(三)原生質體融合課件

1、原生質體育種Weibull等于1953年首次用溶菌酶處理巨大芽孢桿菌細胞獲得原生質體，并首次提出原生質體的概念。Mcquillen于1955年首次發(fā)現(xiàn)巨大芽孢桿菌原生質體再生方法。1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學討論會上提出原生質體融合。與正常細胞相比，原生質體具有一些新的獨特的特性 1、由于去除了細胞壁，對外界環(huán)境影響更加敏感，對誘變劑的誘變效應也更為強烈。2、破壁后細胞表面的受體和噬菌體的結合部位相應不存在，失去對噬菌體的敏感性。3、由于解除了遺傳物質的最大屏障細胞壁，也不受感受態(tài)的影響，可進行原生質體轉化和融合等基因重組。以微生物原生質體育種的常見的育種方法有：一、原生質體再生育種二

2、、原生質體誘變育種三、原生質體轉化育種四、原生質體融合育種一、原生質體再生育種1、定義：制備原生質體直接再生篩選高產變異株完整細胞原生質體原生質體完整細胞2、產生比常規(guī)誘變還高的正變率，其原因有以下方面：（1）原生質體比較敏感，制備和再生過程中的各種化合物及環(huán)境中的物理因子對染色體或質粒DNA都有一定誘變效應。（2）原生質體再生本質上是細胞壁重建和分裂能力的恢復的過程，再生的細胞壁在組成和結構上發(fā)生變化，甚至于產生有利于細胞代謝產物分泌的變異。（3）（4）原生質體再生材料無需經過遺傳標記，減少了對菌株的損傷和優(yōu)良性狀的菌株。常規(guī)誘變育種選用材料為孢子，這些休眠體對誘變劑比較遲鈍，獲得的大部分為

3、負變株，而制備原生質體的出發(fā)材料一般為對數(shù)期的細胞，活力較強，對環(huán)境和誘變劑較為敏感， 破壁和再生過程中又淘汰了大量弱勢菌株， 能再生的菌株不論初級代謝與次級代謝過程均較活躍，故高產優(yōu)質菌株比例比較大3、實例： 弗氏鏈霉菌再生后，泰樂菌素產量提高3倍 產二素鏈霉菌再生后，螺旋霉素產量提高2倍 原因可能為13%-85%的質粒脫落， 解除抗生素 的調節(jié)機制。4、原生質體再生育種一般程序 出發(fā)菌株的選擇 菌株的活化和預培養(yǎng) 原生質體的制備 原生質體再生 高產菌株分離 復篩菌種特性和發(fā)酵性能研究遺傳穩(wěn)定性鑒定二、原生質體誘變育種1、定義： 以微生物原生質體為原料，物理化學誘變劑處理，再生培養(yǎng)基再生，從

4、中篩選高產菌株。2、原生質體作為誘變材料的優(yōu)點 單孢子壁結構致密牢固，不利于誘變劑向核內滲透。 孢子代謝緩慢，造成基因突變頻率較低或因表型延遲而漏篩。3、原生質體誘變一般程序 10ml對數(shù)期微生物培養(yǎng)為離心收集菌體 沉淀物用酶液懸浮水解去壁制成原生質體 高滲溶液洗滌原生質體原生質體稀釋后取適量放入無菌培養(yǎng)皿 培養(yǎng)皿移至紫外燈下誘變 再生培養(yǎng)基再生培養(yǎng)菌種特性和發(fā)酵性能研究分離優(yōu)質菌株并遺傳穩(wěn)定性鑒定出發(fā)菌株的培養(yǎng)和原生質體制備選擇合適的化學誘變劑，配制成合適的濃度加入原生質體懸浮液（含高滲溶液）誘變處理再生培養(yǎng)基再生培養(yǎng)菌種特性和發(fā)酵性能研究分離優(yōu)質菌株并遺傳穩(wěn)定性鑒定離心棄誘變劑、原生質體用

5、穩(wěn)定液洗滌三、原生質體轉化育種1、轉化 染色體DNA或其他線狀染色體轉化原生質體效率低，質粒DNA具有高頻轉化率。2、影響原生質體轉化的因素融合促進劑PEG來源、批號及聚合度。制備原生質體的菌絲年齡、菌絲生長條件、原生質體再生條件。轉化時，質粒及原生質體的濃度。再生培養(yǎng)基的組成。4、原生質體轉化一般程序 對數(shù)期微生物培養(yǎng)為離心收集菌體 沉淀物用酶液懸浮水解去壁制成原生質體 高滲溶液洗滌原生質體、2倍SMM濃縮液、質粒DNA、40%PEG混合2min，離心 再生培養(yǎng)基再生培養(yǎng)菌種特性和發(fā)酵性能研究分離優(yōu)質菌株并遺傳穩(wěn)定性鑒定原生質體融合（protoplast fusion）20世紀70年代發(fā)展起

6、來的基因重組技術。Fodorhe Schaeffer于1976年分別報道了巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌種內原生質體融合，微生物融合現(xiàn)象得到證實，并建立了相應的試驗體系。四、原生質體融合育種 原生質體融合： 指親本的原生質體在高滲條件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作為助融劑，使它們互相凝集，發(fā)生細胞融合，接著兩親本基因組由接觸到交換，從而實現(xiàn)遺傳重組。在再生成細胞的菌落中就有可能獲得具有理想性狀的重組子。1、大幅度提高親本之間的重組頻率2、擴大重組的親本范圍3、原生質體融合時親本整套染色體參與交換，遺傳物質轉移和重組性狀較多，集中雙親優(yōu)良性狀計劃更大。 一、與常規(guī)雜交相比，原生質體融合育種的優(yōu)越

7、性和不足 不足之處是原生質體融合后DNA交換和重組是隨機的發(fā)生，增加重組體分離篩選的難度。 此外細胞對異體遺傳物質的降解和排斥作用，以及遺傳物質非同源性等因素也會影響原生質體融合的重組頻率，使遠緣融合存在較大困難。二、原生質體融合育種程序（一）直接親本及遺傳標記的選擇（二）原生質體的制備與再生（三）原生質體融合（四）融合體再生（一）直接親本及遺傳標記的選擇 一般把誘變譜系中篩選獲得的不同正變株作為直接親本進行融合。 現(xiàn)在認為融合親本應采用較大差異的近親菌株。標記：營養(yǎng)缺陷型，抗性 熱致死（滅活）孢子顏色菌落形態(tài)遺傳分析：采用營養(yǎng)缺陷型，抗性提高產量：熱滅活 熒光染色標記（二）原生質體的制備與再

8、生1、制備: 原生質體分離：機械法、非酶法和酶法（1）平板玻璃紙或搖瓶振蕩培養(yǎng)（2）取年輕菌體于高滲溶液中，加有關酶液，pH、溫度下酶解（3）過濾除去菌絲片段（4）低速離心棄上清,高滲溶液重懸原始親本直接親本振蕩培養(yǎng)酶解過濾離心原生質體標記水解酶高滲溶液沉淀用高滲溶液懸浮誘變 （1）影響原生質體制備的因素培養(yǎng)基組成 Musilkova等研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉在限制性培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基中分離原生質體的數(shù)量會顯著增加。 放線菌只有在加入甘氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，才能使酶類易于滲入和瓦解細胞壁。菌體的培養(yǎng)方式 絲狀菌常用平板玻璃紙法 細菌和酵母多用振蕩沉沒培養(yǎng)法。菌體菌齡 絲狀真菌以年輕的菌絲來分離原生質體

9、，尤其菌絲尖端細胞。酵母和細菌采用對數(shù)期。 大部分絲狀菌采用菌絲作為分離原生質體的材料穩(wěn)定劑 原生質剝離細胞壁，對滲透壓敏感，要在高滲溶液中酶解。 作為穩(wěn)定劑的有： 無機鹽：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2 有機物：糖和糖醇，如蔗糖、甘露醇、山梨醇。 試驗表明： 無機鹽對絲狀真菌效果好 糖和糖醇對酵母更合適 細菌采用蔗糖或NaCl酶解前的預處理 在用酶處理前，根據(jù)細胞壁的不同結構加入某些物質先行預處理，以抑制或阻止某一種細胞壁成分的合成，從而有利于酶的滲入。 試驗表明： SH-化合物廣泛應用于酵母菌和某些絲狀真菌，效果好 腐霉中，加入TritonX-100或脂肪酶后，可以除去細胞壁上的

10、脂層，促進酶進入細胞壁。 酵母菌常用EDTA或EDTA加巰基乙醇。 放線菌培養(yǎng)液加入0.2%4%甘氨酸。 細菌加入亞適量的青霉素。酶系和酶的濃度 細菌溶菌酶（lyxozyme） 放線菌溶菌酶（lyxozyme） 真菌蝸牛酶（snailase） 用于水解細胞壁的酶濃度要適當， 酶量過低，作用不徹底，不利于原生質體形成，濃度過高，處理時間長，會影響原生質體數(shù)量和活性，致使再生頻率下降。酶的作用溫度和作用pH 通常大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，水解細胞壁的溫度35，一般放線菌在30-32 ，產黃青霉采用蝸牛酶和纖維素酶維持在28-33 須霉25 酵母菌多在28-30。菌體密度：一般3mL酶液加入300mg

11、新鮮菌絲體。酶解方式：采用 平皿、試管、錐形瓶。注意振蕩加蒸餾水之前 A加蒸餾水之后 B原生質體形成率（）加蒸餾水之前溶液中細胞數(shù) 加蒸餾水之后溶液中細胞數(shù) 即未形成原生質體的細胞數(shù)。 把加入蒸餾水前后的混合液分別涂布到高滲再生培養(yǎng)基中，計算菌落數(shù)。（）原生質體的鑒定 水解酶作用于菌體后，必須定時取樣觀察原生質體分離的程度，以確定酶解終點。 一般地，在普通光學顯微鏡下觀察：（1）低滲爆破法 直接在顯微鏡下觀察原生質體在低滲溶液中吸水膨脹、破裂的過程。P300圖（2）熒光染色法 原生質體混懸液用0.05%-0.1%的熒光增白劑染色，離心棄染料、洗滌后在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)紅光的為完整的原生質體，

12、發(fā)綠光表明還有細胞壁存在。（）原生質體的收集和純化 原生質體從菌體細胞中釋放出來后，酶解結束，必須將原生質體與酶液和未酶解的殘余菌體及碎片分開：（1）過濾法：適于絲狀微生物。（2）密度梯度離心：采用蔗糖和氯化銫（3）界面法（4）漂浮法（4）原生質體的活力的鑒定 分離純化后的原生質體，用作再生或融合的出發(fā)材料，必須具有活性和再生能力：（1）熒光素雙醋酸染色法 活細胞吸收脂解FDA，能發(fā)熒光的具有活性。（2）酚藏花紅染色法 用0.01%濃度的染料染色，活性原生質體吸收染料為紅色，無活性的為白色。（3）伊文思藍染色法 用濃度為0.25%伊文思藍染色，活性原生質體為無色，死的原生質體為藍色。（5）原生

13、質體保存 原生質體新鮮程度與其活性有關，一般都是將新制備的原生質體立即進行融合或其他方式的育種。 如果不是立即使用，則必須低溫保存，在一般冷藏條件下保存時間很短。一般液氮超低溫保藏。 方法： 5%的二甲基亞砜或甘油等其他保護劑，迅速降溫保藏。2、原生質體再生原生質體再生分三個階段：準備期：大分子合成與原生質體生長，這一時期主要是合成細胞器成分，表現(xiàn)為原生質體體積增大。細胞壁恢復期：細胞壁合成與再生，主要合成細胞壁物質，組裝、恢復成完整細胞。分裂能力恢復期：分裂能力恢復并開始分裂繁殖成為正常的細胞形態(tài)和菌落。（1）再生的影響因素（1）菌體的生理狀態(tài) 對絲狀菌而言，年輕細胞比衰老細胞強。（2）穩(wěn)定

14、劑：細菌放線菌酵母采用糖醇系統(tǒng)， 霉菌采用鹽溶液。（3）酶解時酶濃度及作用時間（4）再生培養(yǎng)基組成：絲狀真菌釀酒酵母的原生質體僅能在固體培養(yǎng)基上再生。（5）殘存菌體的分離 除去沒有形成原生質體的細胞，否則其生長快，影響再生。（6）原生質體的密度： 不宜過密。（7）排除再生培養(yǎng)基上的冷凝水（8）再生方法一般用雙重平板法：0.8%瓊脂2%瓊脂取0.1ml原生質體再生率的計算A-總菌落數(shù)，未經酶處理的菌懸液涂布于平板上長的菌落。B-酶解混合液加蒸餾水破壞原生質體，涂布后長出的菌落。C-再生菌落數(shù)，酶解混合液加高滲溶液，涂布于再生培養(yǎng)基上生長的菌落。AA-BBC:再生培養(yǎng)基的菌落BC-B (三)原生質

15、體的融合（一）融合過程去壁去壁融合加30%-50%PEG適量CaCl、MgCl107-108ml-1107-108ml-1用再生培養(yǎng)基稀釋離心 沉淀懸浮 離心 （二）原生質融合的影響因素1、融合劑 化學融合劑：聚乙二醇（分子量不同濃度不同。） 物理融合劑：電融合、激光融合 2、溫度：一般2030，時間1min1h 絲狀真菌30 ，細菌4或20 ，放線菌20 3、親株的親和力和原生質體的活性 親株的親緣關系。4、無機離子：Ca20.05mol/LMg2 0.02mol/L5、其他條件：原生質體的密度107108ml-1不低于106ml-1（四）融合體再生 以釀酒酵母為例（二）融合體的檢出與分離1、利用營養(yǎng)缺陷型標記選擇融合體2、利用抗藥性選擇融合體3、用滅活原生質體檢出融合體4、利用熒光染色法選擇融合體5、雙親對碳源利用不同而檢出融合體 例：釀酒酵母 呼吸完整，不能利用木 糖，對放線菌酮敏感。 另一種酵母 呼吸缺陷，能利用木糖，