臨床PCR試劑盒選用和質(zhì)檢-PPT課件

1、臨床PCR試劑盒的選用和質(zhì)檢衛(wèi)生部臨床檢驗中心 李金明PCR或RT-PCR試劑盒的組成核酸提取試劑核酸擴增或逆轉(zhuǎn)錄-核酸擴增試劑產(chǎn)物檢測試劑（有些使用全自動分析儀的PCR方法因其核酸擴增和檢測同時完成，故無專門的產(chǎn)物檢測試劑）影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素內(nèi)在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素： 擴增所需的原材料寡核苷酸引物和探針緩沖液和dNTP聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等PCR反應(yīng)混合物 Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA 多 聚 酶rTth DNA 多 聚 酶AmpErase 生 物 素 標 記 的 引 物 和 或 和寡核苷酸引物和探針其對試劑

2、盒質(zhì)量的影響首先是純度。純度的判斷可根據(jù)260/280吸光度比值來判斷，如2.0，則需重新純化。另一種方法是將其在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，如出現(xiàn)一條以上的帶或遷移位置錯誤，則需重新純化。是否有污染。結(jié)合特異性（濃度）dNTP和緩沖液dNTP（包括dATP 、dCTP、 dGTP和 dTTP或 dUTP）的濃度緩沖液：在儲存和擴增循環(huán)中穩(wěn)定、作為聚合酶活性所必須的Mg（或用于rTth的Mn）的濃度以及pH等逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶酶的濃度酶的活性核酸擴增方法PCRRTPCR轉(zhuǎn)錄依賴的擴增（TMA）連接酶鏈反應(yīng)（LCR）鏈替代擴增（SDA）等影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素： 核酸提取核酸提取的有效性核酸提

3、取的簡便性 影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素： 產(chǎn)物檢測雜交固相特異探針及其標記物影響PCR試劑盒質(zhì)量的因素內(nèi)在因素: 原材料、核酸提取方法、方法學(xué)設(shè)計外在因素：試劑盒的運輸和貯存外在因素：試劑盒的運輸和貯存試劑盒的運輸和貯存PCR試劑盒的有效期一般為6個月，這是指在適當?shù)馁A存溫度下。核酸擴增部分的試劑一般要貯存于-20下；產(chǎn)物檢測部分試劑則貯存于28。試劑盒從廠家到用戶手中，均要經(jīng)歷運輸及運輸中的貯存，任一環(huán)節(jié)的不當，均會影響試劑盒的臨床使用質(zhì)量。PCR試劑盒的分類定性測定：PCR-ELISA、PCR-膜上雜交（雜交梳）、熒光PCR（分子信標和Taq Man等）定量測定： PCR-ELISA 、T

4、aq Man和Amplisensor熒光定量、 Amplicor PCR-ELISA定量等。PCR試劑盒的選用原則參考試劑生產(chǎn)廠家的信息廣告參考同行對有關(guān)試劑盒的使用效果參考有關(guān)機構(gòu)的綜合評價根據(jù)使用目的根據(jù)所在實驗室的技術(shù)特點根據(jù)所在醫(yī)院患者的承受能力PCR試劑盒的質(zhì)檢外包裝：廠家名稱、檢測目的、批準文號、批號和有效期等。內(nèi)包裝：試劑瓶是否漏液、真空包裝是否破損以、試劑是否齊全以及是否有使用說明書等。PCR試劑盒的質(zhì)檢(定性測定)性能質(zhì)檢采用血清（樣本）盤（Panel）質(zhì)檢： PCR試劑血清（樣本）盤由一定數(shù)量的原血清陰、陽性樣本、23份純化核酸（DNA或RNA或cDNA）樣本以及35份系列

5、稀釋陽性樣本所組成。樣本總數(shù)可定在20份左右。 原血清樣本用于判斷試劑盒對特定病原體核酸檢出的特異性、靈敏度和符合率；純化核酸樣本用于判斷DNA擴增或逆轉(zhuǎn)錄及DNA擴增的有效性；系列稀釋陽性樣本用于判斷試劑的測定下限。試劑特異性、靈敏度和符合率計 算 公 式試劑特異性、靈敏度和符合率計 算 公 式靈敏度（） (a / a+c)100%特異性（） (d/b+d) 100%符合率（） (a+d/a+b+c+d) 100%PCR試劑盒的質(zhì)檢(定量測定)樣本：已知濃度的高、中、低三種濃度質(zhì)控物。質(zhì)檢內(nèi)容：測定的重復(fù)性 測定范圍 抗干擾能力技術(shù)驗收依據(jù)：臨床檢驗擴增檢驗實驗室管理暫行辦法 衛(wèi)醫(yī)發(fā)2019

6、10號臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范 衛(wèi)檢字2019第8號技術(shù)驗收內(nèi)容實驗室設(shè)置和設(shè)備設(shè)施和環(huán)境人員設(shè)備管理檢測方法標本管理記錄報告質(zhì)量控制抱怨 等十章共三十八條實驗室設(shè)置和設(shè)備本章共七條。 實驗室分區(qū)：規(guī)范化分區(qū)、明確的識別標記防污染：空氣流向、中央空調(diào)、各區(qū)間的封閉性各區(qū)儀器設(shè)備物品配備：充分性、科學(xué)性、專用性（標識） “生物安全柜” “可移動紫外燈” “加樣器”設(shè)施和環(huán)境本章包括五條；實驗室設(shè)施、工作區(qū)域、能源、照明等；環(huán)境和實驗條件控制設(shè)施：溫濕度計、不間斷或穩(wěn)壓電源等；實驗室進出的限制和控制：人員進入控制標識、生物傳染危險性標識實驗室“內(nèi)務(wù)管理”（如人員流動、清潔等）制度和相應(yīng)設(shè)施；

7、廢棄血清處理、生物防護等措施和相應(yīng)設(shè)施設(shè)施和環(huán)境需注意的問題清潔程序或制度 清潔用具的專用、清潔工作的單一流向、清潔方法的具體性生物防護及廢棄血清處理 對工作人員的保護和對環(huán)境的保護 銳器使用規(guī)則 生物傳染危險性廢棄物出實驗室前預(yù)處理人 員本章包括三條。人員數(shù)量足夠；有培訓(xùn)上崗證培訓(xùn)計劃：室內(nèi)的定期培訓(xùn)（記錄）人員技術(shù)（資格、培訓(xùn)、技能）檔案。設(shè)備管理（1）本章包括三條。主要儀器設(shè)備應(yīng)得到正確維護，應(yīng)有設(shè)備維護程序文件；以及維護的記錄加樣器、溫度計、擴增儀和酶標儀等設(shè)備應(yīng)有校準程序文件、有明顯標識表明其校準狀態(tài)（此次校準時間及下次應(yīng)校準時間）；實驗室應(yīng)保存每一臺儀器設(shè)備的檔案材料，對檔案材料的

8、具體內(nèi)容作了詳細規(guī)定。 設(shè)備和質(zhì)控物（2）每一臺設(shè)備的檔案內(nèi)容包括： （a）設(shè)備名稱；（b）制造商名稱、型號、序號等；（c）接收日期和啟用日期；（d）目前放置地點；（e）接收時的狀態(tài)；（f）儀器使用說明書有復(fù)印件；（g）校準和/或檢定的日期和結(jié)果及下次校準和/或檢定的日期；（h）迄今所進行的維護和今后維護計劃的細節(jié)；（i）損壞、故障、改裝或修理的歷史。檢 測 方 法本章包括三條。標準操作程序（SOP）：儀器設(shè)備操作和校準程序；標本收集處理程序；擴增檢測工作程序；儀器試劑的選購和質(zhì)檢程序；消耗性材料的購買、驗收、質(zhì)檢和貯存程序。SOP應(yīng)現(xiàn)行有效及便于使用。標 本 管 理本章包括五條。建立唯一編號

9、識別系統(tǒng)，避免標本混淆；標本采集、運送和保存程序；標本接收時的狀態(tài)記錄；標本的適用性和充分性；標本貯存的標準操作程序及貯存溫度控制措施;標本接收及安全處置程序；維護實驗室誠實性的必要措施。記 錄本章包括三條。有記錄管理制度：適合自身實際情況，符合現(xiàn)行規(guī)章制度；（由誰管、在何處管、保存多長時間）原始記錄、計算和導(dǎo)出數(shù)據(jù)應(yīng)歸檔并保存；記錄應(yīng)有有關(guān)人員的簽字；所有記錄和報告都要妥善保管并保密。報 告檢測結(jié)果的報告應(yīng)準確、清晰和客觀；定性測定報告“陰性”或“陽性”；定量測定則以拷貝數(shù)/ml或IU/ ml報告；避免二者之間的混淆；每份報告應(yīng)包括以下信息：標題、唯一標識、檢測標本說明、標本特性和狀態(tài)、標本接收日期和檢測日期、檢測方法、檢測和校核人員簽字及發(fā)出日期、參考結(jié)果或范圍；如對報告有效性有疑問，實驗室應(yīng)立即通知臨床相關(guān)科室予以改正的程序；有報告的發(fā)放程序：用電話、傳真、電子郵件報告結(jié)果時的保密原則。質(zhì) 量 控 制實驗室應(yīng)有室內(nèi)質(zhì)量控制標準操作程序 質(zhì)控物來源、濃度、批號 陰性質(zhì)控的設(shè)置 所選擇的統(tǒng)計質(zhì)控方法（均值、SD如何得到的） 失控的判斷標準 失控以后怎么辦實驗室應(yīng)參加室間質(zhì)量評價。抱 怨實驗室應(yīng)制定抱怨及其處理的SOP； 可操作性、不同抱怨的處理