實驗結果，也有可能是因為染色時間過長，細胞膜的通透性遭到破壞，部分細胞死亡。【實驗注意事項反思】對小鼠進行消毒時，一定要嚴格進行，防止沾染雜菌，手也必須嚴格消毒。嚴格進行無菌操作，防止雜菌污染，影響實驗結果。動物細胞培養(yǎng)使用的所有器皿、用具、溶液等必須經(jīng)過嚴格消毒或除菌處理，才能進超凈工作臺中使用，整個實驗過程都要有無菌操作的概念，操作在酒精燈附近進行，避免細胞被污染。取小鼠脾臟細胞時要

15、小心謹慎，既不能太用力將脾扎爛，也不能扎的太輕因為得到的脾細胞太少，起初我們組扎的很輕得到的細胞很少，給老師看過之后，重新扎脾臟，得到了較多的細胞。在超凈工作臺進行操作時，實驗剛開始時自己不留心將手臂伸進很大一部分，在老師訓導之后才知道只需將手伸進很小一部分，不能將整個手臂伸進去以免造成污染，帶入雜菌.注意染色的時間，時間太長可能會導致細胞膜的通透性遭到破壞，損壞細胞。在用血球計數(shù)板技術時，計上不計下，計左不計右。滴加細胞懸液時，應用滴管將懸液來回吹吸使攪拌均勻，以此避免計數(shù)時因為局部濃度太高導致多個細胞連結在一起，影響結果的觀察。此外，計數(shù)時要十分謹慎，因為是要在計數(shù)的結果上乘以10000，

16、即使是很小的偏差也會導致實驗結果的大不相同。計數(shù)時對于連在一起的細胞要格外注意做實驗必須嚴格按照實驗室的規(guī)定，注意無菌操作環(huán)境，按照老師的指令操作，這樣才能使實驗更精確的完成，取得較好的結果。此外，對于實驗某些時間的精確把握也非常重要，時間的長短對于實驗結果可能有較大的影響，日后一定要注意這一方面?！咀鳂I(yè)(zuy)】抑制腫瘤細胞增殖(zngzh)藥物的篩選方法（1）. 應用(yngyng)結晶紫染色測定法篩選抗腫瘤藥物結晶紫染色測定法是一種單層細胞培養(yǎng)的體外藥物敏感性測定方法，其原理是結晶紫染色可通過細胞的特定攝生法而選擇性的被細胞吸收，死亡的細胞幾乎不吸收結晶紫染料，而被核吸收的結晶紫染料又

17、可被有機溶媒提取，通過測定提取液的光密度值，就可測定活細胞的數(shù)量。近幾年經(jīng)過不斷改進，結晶紫染色法已能適用于大量抗腫瘤藥物的藥敏測定，具有靈敏度高，重現(xiàn)性好的特點。（2） 應用噬菌體篩選已確證多種病毒能引起動物腫瘤，噬菌體是細菌的病毒，與腫瘤病毒相似，噬菌體的DNA也可整合到細菌染色體上，隨細菌DNA復制分裂并遺傳至子代細菌，不引起細菌裂解但可引起細菌部分生物學性狀發(fā)生改變。有些物質可使前噬菌體DNA從溶原性細菌染色體上脫落，復制合成并釋放完整的噬菌體，可使敏感的細菌感染裂解誘導作用。有些有誘導作用的物質常同時具有抗腫瘤的作用。（3） 細胞水平篩選抗腫瘤藥物細胞生物學、分子藥理學、分子生物學、

18、生物化學等學科的發(fā)展為藥物篩選提供了新的方向。細胞水平的藥物篩選模型具有材料用量少、藥物作用機制比較明確和大規(guī)模篩選等優(yōu)點。目前,在細胞水平上對抗腫瘤天然藥物的篩選主要是采用選取幾種腫瘤細胞系,以培養(yǎng)細胞為實驗模型,用結晶紫染色測定法、四甲基噻唑藍(MTT)法、SRB法等檢測天然藥物及其提取物或單體的體外抗腫瘤作用。溫斌等在研究腹腔注射灰樹花提取成分對小鼠免疫功能的影響時,采用乳酸脫氫酶法、結晶紫染色法、MTT生物活性測定法等對小鼠脾自然殺傷(NK)細胞和腹腔巨噬細胞進行檢測,結果表明灰樹花乙醇沉淀物(ET2Pre)和RNA提取物顯著增高了小鼠脾NK細胞殺傷活性、巨噬細胞吞噬功能及腫瘤壞死因子

19、(TNF)2、白細胞介素(IL)21的產(chǎn)生水平。趙春玲等采用結晶紫染色法和MTT比色法測定了白眉蝮蛇去整合素(rAdinbitor)對人肝癌細胞系SMMC27721細胞向纖連蛋白(FN)黏附的影響,以及對已黏附于FN上的SMMC27721細胞的影響。實驗證明,rAdinbitor能夠劑量依賴性地抑制SMMC27721細胞在FN上的黏附,促使已黏附的SMMC27721細胞脫落;并且能夠劑量依賴性地抑制SMMC27721細胞的增殖并且誘導其調亡。（4）端粒酶活性為作用靶點篩選抗腫瘤的藥物端粒是染色體特殊結構，起著保護染色體的完整和穩(wěn)定性的作用，端粒酶是一種核糖核蛋白反轉錄酶，由RNA和蛋白質組成，

20、可以以自身的RNA為模板合成端粒末端。已發(fā)現(xiàn)在正常的體細胞和良性腫瘤組織中端粒酶的活性是陰性，而在人體惡性腫瘤組織和人的腫瘤細胞株中都表達了很高的活性。因此，認為端粒酶與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系，有可能成為腫瘤治療的靶點（5）以DNA拓撲異構酶為靶點篩選天然(tinrn)抗腫瘤藥物DNA拓撲異構酶(DNAtopoisomerases)通過DNA鏈的切割、轉移(zhuny)和再連接來改變DNA的拓撲結構。DNA拓撲異構酶在細胞代謝過程中起著極其重要的作用,如DNA復制、基因轉錄、DNA重組和有絲分裂等?？拱┧幬锵矘鋲A(camptothecin)及其衍生物的作用靶點是真核生物DNA拓撲異構酶

21、,吖啶類化合物、鬼臼毒素類化合物、異黃酮類化合物、多柔比星(doxorubicin)等則作用于真核生物DNA拓撲異構酶。這些藥物可通過(tnggu)DNA拓撲異構酶、引起DNA雙螺旋的一條或兩條鏈的斷裂從而導致腫瘤細胞的死亡。李運曼等通過DNA解螺旋實驗評價紫草素對拓撲異構酶催化活性的抑制作用。結果顯示,紫草素可顯著抑制拓撲異構酶的解螺旋活性,并且能夠抑制人白血病K562細胞的增殖。湯濤等通過實驗首次揭示了鴉膽子油乳能夠特異性地抑制拓撲異構酶的活力,而對拓撲異構酶沒有影響,對DNA也沒有直接作用。這些現(xiàn)象揭示拓撲異構酶是鴉膽子油乳細胞內作用靶點之一(6）作用微管蛋白的天然抗腫瘤藥物的篩選方法微

22、管(microtubule)是由微管蛋白異二聚體聚合而成的管狀聚合物,是真核細胞骨架的重要組成部分。微管參與許多細胞功能,包括維持細胞形態(tài)、細胞內運輸、鞭毛和纖毛的運動、染色體運動和細胞分裂等。無論是促進微管蛋白聚合、穩(wěn)定已形成的微管類藥物,還是以抑制微管蛋白聚合類藥物都通過影響腫瘤細胞的有絲分裂過程,使其生長受到抑制。因此,微管已成為腫瘤的臨床治療的有效靶點。KLEIN等用紫杉醇和discodermolide(1990年從海綿動物Discodermiadissoluta中分離得到的多羥基內酯化合物)分別作用A549肺癌細胞,結果顯示它們均能迅速導致有絲分裂的異常。進一步的研究發(fā)現(xiàn)discod

23、ermolide和紫杉醇聯(lián)合作用具有明顯的協(xié)同作用。1999年MOOBERRY等從海綿Cacospongiamycofijiensis,Fasciospongiarimosa和Hyattellasp.中均發(fā)現(xiàn)了新型促進微管穩(wěn)定化合物laulimalide和isolaulimalide。Laulimalide可以有效促進微管蛋白的聚合,并且與紫杉醇誘導形成的微管蛋白聚合體相似,但促聚合作用低于紫杉醇。用laulimatide處理A210細胞可導致劑量依賴性細胞微管網(wǎng)的重組和異常紡錘體的形成,并能誘導染色體的卷繞和多核仁的形成。（7）應用調節(jié)細胞信號傳導通路篩選方法近年來,部分抗腫瘤藥物的研發(fā)已從

24、傳統(tǒng)的細胞毒藥物轉移到針對腫瘤細胞內信號傳導通路的新型抗腫瘤藥物。正常細胞和腫瘤細胞在多種信號傳導通路的關鍵組分間存在巨大差異,因此靶向這些組分的抗腫瘤藥物具有高選擇性、高效、低毒的特征。目前,藥物干預腫瘤細胞信號通路主要是通過環(huán)腺嘌呤核苷酸2蛋白激酶A通路、酶聯(lián)受體信號通路、磷脂酰肌醇信號通路、鈣和鈣調蛋白通路等幾個通路實現(xiàn)。SAMEL等報道,芥麥(buckwheat)提取物中一種(y zhn)類似于金絲桃蒽酮的物質能夠抑制各種蛋白激酶的活性,抑制內皮生長因子和Ins的受體酪氨酸激酶和蘇氨酸激酶的活性。李寶元等在觀察中藥白龍片對人胃癌MGC8023細胞不同周期時相癌基因c2H2ras、c2m

25、yc和抑癌基因Rb、P53、P21表達的影響時,發(fā)現(xiàn)PKC2基因表達抑制與c2H2ras、c2myc的表達抑制相似,表明兩者之間存在因果關系。（8）應用腫瘤新生血管(xugun)生成抑制的篩選方法腫瘤的新生血管是實體瘤生長、浸潤和轉移的一個重要因素,它為腫瘤的生長提供必需的營養(yǎng)和氧氣。在其生成過程中血管內皮生長因子(VEGF)以及酪氨酸激酶受體(VEGFR)具有極其重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)有許多天然藥物(yow)及其有效成分可以通過多種途徑來抑制腫瘤新生血管的生成。潘子民等發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3經(jīng)處理后,荷瘤SCD小鼠無腹腔積液形成,腹腔中腫塊散播較少。實驗組腫瘤組織中VEGFmRNA的表達量、VE

26、GF蛋白表達量和MVD顯著低于對照組,從而認為Rg3通過下調腫瘤組織中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表達量來阻滯腫瘤血管的生成,抑制腫瘤的轉移。姜曉玲等通過比較實驗發(fā)現(xiàn),10gmL薏苡仁注射液處理后,極少有新生血管生成,血管生長也很快進入衰退期。因此認為薏苡仁注射液對腫瘤血管生成有顯著抑制作用。（9）天然藥物誘導腫瘤細胞調亡的篩選細胞調亡(apoptosis)是基因調控下的細胞主動死亡,這一過程又稱程序化細胞死亡(programmedcelldeath)。細胞調亡伴隨著細胞質濃縮,細胞核崩裂,微粒消失,細胞膜皺縮,染色質濃縮繼而解體,DNA裂成180bp的倍增片段,最后形成調亡小體。細胞增殖

27、、分化和調亡調節(jié)系統(tǒng)的失常將導致細胞惡性生長分裂。研究發(fā)現(xiàn),許多抗腫瘤藥物均通過抑制腫瘤細胞增殖,誘導腫瘤細胞調亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。賈彩云等研究表明,蟾酥靈處理過的K562細胞其生長受到明顯抑制,形態(tài)學呈現(xiàn)出典型的調亡特征性改變,即核染色質凝集、碎裂、延核周邊分布,胞膜內陷將變性的細胞內容物包裹成調亡小體,形成DNA電泳的梯狀帶。因此蟾酥靈能有效誘導白血病K562細胞調亡。陳潔等通過實驗證明竹紅菌甲素(hypocrellinA,HA)能夠誘導人黑色素瘤(A23752S2)細胞產(chǎn)生調亡,并誘導細胞周期停滯在S期。還能使細胞周期蛋白CyclinB1的mRNA表達增加。（10）天然藥物誘導細胞分化的

28、篩選惡性腫瘤細胞在形態(tài)、功能等方面都類似于未分化的胚胎細胞。誘導分化治療是指通過藥物誘導,使腫瘤細胞向正常細胞轉化,同時對正常細胞無殺傷作用,并且很少有骨髓抑制等不良反應。誘導腫瘤細胞分化及逆轉是當前腫瘤分子生物學中一個重要的研究領域。錢軍等在研究欖香烯乳對體外培養(yǎng)人肺癌細胞株超微結構的影響時發(fā)現(xiàn),實驗組癌細胞給藥后出現(xiàn)表面微絨毛減少,細胞核和細胞質比例下降,核周邊光滑,切跡淺,核仁常為單個,常染色質減少,異染色質增多等現(xiàn)象;而陽性對照組癌細胞除破碎壞死外,仍顯示較高的惡性行為。上述表現(xiàn)提示欖香烯乳在30gmL的濃度下對體外肺癌細胞具有一定的誘導作用。CHEN等報道茯苓中的多糖片段可使66.6

29、%人淋巴瘤U937細胞和49.4%人早幼粒白血病HL260細胞誘導分化成為成熟的單核細胞和巨噬細胞,使其表現(xiàn)出正常的生理功能并且表達標志性表面抗原CD11b、CD68和CD14,同時又檢測到IFN2和TNF2水平升高。（9）結束語隨著分子生物學和分子腫瘤學的發(fā)展,人們對腫瘤細胞惡化過程中許多新靶點有了進一步的了解,并且針對這些靶點研究和開發(fā)了許多新的天然抗腫瘤藥物。近年來,許多天然抗腫瘤藥物已經(jīng)開始采用較原來更加理想的藥物篩選系統(tǒng),而且針對作用機制(jzh)的藥物篩選和藥物設計在一定程度上得到了發(fā)展。由于腫瘤本身是一種多基因的疾病,目前腫瘤的治療仍是一個難題,因此尚需要科研工作者不斷地努力來發(fā)

30、現(xiàn)和設計出更加有效低毒、高選擇性的抗腫瘤藥物。誘導(yudo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡的藥物篩選方法：可以(ky)利用流式細胞儀測定細胞光散射可對凋亡細胞進行分析，凋亡早期細胞因體積減小，胞漿及染色質固縮，F(xiàn)SC變小，SSC增大，凋亡晚期細胞FSC，SSC均變?。挥昧魇郊毎麅x也可以根據(jù)DNA含量不同，從細胞群體中鑒別出凋亡細胞；另外，細胞凋亡受基因調控，有賴于某些蛋白質的合成，用流式細胞儀可同時檢測出凋亡細胞的FSC/SSC及DNA/蛋白質，進行多參數(shù)分析以研究不同的凋亡誘導作用機制?；熓悄[瘤治療的一種重要方法，新的抗腫瘤藥物也不斷地涌現(xiàn)。國內在上個世紀90年代上市的抗癌藥物中化學合成藥米托蒽醌、羥

31、基脲和順鉑等少數(shù)幾種抗癌藥物，通過與DNA分子結合抑制核酸合成引起細胞死亡，這類藥物稱之為細胞周期非特異性藥物。本研究選用米托蒽醌、順鉑、羥基喜樹堿、 高三尖杉酯堿誘導Jurkat細胞凋亡，并通過Annexin V /PI法檢測細胞凋亡及細胞死亡比例，分析不同作用時間以及不同藥物濃度對Jurkat細胞凋亡的影響。材料和方法材料Jurkat細胞系由本實驗室保存。順鉑（CDDP）為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品、羥基喜樹堿（HCPT）為黃石飛云制藥廠產(chǎn)品、 高三尖杉酯堿（HHT）為杭州民生藥業(yè)公司產(chǎn)品、米托蒽醌（MIT）為浙江瑞新藥業(yè)公司產(chǎn)品；RPMI 1640為Invitrgen產(chǎn)品；Annexin V

32、FITC/PI試劑盒購自晶美生物公司；貝克曼流式細胞分析儀 Elite EXP。誘導Jurkat細胞凋亡Jurkat細胞在5% CO2孵箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期，鏡下計數(shù)為1106/ml，加入24孔板，每孔1 ml細胞懸液。用無血清細胞懸液將順鉑、 羥基喜樹堿、高三尖杉酯堿和米托蒽醌藥物配制成1 mg/ml溶液；每組藥物分別設4個濃度：12.5、25、50、100 g/ml；分別加入24孔培養(yǎng)板，作3個復孔。置于5 CO2孵箱培養(yǎng)。Annexin V/PI流式雙參數(shù)(cnsh)分析1-3分別于加入藥物作用2、4和8小時，吸取培養(yǎng)細胞懸液，用4預冷的PBS洗細胞2次，用250 l結合緩沖液重懸細胞，使

33、其濃度為1106/ml；取100 l細胞懸液，加5 lAnnexin V/FITC和10 l 的碘化丙錠；混勻后室溫避光(b un)孵育15分鐘；用PBS洗滌2次，進行流式細胞儀（FACS）分析。Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)進行調試，以此條件進行細胞凋亡和細胞壞死率檢測。圖1-5橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示細胞數(shù)，圖中兩個峰中的左邊峰表示陰性峰，右峰表示凋亡峰，右峰曲線下面積越大凋亡就越多。根據(jù)所測數(shù)據(jù)計算細胞凋亡率和繼發(fā)性壞死率。統(tǒng)計學分析(fnx)各組細胞凋亡率均取3個樣本的均值，以XSD表示，多個均數(shù)的兩兩比較采用中國醫(yī)學百科全書醫(yī)學統(tǒng)計學統(tǒng)計軟件包 PEMS 3.1軟件進

34、行檢驗。1細胞的凍存目前，細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度增高，pH值改變，部分蛋白質由于上述原因而變性，引起細胞內部空間結構紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內結構成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內容物丟失。如果細胞內冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構型發(fā)生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍

35、技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外，減少胞內形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷主要操作步驟為：（1）選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個 HYPERLINK /yp/product-list-984.html t _blank 培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉，用0.25% 胰 HYPERLINK /yp/product-list-470.html t _blank 蛋白酶消化。適時

36、去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液。用 HYPERLINK /yp/product-list-963.html t _blank 吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于 HYPERLINK /yp/product-list-954.html t _blank 離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。（2）去上清液，加入(jir)含20%小牛 HYPERLINK /yp/product-list-636.html t _blank 血清(xuqng)的完全(wnqun)培養(yǎng)基，于4預冷15分鐘后，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，細胞濃度為31061107/mL之間。（3）將上述細胞分裝于安瓿或專用冷凍塑料管中，安瓿裝11.5mL在火焰噴燈上封口，封口處要完全封閉，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊，并標記好細胞名稱和凍存日期，同時作好登記（日期、細胞種類及代次、凍存支數(shù)）。（4）將裝好細胞的安瓿或凍存管裝入沙布袋內；置于 HYPERLINK /yp/product-list-275.html t _blank 液氮容器頸口處存放過夜，次日轉入液氮中。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將安瓿置入