基因突變和誘變育種教材

1、基因突變和誘變育種教材依表型的改變分為：形態(tài)突變型由突變引起的個(gè)體或菌落形態(tài)的變異。營(yíng)養(yǎng)缺陷型因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變類型。發(fā)酵突變型喪失產(chǎn)生某種生物合成酶能力的突變型抗性突變型因突變而產(chǎn)生了對(duì)某種化學(xué)藥物或致死物理因子的抗性條件致死突變型突變后在某種條件下可正常生長(zhǎng)繁殖，而在另一條件下卻無法生長(zhǎng)繁殖的突變型抗原突變型因突變而引起的抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變產(chǎn)量突變型通過基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株。 （一）突變類型按是否比較容易、迅速地分離到發(fā)生突變的細(xì)胞來分：選擇性突變株（selective mutant）

2、：具有選擇標(biāo)記（如營(yíng)養(yǎng)缺陷性、抗性突變型、條件致死突變型），只要選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件，如培養(yǎng)基、溫度、pH值等，就比較容易檢出和分離到。非選擇性突變株（non-selective mutant）：無選擇標(biāo)記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。 定義：某一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。 突變率也可以用每一單位群體在每一世代中產(chǎn)生突變株的數(shù)目 來表示。 突變率=突變細(xì)胞數(shù)/分裂前群體細(xì)胞數(shù) 突變是獨(dú)立的。某一基因發(fā)生突變不會(huì)影響其它基因的突變率。在同一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)發(fā)生兩個(gè)基因突變的幾率是極低的，因?yàn)殡p重突變型的幾率只是各個(gè)突變幾率的

3、乘積。 由于突變的幾率一般都極低，因此，必須采用檢出選擇性突變株的手段，尤其是采用檢出營(yíng)養(yǎng)缺陷型的恢復(fù)突變株（back mutant或reverse mutant）或抗性突變株特別是抗藥性突變株的方法來加以確定。（二）突變率（三）突變的特點(diǎn) 適用于整個(gè)生物界，以細(xì)菌的抗藥性為例。自發(fā)性：突變可在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生。不對(duì)應(yīng)性：突變性狀與突變?cè)蛑g無直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系。稀有性：突變率低且穩(wěn)定。獨(dú)立性：各種突變獨(dú)立發(fā)生，不會(huì)互相影響?？烧T變性：誘變劑可提高突變率。穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。可逆性：從原始的野生型基因到變異株的突變稱為正向突變（forward mutation），從突變株

4、回到野生型的過程則稱為回復(fù)突變或回變（back mutation或reverse mutation）。（四）基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明 在各種基因突變中，抗性突變最為常見。但在過去相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)對(duì)這種抗性產(chǎn)生的原因爭(zhēng)論十分激烈。一種觀點(diǎn)認(rèn)為，突變是通過適應(yīng)而發(fā)生的，即各種抗性是由其環(huán)境（指其中所含的抵抗對(duì)象）誘發(fā)出來的，突變的原因和突變的性狀間是相對(duì)應(yīng)的，并認(rèn)為這就是“定向變異” 另一種看法則認(rèn)為，基因突變是自發(fā)的，且與環(huán)境是不相對(duì)的。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯(cuò)綜在一起，所以難以探究問題的實(shí)質(zhì)。 從1943年起，經(jīng)過幾個(gè)嚴(yán)密而巧妙的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，主要攻克了檢出在

5、接觸抗性因子前已產(chǎn)生的自發(fā)突變株的難題，終于解決了這場(chǎng)紛爭(zhēng)。變量試驗(yàn)又稱波動(dòng)試驗(yàn)或彷徨試驗(yàn)。1943年，S. E. Luria 和M. Delbrck 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，設(shè)計(jì)了左方的實(shí)驗(yàn)。1. 變量試驗(yàn)fluctuation test2.涂布試驗(yàn)原理與變量試驗(yàn)相同，方法更為簡(jiǎn)便，且可計(jì)算突變率。涂布試驗(yàn)中突變率的計(jì)算初始接種量：5 104 個(gè)/皿培養(yǎng)5小時(shí)，繁殖了12.3代，每個(gè)微菌落約含5100個(gè)細(xì)菌這時(shí)，每個(gè)平皿上的細(xì)胞數(shù)為：5100 5 104 2.6 108個(gè)/皿在6個(gè)平板上，比接種時(shí)增加的細(xì)胞數(shù)為：6 （2.6 108 5 104）= 15.6 108在未涂布的平板上共發(fā)現(xiàn)28個(gè)突變，

6、故突變率 = 28/15.6 108 = 1.8 108平板影印培養(yǎng)不僅在微生物遺傳理論的研究中有重要應(yīng)用，而且在育種時(shí)間和其它研究中均有應(yīng)用。3. 平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)（replica plating）在根本未接觸過任何一點(diǎn)鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明了突變是自發(fā)產(chǎn)生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。（五）基因突變及其機(jī)制 基因突變的原因是多種多樣的，可以是自發(fā)的或誘發(fā)的，誘變又可分為點(diǎn)突變和畸變。具體類型可歸納如下：1. 誘發(fā)突變誘發(fā)突變（誘變）：通過人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因字符突變頻率的手段。誘變劑（mutagen）：凡能提高突變率的任何

7、理化因子，就稱為誘變劑種類：誘變劑的種類很多，作用方式多樣。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。按照遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的特點(diǎn)討論幾種有代表性的誘變劑的作用機(jī)制。（1）堿基置換（substitution） 對(duì)DNA來說，堿基的置換屬于一種染色體的微小損傷（microlesion），一般也稱點(diǎn)突變（point mutation）。它只涉及一對(duì)堿基被另一對(duì)堿基所置換。 分類：轉(zhuǎn)換（transition；顛換（transversion 誘變劑即可同時(shí)引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具其中的一種功能。根據(jù)化學(xué)誘變劑是直接還是間接地引起置換，可把置換的機(jī)制分成以下兩類來討論。直接引起置換的誘變劑定義：一類可直接與

8、核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的誘變劑，不論在機(jī)體內(nèi)或是在離體條件下均有作用。種類：例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N硝基-N-亞硝基胍，N-甲基-N-亞硝基脲，乙烯亞胺，環(huán)氧乙酸，氮芥等）。作用：它們可與一個(gè)或幾個(gè)核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而引起DNA復(fù)制時(shí)堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換，并進(jìn)一步使微生物發(fā)生變異。羥胺只引起GCA : T，其余都是可使GC=A : T發(fā)生互變的。能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有。亞硝酸可以使堿基發(fā)生氧化脫氨作用。 HNO2胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） HNO2腺嘌呤（A） 次黃嘌呤（H） HNO2鳥嘌呤（G） 黃嘌呤（X） 這些反應(yīng)及形成物均可

9、在DNA復(fù)制中產(chǎn)生影響，主要是使堿基對(duì)發(fā)生轉(zhuǎn)換。堿基轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制以亞硝酸為例亞硝酸引起的AT-GC轉(zhuǎn)換細(xì)節(jié)這類誘變劑主要是一些堿基類似物 ,如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5AU）、疊氮胸腺嘧啶（AIT）等等； 作用方式：通過活細(xì)胞的代謝活動(dòng)參入到DNA分子中，主要是在DNA復(fù)制時(shí)堿基類似物插入DNA中，引起堿基對(duì)配對(duì)錯(cuò)誤，造成堿基置換。以5-溴尿嘧啶(5-BU)為例： 5-BU是胸腺嘧啶（T）的的類似物 ，酮式的5-BU可以和A配對(duì)，烯醇式的5-BU可以和G配對(duì)，在DNA分子復(fù)制的過程中，由于5-BU的插入和互變異構(gòu)導(dǎo)致堿基置換。間接引起置換的誘變劑5-BU引起的轉(zhuǎn)換從上圖中

10、，還可以看到5-BU的摻入引起的GC回復(fù)到AT的過程。通過這兩個(gè)圖示，就很容易理解為什么同一種誘變劑既可造成正向突變，又可使它產(chǎn)生回復(fù)突變的原因了。也可以知道，為什么像5-BU這類代謝類似物只有對(duì)正在進(jìn)行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對(duì)休止細(xì)胞、游離的噬菌體粒子或離體的DNA分子卻不起作用。（2）移碼突變frame-shift mutation 或 phase-shift mutation，指誘變劑使DNA分子中增加（插入）或缺失一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)核苷酸，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯(cuò)誤的一類突變。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株（frame-shift mutant

11、）。與染色體畸變相比，移碼突變也只能算是DNA分子的微小損傷。丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和-氨基丫啶等，以及一系列稱為ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。 引起移碼突變的誘變劑：主要是吖啶類染料，如吖啶黃、吖啶橙等等。 這類化合物都是平面型的三環(huán)分子，它們的結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤嘧啶對(duì)十分相似。丫啶類化合物的誘變機(jī)制：至今還不很清楚。有人認(rèn)為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個(gè)嘌呤嘧啶對(duì)十分相似，故能嵌入兩個(gè)相鄰DNA堿基對(duì)之間，造成雙螺旋的部分解開（兩個(gè)堿基對(duì)原來相距0.34nm，當(dāng)嵌入一個(gè)丫啶分子時(shí)，就變成0.68nm），從而在DNA復(fù)制過程中，會(huì)使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基

12、，結(jié)果就引起了移碼突變。丫啶類化合物誘發(fā)的移碼突變及其回復(fù)突變圖示：（3）染色體畸變（chromosomal aberration） 某些理化因子，如X射線等的輻射及烷化劑、亞硝酸等，除了能引起點(diǎn)突變外，還會(huì)引起DNA的大損傷（macrolesion）染色體畸變，它包括：染色體結(jié)構(gòu)上的變化： 缺失（deletion）重復(fù)（duplication）易位（translocation）倒位（inversion）染色體數(shù)目的變化染色體結(jié)構(gòu)上的變化分為染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變兩類。染色體內(nèi)畸變：只涉及一條染色體上的變化，如發(fā)生染色體的部分缺失或重復(fù)時(shí)，其結(jié)果可造成基因的減少或增加；如發(fā)生倒位或易位時(shí)，

13、則可造成基因排列順序的改變，但數(shù)目卻不改變。倒位-是指斷裂下來的一段染色體旋轉(zhuǎn)180后，重新插入到原來染色體的原位置上，從而使其基因順序與其它的基因順序相反；易位-是指斷裂下來的一小段染色體再順向或逆向地插入到同一條染色體的其它部位上。染色體間畸變：指非同源染色體間的易位。染色體畸變?cè)诟叩日婧松镏幸话愫苋菀子^察，但在微生物中，尤其在原核生物中，還是近年來才證實(shí)的。許多理化誘變劑的誘變作用都不是單一功能的。由40年代B. McClintock對(duì)玉米粒色素斑點(diǎn)變異的遺傳研究而發(fā)現(xiàn)染色體易位，自1967年以來，已在微生物和其它生物中得到普遍證實(shí)，并已成為分子遺傳學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)座：有些DNA

14、片段不但可在染色體上移動(dòng)，還可從一個(gè)染色體跳到另一個(gè)染色體，從一個(gè)質(zhì)粒跳到另一個(gè)質(zhì)?；蛉旧w，甚至還從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。在這些DNA順序的跳躍過程中，往往導(dǎo)致DNA鏈的斷裂或重接，從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動(dòng)或關(guān)閉，結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生。轉(zhuǎn)座因子（transposible element）：在染色體組中或染色體組間能改變自身位置的一段DNA順序。也稱作跳躍基因（jumping gene）或可移動(dòng)基因（movable gene）。2.自發(fā)突變機(jī)制 自發(fā)突變是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。產(chǎn)生原因：由背景輻射和環(huán)境因素引起，如天然的宇宙射線等微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)，如

15、過氧化氫。 （過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。它對(duì)Neurospora（脈孢菌）有誘變作用，這種作用可因同時(shí)加入過氧化氫酶而降低，如果在加入該酶的同時(shí)又加入酶抑制劑KCN，則又可提高突變率。）由DNA復(fù)制過程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤引起。發(fā)現(xiàn)較早和研究得較深入的是紫外線（U.V.，ultraviolet ray）的作用。嘧啶對(duì)紫外線的敏感性要比嘌呤強(qiáng)得多。嘧啶的光化產(chǎn)物主要是二聚體和水合物。其中了解較清楚的是胸腺嘧啶二聚體的形成和消除。紫外線的主要作用是使同鏈DNA的相鄰嘧啶間形成共價(jià)結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體。二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從

16、而有可能引起突變或死亡。在互補(bǔ)雙鏈間形成嘧啶二聚體的機(jī)會(huì)較少。但一旦形成，就會(huì)妨礙雙鏈的解開，因而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，并使細(xì)胞死亡。（六）紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)定義：經(jīng)紫外線照射后的微生物立即暴露于可見光下時(shí)，可明顯降低其死亡率的現(xiàn)象，稱為光復(fù)活作用。這一現(xiàn)象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomyces griseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。后來，在許多微生物中都得到了證實(shí)。最明顯的是在E.coli的實(shí)驗(yàn)中：對(duì)照：8106個(gè)/ml E.coli U.V. 100個(gè)/ml E.coli試驗(yàn)：8106個(gè)/ml E.coli U.V. 360490nm 2106個(gè)/ml

17、E.coli 可見光，30min光復(fù)活作用（photoreactivation）經(jīng)紫外線照射后形成的帶有胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在黑暗下會(huì)被一種光激活酶（photoreactivating enzyme）即光裂合酶（photolyase）結(jié)合，當(dāng)形成的復(fù)合物暴露在可見光（300500nm）下時(shí)，此酶會(huì)因獲得光能而發(fā)生解離，從而使二聚體重新分解成單體。與此同時(shí)，光激活酶也從復(fù)合物中釋放出來，以便重新執(zhí)行功能。每一E.coli細(xì)胞中約含有25個(gè)光激活酶分子。由于一般的微生物中都存在著光復(fù)活作用，所以進(jìn)行紫外線誘變育種時(shí)，只能在紅光下照射及處理照射后的菌液。圖:光復(fù)活作用又稱切除修復(fù)（excis

18、ion repair）。是活細(xì)胞內(nèi)一種用于修復(fù)被紫外線等誘變劑（包括烷化劑、X射線和射線等）損傷后的DNA的機(jī)制。這種修復(fù)作用與光無關(guān)。有四種酶參與內(nèi)切核酸酶在胸腺嘧啶二聚體的5一側(cè)切開一個(gè)3-OH和5-P的單鏈缺口；外切核酸酶從5-P至3-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口；DNA聚合酶以DNA的另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的3-OH端起逐個(gè)延長(zhǎng)，重新合成一段缺失的DNA鏈；通過連接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3-OH末端與原鏈的5-P末端相連接，從而完成了修復(fù)作用。暗修復(fù)作用（dark repair）1、由核酸內(nèi)切酶切開二聚體的5末端，形成3-OH和5-P的單鏈缺口2、核酸外切酶從5-

19、P到3-OH方向切除二聚體，并擴(kuò)大缺口。3、DNA聚合酶以另一條互補(bǔ)鏈為模板，從原有鏈上暴露的3-OH端起合成缺失片段。4、連接酶將新合成的3-OH與原有的5-P相連接。設(shè)備：紫外燈、磁力攪拌器、暗室等紫外燈：波長(zhǎng)為253.7nm, 功率是15W處理時(shí)的照射距離：20cm 30cm樣品：要直接暴露在紫外燈下，厚度不能超過3mm照射時(shí)，要用磁力攪拌器攪拌。處理劑量：常用照射時(shí)間或死亡率作為相對(duì)劑量。紫外誘變方法 由于微生物接受的照射劑量與燈的功率、照射距離、照射時(shí)間、菌液濃度、菌液厚度、細(xì)胞本身特性等因素有關(guān)，所以單純用時(shí)間表示照射劑量并不完全可靠。一定的死亡率必定對(duì)應(yīng)一定的照射劑量，所以，在實(shí)

20、際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。 通常先繪制照射時(shí)間與死亡率的關(guān)系曲線，然后選擇合適的劑量。 生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量： 死亡率為70%80%左右。二、突變和育種（一）自發(fā)突變與育種生產(chǎn)過程中，微生物會(huì)以一定頻率發(fā)生自發(fā)突變。富于實(shí)際經(jīng)驗(yàn)的人們就可以及時(shí)抓住這類良機(jī)來選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。育種工作者都希望自己能在最短的時(shí)間內(nèi)培育出比較理想的變異株，因此，定向培育是微生物工作者長(zhǎng)期來的一種理想。定向培育一般指用某一特定因素長(zhǎng)期處理某微生物的群體，以達(dá)到累積并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變株的目的。這是一種古老的育種方法，與誘變育種、雜交育種尤其是與基因工程等現(xiàn)代育種技術(shù)相比，定向培育帶有守株待兔式的被動(dòng)狀態(tài)

21、。是用物理或化學(xué)的誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞群，在促進(jìn)其突變率顯著提高的基礎(chǔ)上，使誘變對(duì)象內(nèi)的遺傳物質(zhì)（DNA）的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。 誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義。當(dāng)前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株，幾乎毫無例外地都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的。（二）誘變育種斜面/肉湯培養(yǎng)單孢子/單細(xì)胞懸液誘變劑處理平板分離移至斜面初篩計(jì)算存活率觀察形態(tài)變異，挑單菌落小試中試復(fù)篩良種保藏原始菌種純化原菌種特性鑒定誘變育種的步驟：選擇選擇合適的出發(fā)菌株制備待處理的菌懸液誘變處理篩選誘變育種工作中應(yīng)考慮的幾個(gè)原則 出發(fā)菌株用

22、來育種處理的起始菌株出發(fā)菌株應(yīng)具備： 對(duì)誘變劑的敏感性高； 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； 出發(fā)菌株的來源； 自然界直接分離到的野生型菌株： 歷經(jīng)生產(chǎn)考驗(yàn)的菌株： 已經(jīng)歷多次育種處理的菌株1.出發(fā)菌株（original strain）的選擇：要求： 菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)； 細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，以避免表型遲延現(xiàn)象（phenotypic lag）;表型遲延現(xiàn)象:指某一突變?cè)贒NA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在表型上顯示出來，造成不純的菌落。方法： 玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐溫80（表面活性劑） 用無菌脫脂棉過濾。2.處理單細(xì)胞或單孢子懸液3. 誘變處理選擇簡(jiǎn)便有效的誘變劑

23、 在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。誘變劑的作用 提高突變的頻率 擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度 使產(chǎn)量變異朝著正突變或負(fù)突變移動(dòng)劑量的表示法致死率是最好的誘變劑相對(duì)劑量的表示方法。 單一因子處理： 復(fù)合因子處理： 兩種以上因素先后使用 同時(shí)使用 單一因子重復(fù)使用最適劑量的選擇產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在7080%）誘變處理方式4. 菌種篩選（1） 篩選方案：實(shí)際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復(fù)篩兩步進(jìn)行。初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)；因此，初篩工作以量為主，測(cè)定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡(jiǎn)單。復(fù)篩的目的：確認(rèn)符合要求的菌株；復(fù)篩以質(zhì)為主，應(yīng)精確測(cè)定每個(gè)菌株的生產(chǎn)指標(biāo)。篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟.5個(gè)出發(fā)菌株 選出50株 選出5株第一輪：一個(gè)出發(fā)菌株選出200個(gè)菌株選出50株選出5株 誘變處理 初篩（每株一瓶）復(fù)篩（每株四瓶）40株40株40株40株40株 誘變處理初篩復(fù)篩（每株一瓶）（每株四瓶）復(fù)篩第二輪：特殊變異菌的篩選方法1、產(chǎn)量突變株的篩選（瓊脂塊培養(yǎng)法） 誘變后的分生孢