課題3　血紅蛋白的提取和分離 (2)

1、課題3 血紅蛋白的提取和分離P64閱讀課本P64-66“基礎知識”完成：了解感知（一）、（二）、（三） 在課本中勾畫出相應的知識點自主閱讀，獨立思考P64分離蛋白質(zhì)的原理P64先收集到的是分子量大的物質(zhì)P65還記得人體血液中的緩沖液嗎？H2CO3 /NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4本實驗使用的是磷酸緩沖液保證血紅蛋白的正常結構和功能P65 哪種分子遷移速度最快？球形小分子、帶電荷量多P66閱讀課本P66-70“操作提示” 了解感知（四）、（五） 深入學習1、2、3 在課本中勾畫出相應的知識點自主閱讀，獨立思考完成實驗操作步驟樣品處理粗分離純化純度鑒定P66P67速度越高和時間越長

2、會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白P67P67P67粗分離：除去樣品中相對分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)P67打孔挖穴安管覆網(wǎng)紗包插管純化：除去樣品中相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)P68固定色譜柱配凝膠懸液裝填色譜柱洗滌平衡P68調(diào)節(jié)緩沖液面滴加透析樣品樣品滲入凝膠床洗脫收集分裝蛋白質(zhì)P69純度鑒定P66洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心收集血紅蛋白溶液透析去除分子量較小的雜質(zhì)凝膠色譜法除去相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白質(zhì)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定P69P70思考課本P70“結果分析與評價”1、2、3獨立思考P70 看處理的血液樣品是否分層。如果分層不明顯，可能是洗滌次

3、數(shù)少、未能除去血漿蛋白；或者離心速度過高和時間過長，使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，得不到純凈的紅細胞。凝膠裝填均勻、沒有氣泡、色素帶均勻平整則成功如果紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，則分離效果好；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，則分離效果不好。課本練習和導學提綱答案課本P70練習 5、與其他真核細胞相比，紅細胞有什么特點？這一特點對你進行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？ 血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 一、了解感知(一)凝膠色譜法 1、概念：也稱做 ；是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。 2、原理（1）由 構成

4、的凝膠，內(nèi)部有許多貫穿的的 。（2）當 不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動速度 ，而相對分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動，路程 ，移動速度 ，從而使 不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。分配色譜法相對分子質(zhì)量的大小多糖類化合物通道相對分子質(zhì)量較小較長較慢較大凝膠外部較短較快分子質(zhì)量(二)、緩沖溶液1、作用：在一定范圍內(nèi)，抵制 的 對溶液pH的影響，維持pH 。2、配制：由 種緩沖劑溶解于 中配制而成，通過調(diào)節(jié)緩沖劑的 就可以得到不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。(三)、電泳 1、概念：指 在電場的作用下發(fā)生 的過程。2、原理：在一定的 下，

5、 、 等生物大分子的可解離基團會帶上 或 ，在 的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷 的電極移動。3、作用：電泳利用了待分離樣品中各種分子 的差異及分子本身的 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實現(xiàn)樣品中 的分離。4、方法：常用的電泳方法有 和 。測定蛋白質(zhì)分子量時通常使用 。外界酸和堿基本不變12水使用比例帶電粒子遷移pH多肽核酸正電負電電場相反帶電性質(zhì)大小形狀移動速度各種分子瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(四)、實驗操作1.樣品處理及粗分離目的：去除 。方法： 離心（速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果），重復洗滌 次，直至上

6、清液中已沒有 ，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。(2)血紅蛋白的釋放加 到 體積，再加40體積的 （溶解細胞膜），置于 上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）, 細胞破裂釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min ，試管中的溶液分為4層:第1層（最上層）： 甲苯層第2層（中上層）： 的沉淀層， 色薄層固體第3層（中下層）： 的水溶液層， 的液體第4層（最下層）：其它雜質(zhì) 的沉淀層雜蛋白低速短時間三呈現(xiàn)黃色蒸餾水原血液甲苯磁力攪拌器無色透明脂溶性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色(4)透析，方法：將血紅蛋白溶

7、液裝入 ，將 放入一定量適宜濃度的 中，透析 。目的：將 的雜質(zhì)除去。2.凝膠色譜制作(3)樣品的 。3、純度鑒定：在鑒定的方法中，使用最多的是 。 五、操作提示1、紅細胞的洗滌： 、 與 十分重要。 過少，無法除去血漿蛋白； 過高和 過長會使 等一同沉淀，達不到分離效果。2、色譜柱填料的處理：商品凝膠使用前需直接放在 中膨脹，可以將加入其中的 用 加熱，加速膨脹。3、凝膠色譜柱的裝填：在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的 ，降低 。4、蛋白質(zhì)的分離：如果紅色區(qū)帶 地移動，說明色譜柱制作成功。透析袋中透析袋磷酸緩沖液12h相對分子質(zhì)量較小加入和洗脫SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳洗滌次數(shù)離心速度離心時間洗滌次數(shù)離心速度時間白細胞洗脫液洗脫液的濕凝膠沸水洗脫次序分離效果均勻一致二、深入學習1、人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？2、洗滌紅細胞時為什么不能用蒸餾水代替生理鹽水? 3、在血紅蛋白釋放過程中。加入蒸餾水和甲苯的目的是什么? 雞的紅細胞具有