第三代基因測序技術比較與總結

1、第三代基因測序技術比較與總結摘要在第二代測序技術的協(xié)助下，個人基因組圖譜正在如火如荼地繪制中。在第二代測序技術的協(xié)助下，個人基因組圖譜正在如火如荼地繪制中。但第二代測序技術很快就遇上了強勁的對手一一第三代測序技術，也被稱為“下、下一代 的測序(n ext -n ext- gen eratio n seque ncin g) ”。第三代測序技術是基于納 米孔(nanopore)的單分子讀取技術，有著更快的數(shù)據(jù)讀取速度，應用潛能也勢必 超越測序。2012年2月5日，基因組科學家們齊聚美國佛羅里達州的基因組生物和技術進展會議，來了解哪家公司的第三代測序技術能實現(xiàn)人類基因組的3分鐘測序或以5000美元

2、的價格出售。盡管科學家們對公布的數(shù)據(jù)表示謹慎樂觀，但他們 對于此類測序儀的優(yōu)越之處仍心存疑慮。Complete Geno mics在2008年10月，美國加利福尼亞州的 Complete Genomics公司曾宣稱他們 將在2009年以5000美元的價格售賣人類基因組，但當時沒有公布支持數(shù)據(jù)。在 這次會議上，該公司公布了一個人類基因組，據(jù)稱是用9臺儀器在8天內完成的。該公司的CEO Clifford Reid 表示，他們將254GB的數(shù)據(jù)拼接成草圖，覆 蓋某個匿名男性基因組的92%每個堿基平均讀取了 91次。與目前應用中的高 速測序，即第二代測序類 似，Complete Genomics也產(chǎn)生

3、短的DNA賣長。通過 對每個堿基的多次測序，它的目標是排除悄悄混入的可能錯誤。Reid認為這項技術非常準確，堿基錯誤的概率低 于0.33%。這與目前的測序儀相當。Complete Gen omics并不出售測序儀，但用自己的測序儀來完成所有的內部 工作。這讓某些科學家質疑，但另一些卻深受鼓舞。速度和費用成為Complete Genomics的最大賣點。該公司并沒有透露基因組 測序的確切費用，但據(jù)稱每個基因組的原材料費用低至 1000美元。它的目標是 在上個月推出市場，今年對1000個基因組進行測序，明年測序數(shù)量達到 20000 個。Pacific Bioscie nces在Complete G

4、enomics做報告前的一小時，Pacific Biosciences的首席技術官Stephen Turner展示了大腸桿菌的完整基因組，并稱每個堿基的平均讀取 了 38次，準確率大于99.9999%。Pacific Biosciences利用了單分子技術和DNA聚合酶，在反應的同時讀取 測序產(chǎn)物。盡管目前儀器的讀取速度僅為 3堿基/秒，但它的目標是在2013年 前實現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。它還有望實現(xiàn)更長的讀長。 Tuner表示大腸桿菌 基因組的平均讀長是586 bp,有些能達到2805 bp。某些科學家期望長讀長能排 除錯誤，讓他們了解到難以讀取的部分。Pacific Bioscience

5、s 打算在明年正式推向市場。同時,目前的測序技術, 如lllumina、Applied Biosystems 和Roche也正以驚人的速度制造數(shù)據(jù)，在單 次幾天的運行中產(chǎn)生相當于多個人類基因組的數(shù)據(jù)。 速率不斷增長的同時, 費用 也在下降。例 如， lllumina 在會議中表示它在今年年底能實現(xiàn) 10000美元的人 類基因組測序。要實現(xiàn)單分子實時測序，有三個關鍵的技術。第一個是熒光標記的脫氧核苷酸。 顯微鏡現(xiàn)在再厲害， 也不可能真的實時看 到“單分子”。 但是它可以實時記錄熒光的強度變化。 當熒光標記的脫氧核苷酸 被摻 入DNA鏈的時候，它的熒光就同時能在 DNA鏈上探測到。當它與DNA鏈形

6、 成化學鍵的時候，它的熒光基團就被DNA聚合酶切除，熒光消失。這種熒光標記 的脫 氧核苷酸不會影響DNA聚合酶的活性，并且在熒光被切除之后，合成的DNA 鏈和天然的DNA鏈完全一樣。第二個是納米微孔。因為在顯微鏡實時記錄 DNAg上的熒光的時候，DNA鏈 周圍的眾多的熒光標記的脫氧核苷酸形成了非常強大的熒光背景。 這種強大的熒 光背景使單分子的熒光探測成為不可能。 Pacific Biosciences 公司發(fā)明了一種 直徑只有幾十納米的納米孔zero-mode waveguides (ZMWs)，單分子的DNA聚 合酶被固定在這個孔內。在這么小的孔內，DNA鏈周圍的熒光標記的脫氧核苷酸 有限

7、，而且由于A, T，C, G這四種熒光標 記的脫氧核苷酸非?？焖俚貜耐饷孢M 入到孔內又出去， 它們形成了非常穩(wěn)定的背景熒光信號。 而當某一種熒光標記的 脫氧核苷酸被摻入到DNA鏈時，這種特定顏色 的熒光會持續(xù)一小段時間，直到 新的化學鍵形成，熒光基團被 DNA聚合酶切除為止(見圖)。第三個是共聚焦顯微鏡實時地快速地對集成在板上的無數(shù)的納米小孔同時 進行記錄。由于我對顯微原理的物理知識匱乏，而 Pacific Biosciences 公司又 沒有非常強調在這方面的發(fā)明，不做進一步探討。他們還對這一技術進行進一步的優(yōu)化。第一個是把雙鏈DNA環(huán)化反復測序。人們可以在雙鏈DNA勺兩頭連上發(fā)夾結 構的D

8、NAadaptor，從而使DNA環(huán)化。而DNA聚合酶就能夠以環(huán)化的DNA乍為模 板滾環(huán)復制，反復測一段DNA序列。這種反復測序，糾正了偶爾出現(xiàn)的復制錯 誤， 從而使測序精度非常高。第二個是激發(fā)光中斷測序法。DNA聚合酶雖然很穩(wěn)定，但是在強大的激發(fā)光 乍用下酶也是有一定壽命的。如果把激發(fā)光中斷一段時間，在這段時間內 DNA 聚合酶繼續(xù)復制DNA當激發(fā)光重新開啟以后，人們就可以測到長 DNA1后面的 序列。第三代測序技術非?？膳隆?它實現(xiàn)了 DNA聚合酶內在自身的反應速度， 一秒可以測10個堿基，測序速度是化學法測序的2萬倍。2、它實現(xiàn)了 DNA聚合 酶內在自身的processivity（延續(xù)性，

9、也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基， 但 是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。 這為基因組的重復序列的拼接提供了非常 好的條件。 3、它的精度非常高，達到 99.9999% 。此外，它還有兩個應用是二代測序所不具備的第一個是直接測RNA的序列。既然DNA聚合酶能夠實時觀測，那么以 RNA 為模板復制DNA的逆轉錄酶也同樣可以。RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉 錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。第二個是直接測甲基化的 DNA序列。實際上DNA聚合酶復制A、T、C、G的 速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不

10、同。 根據(jù)這個不同的時間，可以判斷模板的 C是否甲基化。Pacific Biosciences 公司預計 2010 年或者 2011年就會推出商業(yè)化的測序 儀器。在不遠的將來， 如果他們能和二代測序一樣集成 100萬個納米微孔， 那 么 一臺儀器 15 分鐘就能夠準確地測出一個人的基因組。以后每個人的基因組測序 成本將變成 100美元，人人都可以消費得起。想想人類基因組計劃耗資 30億美 元，費時十幾年，無數(shù)科學家參與其中，技術的革新意義是多么重大啊 !Helicos Biosciences并不是每家測序公司都這么幸運。 Helicos Biosciences 制造的第三代測序 儀就被測序錯誤

11、所困擾。就在會議前幾天， Helicos 透露它的第一名顧客已經(jīng)將 測序儀退還。在這次會議上，該公 司表示它已經(jīng)拼接了線蟲的基因組。但是它 的歷史問題和高昂的儀器費用，即使降低至 99.9999 萬美元，與其他測序儀的 50萬美元左右的價格相比，仍然讓 許多科學家望而卻步。在會議前的研討會上，來自多倫多安大略癌癥研究所的 John McPherson 說 出了大家的心聲：“ Helicos 是單分子測序的先鋒，但我認為他們還沒有達到預 定的目標?！钡?Helicos 的首席技術官 William Efcavitch 卻不認同這種說法， “關于我們不行的傳聞太夸張了”。許多科學家希望他是對的，

12、他們期待著 Helicos 與其他公司繼續(xù)競爭， 以更 低的價格獲得更多的數(shù)據(jù)。 一位科學家表示： “這種競爭是良性的。 無論這些公 司干得多好，我們都期望更多?！被诩{米孔的單分子讀取技術， 英國牛津納米孔公司成功研發(fā)出第三代基因 測序技術。 該測序技術讀取數(shù)據(jù)更快、 有望大大降低測序成本， 改變個人醫(yī)療的 前景。當前，基因測序工作費時且昂貴，測序時，分子必須進行多次復制 （ 這一步 被稱為擴增 ） ，同時進行熒光示蹤標記，這一過程會帶來錯誤，因此，一個基因 要被測序多次才能得到值得信賴的結果。 此外，購買和操作測序儀器的費用也不 菲，目前，測定一個完整的基因組需要上萬美元。在納米孔測序技術

13、中，DNA分子依靠被稱為核酸外切酶的蛋白質以一次一個 堿基的速度通過小孔。這個酶能清楚地區(qū)分出4個DNA堿基編碼：A、C、G T,也可以檢測出該堿基是否被甲基化，一個單孔能在大約 70 天左右測定一個完整 的基因序列。納米孔技術不需要熒光標記物并且很可能不需要進行擴增，能直接并快速“讀”出DNA同時足夠廉價，使進行大量重復實驗成為可能。納米孔公司已經(jīng)研發(fā)出包含幾百個納米孔的芯片， 該芯片可以用在一臺機器 上，快速且廉價地給大量 DNA進行排序?；驕y序于上世紀70年代由弗雷德桑格爾發(fā)明，他因此獲得了諾貝爾獎， 第一份人類基因草圖于 2001年繪制成功，花費了 40億美元。納米孔公司總裁戈登桑赫

14、納說，該技術預示了基因測序領域的一個跳躍變 化，花費不到 1000美元就可以完成一個基因測序。 借助該技術， 在未來 5 年內， 測序費用將有可能降至 500美元。到那時，基因測序可以成為英國國民健康保險 制度的一部分，民營保險公司也支付得起。該技術也可以讓醫(yī)生使用DNA來預測 并且預防諸如心臟病、糖尿病等疾病，更加有效地開藥。世界著名基因測序公司lllumi na的總裁杰伊弗拉特利稱，10年后，每一 個新生嬰兒都會被“配備”完整的基因排序，費用不超過 5000美元。最早的 Sanger 測序在人類基因組計劃中立下赫赫戰(zhàn)功，但也給基因組測序 貼上了數(shù)億美元的價格標簽，讓人生畏。這兩年發(fā)展迅猛的

15、第二代測序儀 lllumina 的 GenomeAnalyzer、Roche454 的 GS系列以及 ABI 的 SOLiD系統(tǒng)讓人類基因組重測序的費用蹭地降低到 10萬美元以下?，F(xiàn)在，能對單個 DNA分 子進行測序的第三代測序儀也 加入到這場比賽中，讓競爭更加激烈。目前，第三代測序主要有三種技術平臺。 兩種通過摻入并檢測熒光標記的核 苷酸，來實現(xiàn)單分子測序。 Helicos 的遺傳分析系統(tǒng)已上市，而 Pacific Biosciences準備在明年推出單分子實時（SMRT技術。第三種 Oxford Nanopore 的納米孔 （nanopore） 測序還尚未有推出的時間表， 但有可能是這三種

16、當中最便宜 的。納米孔測序的優(yōu)勢在于它不需要對 DNA進行標 記，也就省去了昂貴的熒光 試劑和CCD照相機。最近， Oxford Nanopore Technologies 的 Hagan Bayley 及他的研究小組正 致力于改善納米孔。根據(jù)他們之前的工作，他們以a-溶血素來設計納米孔，并將環(huán)式糊精共價結合在孔的內側（下圖）。當核酸外 切酶消化單鏈DNA后，單個 堿基落入孔中， 它們瞬間與環(huán)式糊精相互作用， 并阻礙了穿過孔中的電流。 每個 堿基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的電流振 幅，因此很容易轉化成DNA 序列。每個堿基也有特有的平均停留時間， 它的解離速率常數(shù)是電壓依賴的， +180 mV的電位能確保堿基從孔的另一側離開。a-溶血素納米孔（剖面圖）以及共價結合的環(huán)式糊精（淺藍色）瞬間結合落入 孔中的堿基 （紅色）。以往對甲基胞嘧啶進行測序， 都要先進行重亞硫酸鹽轉化， 而納米孔技術能 直接讀出這第五種堿基。這對表觀基因組測序的研究人員來說可謂是個好消息。納米孔測序預計能滿足大部分測序用戶的需求： 99.8%的準確性相當高，且 錯誤很容易通過計算來糾正。 均