人I型膠原ColⅠELISA試劑盒組成說明書

1、人I型膠原（Col-I）ELISA試劑盒組成說明書本試劑僅供研究利用目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中人I型膠原（Col-1）的含量實驗原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人I型膠原（Col-I）水平。用純化的人I型膠原（Col-I）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入I型膠原（Col-I）,再與HRP標記的I型膠原（Col-I）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，通過完全洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色白深淺和樣品中的I型膠原（Col-I）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光

2、度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人I型膠原（Col-I）含量。試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1個1個酶標包被板1X481X962-8C保存標準品：45閔/LX1瓶X1瓶2-8C保存標準品稀釋液X1瓶X1瓶2-8C保存酶標試劑3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存樣品稀釋液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存顯色劑A液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存顯色劑B液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存終止液3mlx1瓶6mlx1瓶2-8C保存20倍濃縮洗滌液20mlx1瓶30mlx1瓶2-8C保存樣本處置及要求：.血清：室溫血液自

3、然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認真搜集上清，保留進程中如顯現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。.血漿：應(yīng)依照標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認真搜集上清，保留進程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。.尿液：用無菌管搜集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認真搜集上清，保留進程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參如實行。.細胞培育上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管搜集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認真搜集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（）稀釋細胞懸液，細胞濃度

4、達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認真搜集上清。保留進程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入必然量的PBS，。用液氮迅速冷凍保留備用。標本融化后仍然維持2-8的溫度。加入必然量的PBS（），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。認真搜集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。.標本搜集后及早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。假設(shè)不能馬上進行實驗，可將標本放于-20保留，但應(yīng)幸免反復(fù)凍融.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過

5、氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔，在第一、第二孔中別離加標準品100出然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液504,混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100d別離加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔別離加標準品稀釋液50小混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50M棄掉，再各取50M別離加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中別離加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50M別離加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中別離加標準品稀釋液50出混勻后從第七、第八孔中別離取50M加到第九、第十孔中，再在第九第十孔別離加標準品稀釋液50口，混勻后

6、從第九第十孔中各取50M棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50小濃度別離為300L,20聞/L,10聞/L,5L,聞/L）。加樣：別離設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40小然后再加待測樣品10口（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡可能不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37溫育30分鐘。配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌：警惕揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50口，空白孔除外。 TOC o 1-5

7、h z 溫育：操作同3。洗滌：操作同5。顯色：每孔先加入顯色劑A50U,再加入顯色劑B50M,輕輕震蕩混勻，37c避光顯色15分鐘.終止：每孔加終止液50聞終止反映（現(xiàn)在藍色立轉(zhuǎn)黃色）。.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘之內(nèi)進行。注意事項：試劑盒從冷藏環(huán)境中掏出應(yīng)在室溫平穩(wěn)15-30分鐘后方可利用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保留。濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不阻礙結(jié)果。各步加樣均應(yīng)利用加樣器，并常常校對其準確性，以幸免實驗誤差。一次加樣時刻最好操縱在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦利用排槍加

8、樣。請每次測定的同時做標準曲線，最好做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量太高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋必然倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX5）o封板膜只限一次性利用，以幸免交叉污染。底物請避光保留。.嚴格依照說明書的操作進行，實驗結(jié)果判定必需以酶標儀讀數(shù)為準8.所有樣品，洗滌液和各類廢棄物都應(yīng)按傳染物處置。.本試劑不同批號組分不得混用。.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。計算：以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在座標紙上繪出標準曲線，依照樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代