重組體的篩選與鑒定ppt課件

1、重組體克隆的挑選和鑒定轉(zhuǎn)化子和重組子轉(zhuǎn)化子：將導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子成為重組子。假設(shè)重組子中含有外源目的基因那么又稱為陽性克隆子或期望克隆子在轉(zhuǎn)化反響中，并非一切的細(xì)胞都轉(zhuǎn)入重組DNA分子，即使一切的受體細(xì)胞都變?yōu)檗D(zhuǎn)化體，所獲得的轉(zhuǎn)化子仍是多種類型的DNA分子，由于在銜接產(chǎn)物中既有裁體和一個或數(shù)個串聯(lián)目的基因的銜接，也有載體的自連，還有目的DNA分子的自連，更多的是未發(fā)生銜接反響的載體和目的DNA片段。因此在成千上萬個轉(zhuǎn)化子中，真正含有期望的重組DNA分子的比例很少，為了將含有外源DNA的宿主細(xì)胞和不含外源DNA宿主細(xì)胞分開，以及將

2、含有正確重組子的宿主細(xì)胞和含有其他外源DNA的宿主細(xì)胞分開。這就需求設(shè)計出容易于挑選重組子克隆的方案并加以驗證。陽性克隆的挑選與鑒定可以從不同的層次、利用不同的方法進展?？偟膩碚f，重組子的鑒定可以從直接和間接兩個方面分析，可以從DNA、RNA和蛋白質(zhì)三個不同的程度進展鑒定。一、抗藥性標(biāo)志及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位點BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點Pst I。第一節(jié) 載體表型選擇法1. 原理：pBR3221四環(huán)素：2氨芐青霉素抗性基因：2. pBR322抗菌素標(biāo)志選擇含bla基因的菌體產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐

3、青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液I2-KI-Aampicillin藍灰色褪色。抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停頓生長的細(xì)菌。3環(huán)絲氨酸：3. 選擇過程：假設(shè)在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培育基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保管下來； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。1四環(huán)素抗性插入失活無環(huán)絲氨酸培育基2氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程假設(shè)Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。二、-半乳糖苷酶顯色反響選擇法-半乳糖苷酶

4、 乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍+深藍色1. 原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因Lac Z的片段氨基端，其上有外源DNA的插入位點。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因 片段缺失。可以被IPTG誘導(dǎo)表達。 載體和受體菌基因組可以互補構(gòu)成完好有功能的-半乳糖苷酶。2. 選擇過程-半乳糖苷酶使Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物特性進展直接選擇。只在特定條件下。轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物可以彌補受體菌株的突變型缺陷。一、原理：第二節(jié) 根據(jù)插入基因的表型選擇1.彌補缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培育基中生長小鼠的二氫葉酸復(fù)原酶DHFR對三甲氧芐

5、二氨嘧啶(抑制大腸桿菌生長)有抗性。DHFR載體銜接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培育基平板含DHFR的克隆才干生長例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2. 添加新性狀降解利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分別質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。第三節(jié) DNA電泳檢測法 分子量 Marker載體重組克隆二、酶切電泳挑選法1. 原理：根據(jù)知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果DNA帶數(shù)和長度。或用適宜的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個片斷，電泳后比較結(jié)果能否符合估計的結(jié)果。酶切前酶切后插入片斷載體不同

6、克隆的酶切結(jié)果挑選過程三、PCR擴增檢測法1. 原理PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片斷。2. 過程1從重組克隆中提取質(zhì)?；駾NA。2用外源DNA插入片斷引物作PCR。3電泳PCR產(chǎn)物。4檢查能否有PCR產(chǎn)物。5PCR產(chǎn)物的長度能否與外源基因一致。1. 核酸雜交第四節(jié) 核酸雜交檢測法 一、原理：重組克隆與探針雜交。3. 識別標(biāo)志32P 或 125I 。1放射性同位素2. 檢測用的探針與外源DNA插入片斷互補的序列。2非放射性標(biāo)志熒光素二、核酸雜交檢測方法用DNA或RNA探針檢測DNA樣品。1. Southern blotting從宿主細(xì)胞中提取DNA或質(zhì)粒載體，再用探針雜交。只需帶有插入片

7、斷的重組載體才干與探針雜交，在底片上曝光顯示。Southern blot 挑選結(jié)果1原位雜交挑選特點：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。2. Northern blotting用DNA或RNA探針檢測RNA樣品。主要檢測插入片斷能否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。利用抗體作為“探針來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體一抗和第二抗體二抗的性質(zhì)可分為幾種作用方式：一、放射性抗體檢測法第五節(jié) 免疫化學(xué)檢測法 1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白蛋白“雜交 待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)志的二 抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因

8、產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)志的二抗固相支持濾膜待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)志的二抗 結(jié)合蛋白125I標(biāo)志的二抗2. 放射性抗體檢測法過程3. 雙位點檢測法質(zhì)?；駻插入基因B表達質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B交融蛋白檢測交融蛋白。既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。固相支 持濾膜抗A抗體125I標(biāo)志的 抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支 持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光二、免疫沉淀檢測法把非放射性抗體加到平板培育當(dāng)插入基因的表達產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反響構(gòu)成“沉淀圈。1. 原理抗原抗體凝集反響。檢測分泌型產(chǎn)物。2. 方

9、法對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進展原位溶菌處置溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)。三、酶聯(lián)免疫吸附測定ELISAEnzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：一抗primary antibody: 與目的分子的特異結(jié)合。 二抗secondary antibody： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶連enzyme-linke： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反響將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)或發(fā)光，再經(jīng)過比色測定有色物質(zhì)的含量或光強度，從而推測目的分子的含量。待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶 待測基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色察看酶 19在特殊的分光光度儀酶標(biāo)儀上比色，打印

10、出結(jié)果。5比色四、免疫印跡western blotting法1.原理：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。1SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性形狀，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。 SDS:SDS： 聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE：Polyacrylamide gel electrophoresis在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極挪動，挪動的速率主要取決于其分子量大小鏈的長短，從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer點樣電泳方向蛋白質(zhì)電泳的分子量規(guī)范知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一同電泳

11、，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計。Da道爾頓(質(zhì)量單位, 等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。 一克約為61023道爾頓DaltonSDS PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍： 靈敏度底、只能檢出0.3-1g/帶，但可褪色回收。 硝酸銀： 靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2轉(zhuǎn)到膜上進展染色。1直接染色直接染色電泳結(jié)果2Western blotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等。 Western轉(zhuǎn)膜膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白Western安裝 Blotting原理與ELISA一樣。待測蛋白硝酸纖 維素膜一抗二抗

12、辣根過氧 化物酶底物產(chǎn)物， 并發(fā)出光PAGE膠待測蛋白底片曝光辣根過氧化物酶：HRPO1先用一抗待測蛋白的單克隆抗體與 膜上的蛋白結(jié)合。2洗去未結(jié)合的一抗。3用二抗與一抗結(jié)合二抗上帶有HRPO。4清洗掉未結(jié)合的二抗。5用HRPO的底物浸泡膜。6暗室里曝光，沖洗膠片。 Blotting過程結(jié)果多克隆抗體Blotting的結(jié)果單抗blotting結(jié)果第七節(jié) 幾種常用的真核生物重組基因選擇方法真核細(xì)胞核苷酸的合成需求四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸復(fù)原酶dihydrofolate reductase，DHFR一、哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標(biāo)志1. 胸苷激酶thymidine kinase, t

13、k1TK選擇原理四氫葉酸的必要性DHFR氨甲喋啉Methotrexate的抑制造用氨甲喋啉或氨基喋啉是葉酸的類似物。 能抑制二氫葉酸復(fù)原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 胸苷酸激酶的補救作用TK+細(xì)胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培育基中的胸苷T合成TTP，存活。Ttk次黃嘌呤的補救作用細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP dATP TTP dCTP 次黃嘌呤 補救 氨甲喋啉 抑制 抑制 HAT培育基：Tk- 細(xì)胞株。TK基因。 宿主細(xì)胞 載體標(biāo)志2TK選擇過程含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培育基。(hyp

14、oxanthine，aminopterin，thiymidine只需轉(zhuǎn)入TK基因的細(xì)胞才干生存。20真核細(xì)胞核苷酸的合成需求四氫葉酸提供甲基。2. 二氫葉酸復(fù)原酶基因DHFR1 選擇原理二氫葉酸復(fù)原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸DHFR+細(xì)胞二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸復(fù)原酶二氫葉酸復(fù)原酶合成四氫葉酸DHFR+細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸復(fù)原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培育基中生存不需求補救！DHFR- 細(xì)胞DHFR- 細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸復(fù)原酶，所以不能合成四氫葉酸。需求補救！不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培育基中生存。 胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救dUMPdATP

15、TTPdATP次黃嘌呤補救胸苷補救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救:DHFR-細(xì)胞株不能在無核苷酸的培育基中生長。 宿主細(xì)胞2選擇過程透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補救。 無核苷酸的培育基需求胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救！ 氨甲喋呤“加壓 添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補救作用，可提高選擇。DHFR+基因。 載體標(biāo)志只需轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細(xì)胞才干生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie無核苷酸的培育基是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，使細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進展，但不影響真核生物。3. 新霉素抗性基因neor1選擇原理 新霉素neom

16、ycin新霉素的類似物，是一種 氨基糖苷，對真核細(xì)胞和原核細(xì)胞都有毒性。 G418geneticin 新霉素抗性基因-neor細(xì)菌的新霉素抗性基因neor編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶APH，能使G418失活。G418真核細(xì)胞死亡G418存活neor真核細(xì)胞含致死劑量G418的完全培育基。 G418培育基真核細(xì)胞株均可。neor基因。宿主細(xì)胞載體標(biāo)志2選擇過程G418：100-800g/mLCAT是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼的，催化氯霉素發(fā)生乙?；Щ?。氯霉素cat含氯霉素的完全培育基。真核細(xì)胞株均可。cat基因。乙酰氯霉素4. 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT1選擇原理2 選擇條件3 宿主細(xì)胞4載體標(biāo)志chloramphenicol acetyl transferase在