銅鋅SOD的分離純化與活性鑒定

1、銅鋅SOD的分離純化與活性鑒定【實驗導(dǎo)讀】蛋白質(zhì)的提取分離技術(shù)是化學(xué)生物學(xué)研究者應(yīng)該熟練掌握的重點技術(shù)之一。蛋白質(zhì)的純化步驟應(yīng)根據(jù)純化蛋白的具體性質(zhì)來設(shè)計?？梢岳玫降男再|(zhì)包括蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的等電點、對有機溶劑的耐受性、對溫度的耐受性、中性無機鹽對蛋白質(zhì)溶解性的影響等等。為了保證蛋白質(zhì)提取分離純化的成功，需要在整個實驗過程中，對所得蛋白質(zhì)的總量和活性進行不斷監(jiān)測。SOD是超氧化物歧化酶的簡稱，是一個典型的酶類蛋白質(zhì)。它催化超氧化物的歧化反應(yīng)，是真核生物細胞內(nèi)抗氧化酶系的重要組成部分。它能夠耐受相對較高的溫度、對有機溶劑丙酮和氯仿-乙醇也具有較好的耐受性。利用這些性質(zhì)，本實驗通過一些

2、列實驗流程達到了對大蒜SOD進行初步純化的目的。每經(jīng)過一個純化步驟，本實驗都將監(jiān)測所得產(chǎn)物的總蛋白量以及總SOD活性，并計算SOD酶在總蛋白中的比活力（總SOD活性與總蛋白量之比）。如果分離純化過程是成功的，則總蛋白量應(yīng)不斷下降，而SOD酶的比活力應(yīng)不斷上升。通過本實驗的訓(xùn)練，讀者應(yīng)該能夠初步掌握蛋白質(zhì)的純化流程，根據(jù)所給蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)設(shè)計出一套比較合理的蛋白質(zhì)純化方案。 實驗?zāi)康?.進一步熟悉掌握分光光度計的使用方.2.熟悉SOD提取與分離的基本原理與操作方法，學(xué)習(xí)一般蛋白質(zhì)純化的基本流程.3.掌握考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)含量的基本原理與操作.4.了解SOD活力測定鄰苯三酚法的原理.基本

3、原理 對于以氧氣作為呼吸作用最終電子受體的生物來說，除將氧氣還原為其完全還原產(chǎn)物水以外，還有可能產(chǎn)生包括超氧負(fù)離子(O2-)在內(nèi)的一系列不完全還原產(chǎn)物，這類分子統(tǒng)稱為活性氧族(reactive oxygen species, ROS)。ROS具有極強的化學(xué)反應(yīng)活性，可以與蛋白質(zhì)、脂類、核酸等生物大分子發(fā)生反應(yīng)并破壞它們的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。ROS在細胞內(nèi)聚集將對細胞的正常生命活動造成不良后果。為了應(yīng)對這一潛在的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，細胞內(nèi)形成了一套有效的ROS清除系統(tǒng)。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)是細胞內(nèi)ROS清除系統(tǒng)的重要組分之一。SOD廣泛存在于動植物及微生物體內(nèi)，

4、可催化細胞內(nèi)超氧負(fù)離子(O2-)的歧化反應(yīng)，將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和O2。因此，SOD具有強烈的抗氧化活性，在化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。本實驗介紹的是一種SOD初步純化方法。SOD是一種多聚體金屬蛋白，根據(jù)酶活性中心所需金屬輔基的不同，可將SOD進一步分為Fe-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和Ni-SOD4種，這四種不同的SOD分別由不同的基因編碼。無論是在原核還是真核生物當(dāng)中，SOD基因的表達都處于體內(nèi)外各種因素的嚴(yán)密調(diào)控之下。原核生物SOD基因的表達調(diào)控主要受其生長營養(yǎng)條件以及所處環(huán)境的影響。而在真核生物細胞內(nèi)，SOD基因的表達調(diào)控則與動植物的生長發(fā)育階段與

5、體內(nèi)各種激素水平有關(guān)1。Cu/Zn-SOD 主要存在于真核生物與細菌的細胞質(zhì)中。在細菌、植物和動物中，Cu/Zn-SOD 的編碼基因序列保守性較低，這可能與不同生物適應(yīng)環(huán)境的機制不盡相同有關(guān)。Mn-SOD主要存在于原核生物和真核生物的線粒體中。Fe-SOD存在于原核生物和少數(shù)植物中，在原核生物和植物葉綠體中編碼Fe-SOD的基因序列相似性很高2。Ni-SOD的發(fā)現(xiàn)則相對較晚，主要存在于一些低等生物中，在植物中尚沒有被發(fā)現(xiàn)3。天然存在的這些SOD，雖然活性中心所需的金屬離子不同,但催化活性部位卻具有高度的結(jié)構(gòu)同一性和進化的保守性。即活性中心金屬離子都是與3到4個組氨酸(His)殘基的咪唑基（Mn

6、-SOD含1個天門冬氨酸羧基配位）呈畸變的四方錐或扭曲的四面體配位。三種SOD的主要性質(zhì)比較見下表。三種SOD的主要理化性質(zhì)比較Cu/Zn-SODMn-SODFe-SOD分子結(jié)構(gòu)二或四聚體二或四聚體二或四聚體分子量32000, 6500042000, 8500042000, 85000每個亞基金屬含量1Cu:1Zn0.51Mn0.51Fe顏色藍綠色紫紅色黃褐色特征吸收峰260 nm, 680 nm280 nm, 475 nm280 nm分子構(gòu)象主要為-折疊主要為-螺旋主要為-螺旋抑制劑CN-、H2O2氯仿-乙醇氯仿-乙醇、H2O2Cu/Zn-SOD是分布最廣而且是最重要的SOD，主要存在于真核

7、細胞的細胞漿內(nèi)，分子量約為32 KD，通常情況下由兩個亞基組成。Cu/Zn-SOD對熱、pH以及某些比較極端的理化因素具有有較強的耐受性。比如，即使經(jīng)60短時間處理后酶的活性幾乎無損失；同時，酶活性不受有機溶劑乙醇和氯仿影響。大蒜蒜瓣內(nèi)含有較豐富的Cu/Zn-SOD，通過組織破碎后，可溶解于pH7.8磷酸緩沖液中。由于該酶不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。Cu/Zn-SOD 對氯仿-乙醇混合液不敏感，即使用這種混合溶劑處理酶液12個小時，該酶的活性都沒有明顯的變化4。故此可利用氯仿-乙醇混合液可作為萃取劑，將Cu/Zn-SOD溶解于其中，并將雜蛋白沉淀出來。在高濃度的電解質(zhì)溶液中，蛋白質(zhì)分子表

8、面的水化層被破壞。這樣，蛋白質(zhì)分子中的憎水區(qū)域暴露出來并導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱之為“鹽析”。不同蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析所需的電解質(zhì)濃度不同，因此可以通過分級鹽析，達到Cu/Zn-SOD初步純化的目的。具體說來，當(dāng)植物Cu/Zn-SOD粗提液中硫酸銨的濃度達到50%飽和濃度時，很多雜蛋白都會沉淀下來，而Cu/Zn-SOD仍表現(xiàn)為可溶的狀態(tài)，此時可以除去已經(jīng)析出的雜質(zhì)蛋白。當(dāng)鹽濃度達到90%后，Cu/Zn-SOD的溶解度下降而析出，此時可以收集沉淀、復(fù)溶、透析脫鹽來獲得比較純的Cu/Zn-SOD蛋白5。在蛋白質(zhì)純化的過程中，需要不斷對所得的蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì)含量進行監(jiān)測，這就涉及到蛋白質(zhì)的定

9、量操作。常用的蛋白質(zhì)定量方法是考馬斯亮蘭染色法。染料考馬斯亮藍可以與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域相結(jié)合，這種結(jié)合具有高度的敏感性與選擇性（只與蛋白質(zhì)分子結(jié)合而不與其它物質(zhì)結(jié)合）?？捡R斯亮蘭G-250染液的最大光吸收峰在465 nm處，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時，其最大吸收峰改變?yōu)?95 nm。此吸光度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的量保持線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)的定量分析。由于超氧自由基是不穩(wěn)定的自由基，壽命極短，故一般采用鄰苯三酚法自氧化法來間接測定SOD的活性。其基本原理介紹如下。在堿性條件下，鄰苯三酚會迅速自氧化生成有色中間產(chǎn)物，同時生成超氧負(fù)離子，中間產(chǎn)物在325nm和420nm波長處均有強烈的光吸收。

10、鄰苯三酚的自氧化速率與超氧負(fù)離子濃度有關(guān) ，當(dāng)加入SOD時，超氧負(fù)離子濃度降低，從而抑制鄰苯三酚的自氧化，并阻止有色中間產(chǎn)物的積累。抑制的程度可以通過檢測反應(yīng)體系的光密度來推算。因此，可通過檢測SOD對這個反應(yīng)的抑制程度來間接測定SOD活力。三、儀器與藥品主要材料：新鮮蒜瓣。藥品：醫(yī)用生理鹽水、蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)、考馬斯藍染液、Tris、EDTA、HCl、氯仿、乙醇、丙酮、磷酸二氫鈉（小分子化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純）。儀器：離心機、分光光度計、研缽、玻棒、燒杯、量筒、膠頭滴管、電子天平、移液管、移液器、pH試紙、試管、 吸管、普通比色杯等。四、實驗方法實驗步驟（一）溶液配制A液：

11、稱取1.2114 g Tris和37.2 mg EDTA-2Na溶于62.4 ml 0.1 mol/L的鹽酸中，調(diào)pH = 8.2，用蒸餾水定容至100 mL。B液：稱取鄰苯三酚56.7 mg溶于少量10 mmol/L鹽酸中，并定容到100 mL。C液：3.9 g NaH2PO4H2O溶于500 mL水中。D液：8.955 g Na2HPO412H2O溶于500ml水中。E液：8.5 mL C液 + 91.5 mL D液。氯仿-乙醇混合液：氯仿:無水乙醇體積比為3:5。（二）酶的提取1.組織細胞破碎：稱取5 g大蒜蒜瓣，置于研缽中充分研磨，使組織和細胞破碎。2.向破碎后的組織中加入2至3倍體積

12、的E液，繼續(xù)研磨至漿狀，靜置20 min，使Cu/Zn-SOD充分溶解入液相。將提取物于5000 rpm下離心15 min，取上清液，得總提取液。3.氯仿乙醇混合液提取除雜蛋白：向上清液加入0.25倍體積的氯仿-乙醇混合液，充分?jǐn)嚢?5 min，5000 rpm離心15 min，取上清液，即為粗酶液1。4.丙酮提取與復(fù)溶：在粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15 min，5000 rpm離心15 min，棄去上清，得Cu/Zn-SOD沉淀。將沉淀溶于適量E液中，即得粗酶液2。5.熱處理除雜質(zhì)：將粗酶液2于55至60熱處理15 min，流水冷卻。5000 rpm離心15 min，取上清液，即得SO

13、D酶液。（三）蛋白定量1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制l mgmL的標(biāo)準(zhǔn)BSA蛋白溶液，制備系列稀釋液，其濃度分別為1000、500、250、125、62.5、和31.25 g/mL。取1.5毫升離心管6個，每管加入考馬斯亮藍染液1 mL和蛋白稀釋液2 L。以不加蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的考馬斯藍染液調(diào)零，分別測定以上6管溶液在595 nm處的吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.未知樣品的測定：取總提取液、粗酶液1、粗酶液2和SOD酶液，同法操作，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算以上四種蛋白溶液中蛋白質(zhì)的濃度。（四）酶活性分析 將上述總提取液、粗酶液1、粗酶液2和SOD酶液分別取樣，依下表制備反應(yīng)混合物（對每一個樣品，制備一組反應(yīng)混合物）

14、。測4個樣品，需要配制8管反應(yīng)混合物。試劑1號管（對照管）2號管（反應(yīng)管）A液/ml1.51.5待測樣品/ml00.1蒸餾水0.90.8混合均勻后靜止，室溫放置20 minB液/ml0.10.1OD值室溫放置20分鐘后，加入鄰苯三酚（B液）迅速混勻，準(zhǔn)確計時4 min，每管加一滴濃鹽酸停止反應(yīng)，在420 nm處測吸光值（OD值）。則每組反應(yīng)體系中SOD的活性可以用OD1-OD2來表示，將此定義為0.1毫升酶液中SOD的活性單位。據(jù)此計算每管樣品中的酶的總活力和比活力：總活力 = 0.1毫升酶液中SOD的活性單位 （酶液總體積 / 0.1 mL）比活力 = 酶的總活力 / 酶液中的蛋白總量最后計

15、算本次純化過程的Cu/Zn-SOD酶回收率，即為最后得到的SOD酶液中Cu/Zn-SOD總活力與起始總提取液中的Cu/Zn-SOD總活力之比。結(jié)果與討論思考本實驗中需要記錄的數(shù)據(jù)，設(shè)計合適的表格記錄數(shù)據(jù)并對數(shù)據(jù)加以分析。在本實驗中，總提取液、粗酶液1、粗酶液2和SOD酶液四種不同酶液總活力和比活力的變化趨勢是怎樣的？為什么？你對你此次實驗的酶回收率是否滿意？如果滿意，成功的經(jīng)驗是什么？如果不滿意，試總結(jié)可能的原因五、實驗注意事項與思考題1.酶液提取時，為了盡可能保持酶的活性，盡可能在冰浴中研磨，在低溫中離心。2.鄰苯三酚容易被氧化，故操作時要盡量快。3.實驗中所提取到的提取液、粗酶液、酶液在未

16、使用前最好將其先放在冰箱內(nèi)，因為在低溫下能降低酶的活性，防止酶活損失，如果一直放在室內(nèi)會導(dǎo)致酶活損失，使所計算得到的酶活偏低。4.在測定各管樣品中SOD活性時，要盡可能保證酶促反應(yīng)進行的時間是一致的。因此，先加酶開始反應(yīng)的反應(yīng)體系應(yīng)該被先停止。5.除了考馬斯亮藍結(jié)合法之外，測定蛋白值濃度的方法還有哪些？相比較之下，考馬斯亮藍結(jié)合法測定蛋白質(zhì)濃度有何優(yōu)缺點。6.如果想檢測隨著純化過程的深入，獲得的酶液中蛋白質(zhì)種類的個數(shù)是否有變化，應(yīng)該采用什么試驗技術(shù)手段來解決？預(yù)期的實驗結(jié)果是什么？7.哺乳動物（以小鼠為例）各個不同的器官中Cu/Zn-SOD的比活力是否相同？設(shè)計實驗驗證你的猜想。六、參考文獻1馬曉麗.超氧化物歧