放射性碘標(biāo)記羥氨芐青霉素用于青霉素結(jié)合蛋白的研究

1、放射性碘標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟羥氨芐青霉素用于青霉素結(jié)合卵白的研究論文關(guān)鍵詞青霉素結(jié)合卵白，放射性，經(jīng)氨葦青霉素多頭泡噬厲，eillina論文摘要本文報(bào)道用放射性對(duì)經(jīng)氨節(jié)青霉素舉行標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟后用于青霉素結(jié)合卵白(PBPs)的研究。效果表白，一經(jīng)氨節(jié)青霉素能較好地與細(xì)菌內(nèi)膜上全部的青霉素結(jié)合卵白結(jié)合。舉行競爭性結(jié)合實(shí)行，頭抱嘎肪的重要靶位是PBP3，enhna的重要靶位是PBP:。我們創(chuàng)立的青霉素結(jié)合卵白的測定要領(lǐng)，關(guān)鍵性的質(zhì)料價(jià)廉易得，具有輕便、快速、經(jīng)濟(jì)等長處，是一個(gè)值得繼承開拓和研究的新途徑。青霉素結(jié)合卵白是存在于細(xì)菌被膜上一群能同青霉素和別的盡內(nèi)酞胺類抗生素贅合的細(xì)菌卵白，從分子程度上對(duì)青霉素結(jié)

2、合卵白的研究，對(duì)付探究刀一內(nèi)酞胺類抗生素的作用機(jī)制和闡發(fā)某些細(xì)菌的耐藥機(jī)制具有緊張的意義，國表里已舉行了多方面的研究1-5。我們從大腸桿菌K:，中提取細(xì)菌膜卵白，利用放射性腸碘創(chuàng)立了細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋自的檢測要領(lǐng)，現(xiàn)陳訴如下。實(shí)行質(zhì)料一、抗生素:經(jīng)氨節(jié)青霉素(Ax了Eillin)，頭抱唾肪(eftaxie)和eeillina均為市售產(chǎn)物。二、菌株:大腸桿菌K12、:為北京生物成品檢定所提供。三、造就基:接納抗號(hào)造就基。四、放射源:一Nal由北京原子能所提供。實(shí)行要領(lǐng)一、一裊氛節(jié)青霉素的制備:接納氯胺一T法，在參考assn等6的底子上加以革新。、氫氨節(jié)青霉素20拌g和氯胺一混淆，在室溫條件下反響6

3、090秒后參加側(cè)重亞硫酸鈉和碘化鉀完成整個(gè)反響，將標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品稀釋至反響所需濃度后放入4存放。二、結(jié)合反響:細(xì)菌造就及膜的制備參照Spratt等7的要領(lǐng)制得。在反響管中參加提取的膜蛋自一經(jīng)氨節(jié)青霉素，30溫育10分鐘，參加青霉素G.6g，20%的+二烷基肌氨酸10川，室溫下安排20分鐘，離心100，。009x4。分鐘，將上清液、樣品緩沖液和琉基乙醇按6:3:1的比例混淆，沸水浴3分鐘，冷卻后經(jīng)SDS一PAGE分散。標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品和別的待測抗生素與膜卵白的競爭性結(jié)合反響參照urltis等7，的要領(lǐng)舉行。待測抗生素頭抱唾肪與iillina別離與膜蛋安閑30反響10分鐘后參加一經(jīng)氨節(jié)青霉素，以后的

4、歷程與上述同等。三、凝膠處置懲罰和放射自顯影:將電泳后的凝膠立即舉行結(jié)實(shí)、染色和脫色處置懲罰，用凝膠枯燥器舉行真空枯燥?？菰锖蟮哪z與x光片精細(xì)打仗后在一70條件下曝光5-7天。實(shí)行效果一、標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品的斷定:我們對(duì)標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品用薄層層析法舉行闡發(fā)，如Fig.1所示。效果表現(xiàn):氫氨節(jié)青霉素與非標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟經(jīng)氨節(jié)青霉素的挪動(dòng)位置同等，游離的不凌駕10%。經(jīng)以后的結(jié)合實(shí)行證明，在此標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟條件下盡內(nèi)酞胺環(huán)是不變的。二、結(jié)合實(shí)行:用Sarksyl一可溶部門(內(nèi)膜)、Sarksyl一不溶部門(外膜)和整個(gè)細(xì)胞外被電泳后舉行放射自顯影不雅察。效果表現(xiàn)，經(jīng)氨節(jié)青霉素與內(nèi)膜和整個(gè)細(xì)胞外被的青霉素結(jié)合

5、卵白的結(jié)合環(huán)境同等，其放射自顯影帶的位置切合報(bào)道的青霉素結(jié)合卵白的分子量(用尺度分子量卵白做比較)，如Fig.2。標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品與外膜反響后未出現(xiàn)任何自顯影帶，說明細(xì)菌外膜無青霉素結(jié)合卵白存在。用頭抱唾肘和ieillina別離與一經(jīng)氨節(jié)青霉素、細(xì)菌內(nèi)膜卵白舉行競爭性結(jié)合實(shí)行，效果見Fig.3。從中可見，頭抱噴厲的特異靶位是PBP:，而iillina的特異靶位是PBP3，與文獻(xiàn)報(bào)道的效果符合8。討論由于青霉素G與全部青霉素結(jié)合卵白都具有精良的結(jié)合，以是，如今各人都接納其標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟物作為研究東西。，4一PenieillinG(PG)是如今應(yīng)用最為普及的標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品，但此標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品的比放低(

6、1.452.22火10一SBq/l)，這就造成了標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品用量大且曝光時(shí)間太長，既使在利用熒光閃耀法(Flurgrap-hy)、預(yù)曝光(Prefg義ing)和超低溫(一700)條件下曝光等這些快速自顯影要領(lǐng)，仍必要20一，60天9-11。接納氛標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟法進(jìn)步比放，由于莊內(nèi)酞胺環(huán)的不不變性，幅射自剖析快，以是不克不及作為商品出售。如今必需入口，代價(jià)昂貴。用標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟多膚類激素和卵白質(zhì)已有大量的資料報(bào)道，但用于標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟冬內(nèi)酞胺類抗生素的卻很少。由于很多壓內(nèi)酞胺類抗生素具有雷同酪氨酸殘基的布局身分對(duì)位經(jīng)基使苯環(huán)上的氫原子活潑易被代替(如經(jīng)氨節(jié)青霉素)，使放射性碘標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟可以或許舉行

7、。而青霉素G苯環(huán)的布局特性那么不實(shí)用于放射性碘標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟。我們制備的一經(jīng)氨節(jié)青霉素，由于其比放射性高(約Bq/l)，縱然不利用熒光閃耀法和預(yù)曝光，自顯影亦縮至1周擺布，大大加速了整個(gè)實(shí)行周期。整個(gè)標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟歷程輕便易行，重復(fù)性好，標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟完后不必要特別分散本領(lǐng)(電泳歷程中主動(dòng)分散)。更為緊張的是辦理了標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟品的供應(yīng)，為整個(gè)實(shí)行節(jié)省大量經(jīng)費(fèi)，并為其研究在海內(nèi)提供了一個(gè)新的技能要領(lǐng)。參考文獻(xiàn)1SprattBGetaleEurJBihe1977.72;341-3522HedgePJetal,Nature1985,318:478-4803TuanenEetaI:AntiirbAgentshether1986;30:659-6614axanDJetal:AnnuRevBihe1983：52：825-8295雷雨等:?中國抗生素雜志?1388;13(5):321-3256assnJetal：AnalBihe1983128:164-1687urbsNAetaI;Antiir