DNA復(fù)制、修復(fù)與重組-PPT課件

1、分子生物學(xué)第三章 DNA復(fù)制、修復(fù)與重組分子生物學(xué)遺傳物質(zhì)的分子機(jī)制分子生物學(xué)的核心Watson & Crick: 一種遺傳物質(zhì)，必須能行使兩種 功能，即自我復(fù)制和對(duì)細(xì)胞的高 度特異性的影響遺傳物質(zhì)的基本屬性：基因的自我復(fù)制 控制性狀的表達(dá)分子生物學(xué)DNA的生物學(xué)功能儲(chǔ)存遺傳信息復(fù)制遺傳信息表達(dá)遺傳信息產(chǎn)生可遺傳的變異 分子生物學(xué)親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以 每單鏈 DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補(bǔ) 配對(duì)的游離的dNTP, 合成出兩條與親代DNA分子完 全相同的子代DNA分子的過程。 Replicon; Replisome; A unit of the genome

2、 in which DNA contain a region from origin to terminator The multi protein (30) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA 第一節(jié) DNA復(fù)制分子生物學(xué)DNA replication at phase S of cell cycle E.coli 37 0.5 h105 bp/min S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs500-5000 bp/min G112hs

3、分子生物學(xué) 復(fù)制機(jī)理的復(fù)雜性 D.S. DNAS.S. DNA 能量的供求構(gòu)型的變化超螺旋線狀，開環(huán)狀多種酶類的互作ReplisomeDNA復(fù)制起始控制機(jī)理知之甚少復(fù)制的準(zhǔn)確性（修復(fù)，校正）研究試材的特殊性（溫度敏感型ts，突變抑制體系Su）DNA復(fù)制速度(E.coli 105 bp/min ，高速解旋 112 km/h)缺乏統(tǒng)一的模式(D.S. DNA, S.S. DNA, Linear DNA.) 分子生物學(xué)1. 復(fù)制起點(diǎn)與方向（replication origin & direction ） 分子生物學(xué) rich AT & palindrome Enzymes binding site

4、300 bp in replication origin of ProkaryoteAT rich復(fù)制起點(diǎn)的特征分子生物學(xué) “呼吸現(xiàn)象” DNA復(fù)制原點(diǎn)處氫鍵迅速斷裂與再生， 導(dǎo)致兩條DNA鏈不斷解鏈與聚合， 形成瞬間的單泡狀結(jié)構(gòu)的過程。 在富含AT的區(qū)域內(nèi)尤為明顯分子生物學(xué) 復(fù)制的多模式 單起點(diǎn)、單方向多起點(diǎn)、單方向單起點(diǎn)、雙方向多起點(diǎn)、雙方向分子生物學(xué) 子鏈DNA延伸方向 DNA polymerase reacts on the 3 end only5 OHT C AT C A C 5 OH 3New DNA elongation from 5 to 3 direction ppp OH

5、C+ ppi 分子生物學(xué)如果DNA的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 分子生物學(xué)A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 ppp因能量的需要， DNA的5 端必須帶有PPP游離dNTP具有pppppp OH 3 A T C G 在0.2M Nacl 的生理環(huán)境中，磷酸基團(tuán)間的強(qiáng)電負(fù)性，使dNTP難以聚合到DNA的5端，而且 雙鏈DNA的5端堿基配對(duì)困難 需要其他機(jī)制以解脫 分子生物學(xué)堿基發(fā)生錯(cuò)配后的校正 費(fèi)時(shí)、費(fèi)能、增加脫磷酸、加磷酸的能量消耗 A T C G ppp OH+ pp

6、pAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 分子生物學(xué) 2. DNA的半保留復(fù)制 （Semi-Conservation Replication） 分子生物學(xué)1958 Meselson-stahl(CsCl gradient centrifuge) S generations 0 1.0 2.0 3.0 4.0 0 + 2.0 0 + 4.0 N15 N14 DNASemi-ConservationReplication分子生物學(xué)3. DNA半不連續(xù)復(fù)制 （semi-discontinuous replication） 分子生物學(xué)3535OK !How ?5353分子

7、生物學(xué)At least one strand of DNA replication in Okazaki fragment 1kbDNA replication in Okazaki fragment 1kb5353（semi-discontinuous replication ! ） Okazaki fragment 1968 Reiji Okazaki分子生物學(xué)DNA復(fù)制的酶學(xué) DNA復(fù)制是一個(gè)非常復(fù)雜的酶學(xué)過程，它需要30種以上的酶和蛋白質(zhì)，人們常把這些酶和蛋白質(zhì)稱為復(fù)制體系，其中一部分酶和蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，協(xié)同動(dòng)作，構(gòu)成所謂復(fù)制體（replisome）。分子生物學(xué)DNA聚合反應(yīng)與聚合酶

8、 參與DNA聚合反應(yīng)的有三種酶：Pol I，Pol II和Pol III， 以四種核苷5-三磷酸，即dATP、dGTP、dTTP和dCTP為前體合成聚核苷酸。Pol II的具體作用還不清楚，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室工作，它在復(fù)制過程中似乎沒有什么作用，Pol III極其復(fù)雜，是大腸桿菌中是主要的聚合酶。 分子生物學(xué)DNA聚合酶活性： 在有引物和模板的情況下，Pol I和Pol III都具有DNA聚合酶活性，但Pol I的聚合酶活性主要用于DNA的修復(fù)和RNA引物的替換，而Pol III才是使DNA鏈延長的主要聚合酶。 外切核酸酶活性：35 ：校對(duì)、保真53 ： Pol III只作用于單鏈缺口填充能力Pol

9、III只能填充幾個(gè)堿基的小缺口Pol I可以填充很大的缺口分子生物學(xué)其他酶類DNA連接酶螺旋酶DNA旋轉(zhuǎn)酶分子生物學(xué)DNA復(fù)制的基本過程 分子生物學(xué)DNA復(fù)制的基本過程起始鏈延伸復(fù)制終止真正的酶促機(jī)理和新DNA分子合成的步驟是十分復(fù)雜的，需要多種特異性酶和蛋白因子的參與，涉及蛋白質(zhì)、DNA和RNA等生物大分子之間的相互作用。 分子生物學(xué)1. DNA復(fù)制的起始 DNA復(fù)制起始部位的序列特征 DNA復(fù)制都是在特定起始部位(Ori)開始。大多數(shù)原核生物基因組和細(xì)菌質(zhì)粒只有一個(gè)Ori位點(diǎn)，真核生物染色體中有多個(gè)Ori。由一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)構(gòu)成的DNA復(fù)制單位稱為復(fù)制子。原核生物染色體和質(zhì)粒都是獨(dú)立的復(fù)制子

10、，真核細(xì)胞染色體中會(huì)有許多復(fù)制子。每個(gè)復(fù)制子在一個(gè)細(xì)胞周期中都必須起動(dòng)而且只能起動(dòng)一次。 分子生物學(xué)復(fù)制起點(diǎn)（origin）一般指的是DNA復(fù)制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌體、細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和一些動(dòng)物病毒的DNA通常具有明顯的復(fù)制起點(diǎn)。酵母也有特異的復(fù)制起點(diǎn)，在細(xì)胞周期S期染色體復(fù)制時(shí)起重要的作用。在真核生物中，復(fù)制起點(diǎn)很復(fù)雜，迄今仍難于在分子水平上闡明其特征。分子生物學(xué)E.coli、酵母和SV40的復(fù)制起始位點(diǎn)的一些共同特征復(fù)制起始位點(diǎn)中有多個(gè)獨(dú)特的短重復(fù)序列。這些短重復(fù)序列被多亞基的復(fù)制起始位點(diǎn)結(jié)合蛋白識(shí)別，這些蛋白對(duì)于復(fù)制酶在復(fù)制起始位點(diǎn)的組裝起關(guān)鍵作用。復(fù)制起始位點(diǎn)附近一般都有

11、富含AT的序列，以利于DNA雙鏈的解旋，產(chǎn)生DNA復(fù)制模板。 分子生物學(xué)復(fù)制起始位點(diǎn)共同的作用結(jié)合多種蛋白，并有助于它們之間的相互作用，從而有效地起始DNA的復(fù)制。復(fù)制起始位點(diǎn)可以決定基因組在S期復(fù)制的時(shí)間順序。復(fù)制起始位點(diǎn)可以防止DNA復(fù)制干擾基因在S期的轉(zhuǎn)錄。 分子生物學(xué)參與復(fù)制起始的蛋白質(zhì)SSBT抗原ORC、MCMp、Cdc45分子生物學(xué)引發(fā) DNA復(fù)制的起始就是引物的合成 目前已知的DNA聚合酶都只能延長已存在的DNA鏈，而不能從頭合成DNA鏈。研究發(fā)現(xiàn)，DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，提供3-OH，再由DNA聚合酶從RNA引物3端開始合成新的DNA

12、鏈。 分子生物學(xué)前導(dǎo)鏈的引發(fā)過程比較簡(jiǎn)單，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此為起點(diǎn)一直合成下去。對(duì)于滯后鏈來說，引發(fā)過程就十分復(fù)雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶的協(xié)同作用，還牽涉到岡崎片段的形成和連接。 分子生物學(xué) DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活 (transcriptional activation） RNA polymerase Rif S 10 Nt RNA primer for leading Strand origin dnaGprimase Rif R for lagging Strand 分子生物學(xué) RNA polymerase Primase (dnaG) (for primer of L

13、eading Strand) (for primer of Lagging Strand) Rif S Rif R 合成的RNA分子與 合成的非典型的mRNA分子與 DNA模板分離 DNA模板以氫鍵連接不分離 可以使D.S. DNA解鏈為單鏈 只能利用單鏈狀態(tài)的DNA 狀態(tài)完成DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活 為模板合成12Nt的RNA引物 (也可利用 dNt合成DNA引物 ) leading strand引物的合成是否 primase單獨(dú)存在時(shí)沒有活性 -由RNA polymerase完成轉(zhuǎn)錄 只有與相關(guān)蛋白(dnaB.C)結(jié)合成 激活合成的 RNA分子作為引物 復(fù)合體引發(fā)體（primosome) -或

14、由primase (dnaG) 接替 在某種意義上講, 合成的引物 primase譯為引物酶？引發(fā)酶！ 仍無定論 ！ 更為確切 ！ 分子生物學(xué)primosome Synthesis of progeny strand in lagging DNA pppRNA as primerDNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase分子生物學(xué) RNApol (RNA polymerase) Rif S dnaG (primase) Rif R 完成對(duì)后隨鏈引物的合成 完成10 NtRNA引物合成后. DNApolII進(jìn)行DN

15、A鏈的延伸 DNApol I 對(duì)后隨鏈的RNA引物切除并聚合填補(bǔ) 連接酶 (ligase）將 Okazaki 片段連接 完成對(duì)先導(dǎo)鏈引物的合成 實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始較先導(dǎo)鏈的啟動(dòng)落后一個(gè)Okazaki片斷 Conclusion 分子生物學(xué)2. DNA鏈的延伸 引發(fā)一旦完成，DNA聚合酶就在RNA引物的3-OH端按照模板鏈的堿基順序，以堿基互補(bǔ)的規(guī)則延伸DNA鏈。無論原核還是真核生物，前導(dǎo)鏈?zhǔn)前?3方向連續(xù)合成，后隨鏈的延伸也是按53，但不是連續(xù)合成，而是先合成多個(gè)RNA引物，再延伸為多個(gè)岡崎片段，最后連接起來。 分子生物學(xué)原核/真核生物DNA鏈延伸的不同 主要是催化的酶不同E.coli

16、前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成都是由DNApol III催化。SV40前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成是由二個(gè)不同的DNA聚合酶催化完成的(DNApol向DNApol) 分子生物學(xué)3. DNA復(fù)制的終止 一般說來，鏈的終止不需要特定的信號(hào)，也不需要特殊的蛋白質(zhì)參與。但是，環(huán)狀或線性DNA復(fù)制終止的機(jī)制卻有所不同。 分子生物學(xué)環(huán)狀DNA復(fù)制終止環(huán)狀DNA復(fù)制時(shí)，可在離起始點(diǎn)180。相遇，即兩個(gè)復(fù)制叉同時(shí)到達(dá)一個(gè)部位。有些環(huán)狀DNA分子內(nèi)含有終止位點(diǎn)，一個(gè)復(fù)制叉先到達(dá)該處停下來，然后另一個(gè)復(fù)制叉也到達(dá)該部位。如在正常情況下，DNA復(fù)制時(shí)終止點(diǎn)與起始點(diǎn)相差180。如果刪去一些非必需區(qū)域，或者插入一些無關(guān)的片段從而改變了復(fù)

17、制起始點(diǎn)和終止點(diǎn)的相對(duì)距離，經(jīng)改造后的DNA復(fù)制終止點(diǎn)仍保持與起始點(diǎn)相差180。表明DNA分子沒有特定的終止點(diǎn)。 分子生物學(xué)線狀 DNA的復(fù)制終止 及避免5末端短縮的模式 （5-end shortend ） 分子生物學(xué) 3-OH ? 3-OHLagging strand of circle DNA replication Lagging strand of linear DNA replication But 35533-OH ? 分子生物學(xué)T7 phage Direct repeat in the end of linear DNA Concatermer between two offsp

18、ring DNA after replication (100 dNt terminal redundancy)分子生物學(xué)?Concatermer（二聯(lián)體） 3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OH分子生物學(xué)Replication of linear Adnovirus-2 DNA 35937 bp pTP C G IR 103-162 IR ; including 50 bp replication origin rich AT & 1th C/G high conservation pTP ; pre-Terminal protein 80 kd TP 55 kdDBP; S.S.

19、 DNA binding protein 72 kd Ad2 DNA polymerase ; 140 kd 分子生物學(xué)復(fù)制起始復(fù)合體 引發(fā)復(fù)制 （不需引物） 避免5-end shortent pTp-Ser-dCMP CG 過程 SSB + ATP DNA 末端解鏈 TP pTP-Ser + dCTP pTP-Ser-dCMP 3 OH分子生物學(xué)IRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplaced S.S DNA Hairpin PanhandlepTP-Ser-dCMPG 3G 3G 3TP分子生物學(xué)真核生物染色體 DNA末端補(bǔ)齊模式 端粒的發(fā)現(xiàn) 1938 Muller X-r

20、ay Drosophila 末端極少發(fā)生缺失和倒位推測(cè)染色體兩端存在特殊結(jié)構(gòu)，使染色體趨于穩(wěn)定.并定名為Telomer 1938 B.McClintock 頂端缺失染色體易于融合，而正常染色體不易連接。 推測(cè)染色體末端具有特殊端粒結(jié)構(gòu)。1970s 分子生物學(xué)發(fā)展 端粒研究獲得突破分子生物學(xué) 端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (rich G chain) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (rich C chain) 1985. Carol Greider & Blackburn,

21、 1986. Gottchling 尖毛蟲 telomer binding protein 1 55kd telomer binding protein 2 26 kd四膜蟲 telomerase 將T2G4 末端重復(fù)延伸 游撲蟲 Telomerase = RNA CAAAACCCC 鏈 + 末端結(jié)合蛋白 （TBP） + 100 bp telomer 分子生物學(xué) model TBP is Reverse transcriptase-like RNA complement with 3 end of DNA & as template for cDNA Elongated T2G4 3-end

22、as primer for 5-end DNA synthesis G鏈 T2G4-TTGGGGT TGGG C鏈-A2C4- telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 TTG分子生物學(xué) telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 G鏈 T2G4-TTGGGGT TGGG C鏈-A2C4-TTG telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 GGGTTGG鏈 T2G4-TTGGGGT TGGG C鏈-A2C4-TTGGGGTTG- telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 telomerase 3 CCAACCC

23、CAACCCC- 5 telomerase 3 CCAACCCCAACCCC- 5 When G-rich strand is longer enough telomerase 3 aaaAACCCCAACuuac- 5 分子生物學(xué) G G hoogsteen bond Tetraplex helix G鏈 T2G4-TTGGGG TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG C鏈-A2C4- G鏈 T2G4-TTGGGG t t g g g g t t gC鏈-A2C4- AACCCCAA g g g g t tgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACC

24、CDNA polor分子生物學(xué)Telomerase activity is repressed in somatic cells of multicelluar organisms resulting in a gradual shortening of the chromosome with each cell generation. As this shortening reaches informational DNA, the cells senesce and die. 細(xì)胞分裂端粒閾值分子生物學(xué)細(xì)胞分裂次數(shù)與端粒長短呈正比細(xì)胞分裂端粒閾值端粒長短端粒酶活 Harley (1989)

25、端粒的重復(fù)片段為探針檢測(cè) 胎兒細(xì)胞株嬰兒細(xì)胞株青年細(xì)胞株老年細(xì)胞株年齡小 大端粒長度 長 短早老性侏儒癥的端粒明顯較正常人短“多莉”的衰老研究端粒（記時(shí)器）丟失的速率/ 年，預(yù)測(cè)人類的壽命 XX XY why?PCD機(jī)制、癌細(xì)胞的無限繁殖分子生物學(xué)DNA 復(fù) 制 的 調(diào) 控 分子生物學(xué)噬菌體DNA的復(fù)制調(diào)控 噬菌體和原噬菌體 原噬菌體基因組整合在宿主染色體中，不能自主復(fù)制，依賴于宿主染色體進(jìn)行復(fù)制，而且噬菌體基因表達(dá)被阻遏。分子生物學(xué)幾個(gè)概念噬菌體感染大腸桿菌以后?？蓪⑵浠蚪M整合到細(xì)菌染色體上，并成為細(xì)菌基因組的部分，隨著染色體DNA的復(fù)制而復(fù)制。這種整合有噬菌體基因組的細(xì)菌稱為溶原細(xì)菌，這

26、一過程稱為溶原途徑。溶原性細(xì)菌般不被同種噬菌體再行感染，這一現(xiàn)象稱為免疫性。噬菌體感染宿主后也可以不通過溶原途徑而利用細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的成分進(jìn)行繁殖，最終使宿主裂解而死亡，這一過程稱為裂解循環(huán)，也稱溶菌途徑。溶原性細(xì)菌受某些外界物理或化學(xué)因素（如紫外線、絲裂霉素C等）的作用，原噬菌體可以脫離細(xì)菌染色體而進(jìn)行自主復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)菌裂解，游離出大量噬菌體，這一過程稱為誘導(dǎo)。 分子生物學(xué)噬菌體的生活史分子生物學(xué)溶源性和裂解性的存活方式可以相互轉(zhuǎn)化。分子生物學(xué)分子生物學(xué) 噬菌體的lysogenic和lytic兩個(gè)生活史周期的發(fā)育過程是cI、cro、N、Q、cII/cIII等6個(gè)基因的控制下進(jìn)行的。分子生物學(xué)

27、大腸桿菌DNA復(fù)制的調(diào)控 高度保守的復(fù)制起點(diǎn)oriCA/T含量56；堿基序列高度保守，某些部分種類不十分保守，但數(shù)目卻是保守的；有914個(gè)GATC位點(diǎn)，GATC位點(diǎn)中腺嘌呤的甲基化對(duì)于oriC的功能不可缺少；有四個(gè)高度保守的DnaA識(shí)別位點(diǎn)；oriC中沒有大于20個(gè)密碼子的開放閱讀框。 分子生物學(xué)oriC質(zhì)粒復(fù)制可分為6個(gè)階段： 轉(zhuǎn)錄活化及oriCDnaA蛋白起始復(fù)合物的形成；DnaB、DnaC等蛋白相互作用形成前引物復(fù)合體；SSB與解旋酶參與復(fù)制，使雙鏈DNA廣泛解鏈并形成前引物合成復(fù)合物；由引發(fā)酶合成引物，完成復(fù)制起始；由DNA聚合酶III全酶在模板引物復(fù)合物的引物3末端延伸DNA鏈；由D

28、NA聚合酶I、RnaseH和連接酶完成5末端的修飾并連接為完整的DNA鏈，最后由促旋酶形成負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)ColE1質(zhì)粒DNA復(fù)制調(diào)控分子生物學(xué) Repressor model Antisense RNA model RNA-2 positive control 0-555 0 RNA-2 RnaseHOH RNA-2DNA / RNA primer for DNA replication Negative control分子生物學(xué)RNA-1110 bp RNase H 不能識(shí)別RNA-2, 不能形成primer 的3-OH -555 -4450RNA-2RNA-1RNA-2 110 b

29、p D.S. RNA分子生物學(xué)RNA-1 0 When RNA-2200-360Nt Rom gene expression RNA-1 / RNA-2 D.S. repression RNA-1 / RNA-2 不能形成primer的 3-OH 促進(jìn) 限制 63 aa ROP(Rom protein) RNA-2 只能轉(zhuǎn)錄到100-220 base, 不能到達(dá)“0”原點(diǎn) 不能形成primer 的3-OH0分子生物學(xué)真核細(xì)胞DNA的復(fù)制調(diào)控 真核細(xì)胞的生活周期： G1：復(fù)制預(yù)備期 S：復(fù)制期 G2：有絲分裂準(zhǔn)備期 M：為有絲分裂期DNA復(fù)制只發(fā)生在S期分子生物學(xué)DNA replication

30、at phase S of cell cycle S 6-8hs M 1hG23-4hsmammalian cell 22-25hrs500-5000 bp/min G112hs分子生物學(xué)真核細(xì)胞中DNA復(fù)制3個(gè)水平的調(diào)控：細(xì)胞生活周期水平染色體水平復(fù)制調(diào)控復(fù)制子水平調(diào)控分子生物學(xué)第二節(jié) DNA修復(fù)（DNA repair） 分子生物學(xué)DNA：遺傳與變異遺傳性和變異性的基礎(chǔ)都是DNADNA損傷是某些因素作用下，DNA的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，阻礙DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，DNA的這種變化稱DNA的損傷，基因突變也是DNA損傷的一種。 分子生物學(xué)引起DNA損傷的因素：1、 物理因素：紫外線：產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚

31、體電離輻射：引起DNA結(jié)構(gòu)多種程度不同的損傷，這些損傷包括DNA的主鏈斷裂，一條或二條鏈的斷裂，堿基聚合，糖苷鍵的斷裂等，引起大片段損傷或丟失，造成染色體畸變、基因突變、細(xì)胞死亡等。2、 化學(xué)因素：烷化劑核苷酸類似物亞硝酸鹽和亞硝胺代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)3、 生物因素：DNA病毒和RNA病毒感染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移、基因重組、轉(zhuǎn)坐子的轉(zhuǎn)位等都可能使DNA發(fā)生改變，引起基因突變。 分子生物學(xué)突變分類 點(diǎn)突變 DNA分子中單個(gè)堿基的改變，一種堿基被另一種堿基取代。同類堿基之間的取代，如A被G，或C被T取代，這類取代稱轉(zhuǎn)換。不同類堿基間的取代，如A被T，或C取代，T被A或G取代，這類取代稱顛換。插入突變 在DNA

32、的某一位點(diǎn)插入一個(gè)或一個(gè)以上的堿基。丟失突變 在DNA的某一位點(diǎn)缺失一個(gè)或一個(gè)以上的堿基。分子生物學(xué)突變可能造成的后果 (1) 突變可能使生物更有利于適應(yīng)環(huán)境，這種突變將會(huì)保留和遺傳，引起生物的進(jìn)化。(2) 導(dǎo)致生物體的死亡或生命力的明顯下降，屬致死突變。(3) 不致死，卻引起形態(tài)和結(jié)構(gòu)的異常，或發(fā)生營養(yǎng)缺陷，或出現(xiàn)新的有害特性。(4) 引起細(xì)胞的癌變，癌基因和抑癌基因的突變是許多腫瘤發(fā)生的原因。(5) 不發(fā)生任何變化和影響。 分子生物學(xué)基因突變的特征 (1) 突變以一定的機(jī)率隨機(jī)發(fā)生;(2) 突變有可逆性;(3) 突變的發(fā)生率可被外界因素所加強(qiáng);(4) 突變是可以遺傳的.分子生物學(xué)修復(fù) 絕大

33、多數(shù)的損傷或突變?cè)贒NA未復(fù)制前就被修復(fù)，保持遺傳的穩(wěn)定性。生物體內(nèi)存在多種修復(fù)機(jī)制，采用那一種修復(fù)機(jī)制對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，取決于DNA損傷的性質(zhì)。 分子生物學(xué)復(fù)制過程中的錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制 (= 10-11)DNA mismatch+ - A- -C-DNApol (= 10-8)經(jīng)第二次校正= 10-11MRSMismatch RepairSystem復(fù)制修復(fù) 分子生物學(xué)1. ung system (尿嘧啶-N-糖苷酶系統(tǒng))-TAGC-ATCG-TAGC-A CG-U-TAGC-ung-aseGCUAU-TAGC-A CG-Apurinase(內(nèi)切酶)-TAGC-ADNApolligaseT

34、CG-分子生物學(xué)2. Mismatch repair systemDNA polymerase ligase MCE (mismatch correct enzyme) 3 subunits mutH, L, S dam genem6A甲基化酶Scanning 新生鏈中錯(cuò)配堿基識(shí)別新生鏈中非 m6A 的GATC序列酶切含錯(cuò)配堿基的新生DNA區(qū)段分子生物學(xué)MCE scanningDNA中的GATC(palindromic seq.) 為m6A甲基化敏感位點(diǎn)平均每2kb左右有一GATC seq.3 -C-CTAG-CTAG- 5 5-T-GATC-GATC- 3 3- 5少 梯度 多（m6A）新生

35、鏈分子生物學(xué)MCE scanningendonucleasePolymeraseligaseGATC GATCCTAG CTAGTCGATC GATCCTAG CTAGTGATC GATCCTAG CTAGTA分子生物學(xué)phR 471aaDNA的損傷修復(fù)1. photo reactivation-TT-AA-TT-AA-TT-AA-TT-AA- Before replication & Error-free 400 nm Blue light & phR gene (photo-reactivation enzyme) 可見光激活分子生物學(xué)2. ExisionRepair Before Rep

36、lication Error-freeUvrA, B, C gene Endonucleases Exonuclease DNA pol Ligase切 補(bǔ) 修 復(fù)分子生物學(xué)E.coli 存活%U.V 計(jì)量w.t.UvrA+ RecA+Rec A+ uvr a-rec a- uvr a-Rec-A. gene 以某種方式參與DNA損傷修復(fù)3. RecombinativeRepair分子生物學(xué)Rupp.Howard-FlandersTT TTAA AATT TTTT TTAA AATT TT變性 E.coli (Rec-A, uvr-6-)D.S. DNAS.S. DNAU.V. 復(fù)制提取 變性

37、TT TT TTAA AA AAReplication is forced to skip past TT dimer gap left in newly strand繼續(xù)復(fù)制分子生物學(xué) 存在與重組有關(guān)的暗修復(fù)機(jī)制 與Rec-A基因引起的strand transfer有關(guān) TT dimer未被修復(fù)，僅表現(xiàn)在后代群體中TT dimer 濃度的稀釋 鏈的非準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致突變機(jī)率的增加 分子生物學(xué) RecombinativeRepair (strand transfer repair)After replication repair Error-proneRecA, DNA polymeraelig

38、ase genes be needed分子生物學(xué)4. SOS repairSOS repair in E. coli have to be induced by U.V. High frequency mutation by SOS repair (Error-prone)DNA damaged300 XsignalRecA cleaves LexA SOSUmnC mutation-Before inducing. LexA-p Rec-A,UmuC11genesNeg. repression-U.V.damage DNASignal (S.S. DNA tail or 5Nt S.S.DN

39、A)機(jī)制分子生物學(xué)RecA-P; 三種功能 DNA 重組活性 與S.S. DNA結(jié)合活性 少數(shù)蛋白的proteinase活性當(dāng)DNA正常復(fù)制時(shí)（無復(fù)制受阻，無DNA損傷， 無TT dimer） RecA-p不表現(xiàn)proteinase活性分子生物學(xué)當(dāng)DNA復(fù)制受阻/ DNA damaged能量大量消耗細(xì)胞內(nèi)原少量表達(dá)的RecA-p與S.S, DNA結(jié)合激活RecA-p的proteinase活性修復(fù)損傷LexA-p降解RecA-p高效表達(dá) 300 times upSOS open分子生物學(xué)當(dāng)DNA復(fù)制度過難關(guān)后SOS repair 是一種error-prone 極強(qiáng)的修復(fù)機(jī)制是進(jìn)化中形成的“ 竭盡

40、全力，治病救人” 的措施（正常狀態(tài)下，SOS是關(guān)閉的）RecA-p很快消失LexA gene onSOS off分子生物學(xué)突變的形成DNA未經(jīng)修復(fù)經(jīng)過修復(fù) / 校正 死亡突變率降低傾向差錯(cuò)修復(fù) (重組修復(fù)，SOS）避免差錯(cuò)修復(fù)(光修復(fù)，切補(bǔ)修復(fù))形成突變不形成突變DNA damaged / mispairing物理誘變，化學(xué)誘變，自發(fā)突變突變是在修復(fù)過程中形成的（非準(zhǔn)確的修復(fù)）第三節(jié) DNA重組自然界的DNA分子均是重組體 變異是生物進(jìn)化的重要因素之一生物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制自然選擇的重要基礎(chǔ)重組的本質(zhì)基因的重排或交換，即2個(gè)DNA分子間或一個(gè)DNA分子的不同部位間，通過斷裂和重接，交換DNA片段

41、從而改變基因的組合和序列。 遺傳重組涉及到DNA分子內(nèi)斷裂-復(fù)合的基因交流過程，有時(shí)又叫做交換。 遺傳重組和重組DNA技術(shù)不是一回事！遺傳重組指發(fā)生在生物體內(nèi)的基因交流；重組DNA技術(shù)指在體外人為地將不同源的DNA組合在一起，是我們有目的有計(jì)劃地改造生物體的一項(xiàng)技術(shù)和手段。重組分類：根據(jù)對(duì)DNA序列和所需蛋白質(zhì)因子的要求，分為：同源重組（homologous recombination）位點(diǎn)特異性重組（site-specific recombination）轉(zhuǎn)座作用（transposition）異常重組 1.同源重組DNA同源序列間常發(fā)生于兩個(gè)較長的同源DNA片段或同源染色體之間參與重組的兩個(gè)

42、DNA片斷序列相同或者幾乎相同如果是完全相同片斷發(fā)生的交換稱為對(duì)稱交換，在遺傳上是無意義的事件；如果發(fā)生交換的片斷是序列相近的，這種交換我們稱為不對(duì)稱交換，由于它發(fā)生了染色體的變異，有基因的重復(fù)和缺失現(xiàn)象產(chǎn)生，是有遺傳效益的重組事件。發(fā)生同源重組的條件：DNA分子接觸；有缺口；RecA蛋白（重組酶） 同源重組的基本特征 涉及同源染色體的同源序列間的聯(lián)會(huì)配對(duì) 涉及DNA分子在特定的交換位點(diǎn)發(fā)生斷裂 和錯(cuò)接的生化過程 單鏈DNA分子或單鏈DNA末端是交換發(fā)生 的重要信號(hào)2. 位點(diǎn)特異性重組 兩條雙螺旋DNA特異位點(diǎn)不需要RecA，但需要相關(guān)酶高度保守性（保守重組）attP of p O pattB

43、 of E.coli B O BB O P P O BInt (Integrase)IHF (Integration host factor)Xis (Excisionase)FIS (factor of inversion stimulation)以噬菌體DNA整合為例Specialized recombination involves breakage and reunion at specific sites4 Int-p 3 IHFXis-p P O P-160 -199 -40 0 +40 +80P- GCTTTTTT A TACTAA- pB- GCTTTTTT A TACTAA-

44、 B15 bp of O site homologousSpecific integration sites of INT-p, IHF, Xis-p噬菌體DNA整合的分子機(jī)制Int and IHF bind to different sites in attP. The Int recognition sequences in the core region include the sites of cutting.The Int binding sites in the core lie on one face of DNA. The large circles indicate posi

45、tions at which methylation is influenced by Int binding; the large arrows indicate the sites of cutting. Photograph kindly provided by A. Landy.Multiple copies of Int protein may organize attP into an intasome, which initiates site-specific recombination by recognizing attB on free DNA.3. 轉(zhuǎn)座作用Transp

46、osonA DNA sequence able to insert itself at a new location in the genome (without any sequence relationship with the target locus).轉(zhuǎn)座作用DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位，是由可移位因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象?！稗D(zhuǎn)座”？不十分準(zhǔn)確，在轉(zhuǎn)座過程中，可移位因子的一個(gè)拷貝常常留在原來的位置上，在新位點(diǎn)出現(xiàn)的是拷貝，因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA的復(fù)制。根據(jù)轉(zhuǎn)座子復(fù)制與否，轉(zhuǎn)座作用可分為:單純轉(zhuǎn)移復(fù)制轉(zhuǎn)移DNA轉(zhuǎn)座現(xiàn)象的一般遺傳特點(diǎn) a) 不依賴 Donor site 與

47、 Target site 間序列的同源性 (非同源重組過程 ，不依賴 recA 酶) b) 轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī)（插入專一型）c) 某些轉(zhuǎn)座因子（Tn3）對(duì)同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有 排他性（免疫性）d) 靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù)(DR) e) 轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)座模型 (a)轉(zhuǎn)座酶結(jié)合轉(zhuǎn)座子末端和新的目的位點(diǎn)； (b)在兩條DNA鏈的特異位點(diǎn)切開，鏈交換后重新連接； (c)轉(zhuǎn)座子從宿主DNA上完全切離； (d)目的位點(diǎn)復(fù)制成雙份或； (e)每個(gè)轉(zhuǎn)座子的鏈被拷貝； (f)產(chǎn)生共整合結(jié)構(gòu)； (g)被解離酶分離。 原核生物的轉(zhuǎn)座因子的種類： ISCompos

48、ite transposonTnA family Transposable phage 復(fù)制型轉(zhuǎn)座子 (replicating transposable element)a. 插入序列 （ insertion sequence IS ） GATCGTC -GACGATC l 700 2000 base pair （bp）IR IRGATCGTC -GACGATCCTAGCAG-CTGCTAGStem-loop 5 GATCGTC 3 CTAGCAG l IS插入target site后 target sequence repeats directly flanked the IS b. 復(fù)合因

49、子 （composite element / composite tansposon） l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) IS插入到功能基因兩端，可能形成復(fù)合轉(zhuǎn)座因子IS ISIS IS L IS R臂 中心區(qū) 臂transpositionmutation 復(fù)合轉(zhuǎn)座子一旦形成，轉(zhuǎn)座功能受較多因子調(diào)控 結(jié)構(gòu)特點(diǎn) IR IR IR IRIRIR IS10L Tn10 (9.3 kb) IS10R IR IR I

50、R IRDRDR IS1L Tn9(2.5 kb) IS1R 穩(wěn)定性Excise or DeletionDR型 (Instable)IR型 (Stable)InversionB AA BBAdonorStaggered cutreceptor轉(zhuǎn)座機(jī)制replicating transposition in prokaryoteTntargetStrandstransfercopying of Tn & targetTn DR Tn DRDonor receptor cointegrater & resolutionConclusiona) 轉(zhuǎn)座過程是由 Donor 提供 Tn copy 到 t

51、arget site，涉及酶切 、復(fù)制、重組的遺傳過程b) 轉(zhuǎn)座完成后，在 Tn 兩側(cè)出現(xiàn) target site 序列的正向重復(fù)其長度取決于 staggered cutting 的長度c) 轉(zhuǎn)座因子的 IR 序列是轉(zhuǎn)座酶的重要識(shí)別位點(diǎn)，與轉(zhuǎn)座，切除有關(guān)d) Cointegrater 是轉(zhuǎn)座過程的中間體 (具有兩個(gè) Tn 和兩個(gè) replicon), 其穩(wěn)定性依 Tn不同而異，或 resolution 完成轉(zhuǎn)座過程，或共聯(lián)導(dǎo)致 Tn 和抗性的積累。3.3.2 真核生物的轉(zhuǎn)座因子及轉(zhuǎn)座機(jī)制 轉(zhuǎn)座：DNADNA返座：DNARNADNA 類似反轉(zhuǎn)錄病毒 真核生物的轉(zhuǎn)座因子的種類 I 型； 轉(zhuǎn)座II

52、型；返座果蠅：Copia酵母：Ty1 Alu family 果蠅：P、FB玉米：Ac/Ds, Spm/dspm, Dt IR, transposase, needed 單純轉(zhuǎn)移和復(fù)制轉(zhuǎn)移機(jī)制Both strands of Tn10 are cleaved sequentially, and then the transposon is joined to the nicked target site. Nonreplicative transposition proceeds by breakage and reunion Nonreplicative transposition results when a crossover structure is releas