表面微生物監(jiān)測(共9頁)

1、表面(biomin)微生物監(jiān)測除了用空氣(kngq)微生物取樣來監(jiān)測生產(chǎn)環(huán)境的微生物污染水平外，表面監(jiān)測也可監(jiān)測生產(chǎn)區(qū)域表面以及設(shè)備與產(chǎn)品(chnpn)接觸表面的微生物世。監(jiān)測的方法必須考慮取樣的準(zhǔn)確性和代表性?；镜谋O(jiān)測方法包括接觸碟法、擦拭法以及表面沖洗法。每種提供的數(shù)據(jù)都可以用于 產(chǎn)品質(zhì)量的評(píng)價(jià)。測試方法可以定性和定量。而且取樣的準(zhǔn)確性受收集和處理樣品的過程 影響，因此必須對(duì)取樣進(jìn)行培訓(xùn)和測試。接觸碟法接觸碟容易操作而且可以定量。因此被廣泛使用，適用于對(duì)平整的規(guī)則性表面進(jìn)行取 樣監(jiān)測。通常的碟子是50mm直徑的，培養(yǎng)基充滿碟子并形成圓頂，取樣面積一般約為 25cm2。培養(yǎng)基可以根據(jù)使用添

2、加中和劑。取樣時(shí)，確保全部瓊脂表面與取樣點(diǎn)表面充分 接觸。取樣后，需用蘸有70%乙醇的紗布擦拭被取樣表面，以除去殘留瓊脂。將取樣后并 做好標(biāo)記的接觸碟置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，讀數(shù)，記錄。缺點(diǎn)：不適用于非常規(guī)表面；若培養(yǎng)基太濕潤，菌落會(huì)連片生長導(dǎo)致不易計(jì)數(shù)。擦拭法該方法通常用于對(duì)不規(guī)則表面（尤其是設(shè)備表面）進(jìn)行取樣。拭子通常為一根棒狀 物，其頂端由吸水性材料制成，拭子頭在取樣前應(yīng)先行浸濕（通常為無菌生理氣化鈉溶液 或0. 1%的蛋白胨溶液約5ml),取樣時(shí)，握住拭子柄，以30角與取樣表面接觸，緩慢并 充分擦拭，取樣面積25cm2左右（可用特定的無菌模板確定擦拭面積），然后將取樣頭折 斷放入上述溶液內(nèi)，

3、充分振蕩，再用平皿涂布法或鋪平板法計(jì)數(shù)。如果拭子頭的材料為藻 酸鈣，則要用稀的鹽溶液作為稀釋劑（如1%檸檬酸鈉溶液），這樣才能讓拭子頭完全溶 解。因擦拭取樣的面積一般約為25cm2，故擦拭法也屬于定量檢測方法。缺點(diǎn)：取樣和轉(zhuǎn)移技術(shù)可能會(huì)影響結(jié)果；樣品處理后才能培養(yǎng)。表面沖洗法該法適用于監(jiān)測大面積區(qū)域內(nèi)表面的微生物含菌量，包括設(shè)備軌道、儲(chǔ)水罐等。用定 量的無菌水沖洗表面，收集淋洗水，用膜過濾法來計(jì)算微生物數(shù)量。缺點(diǎn)：適用性不廣，需要額外的操作，取樣和處理過程可能會(huì)影響結(jié)果。人員衛(wèi)生監(jiān)測人員是無菌生產(chǎn)中主要污染源。對(duì)于無菌藥品的人員要求參見“4人員”。人員衛(wèi)生監(jiān)測的方法與表面微生物監(jiān)測方法中的接觸

4、碟法相同。培養(yǎng)(piyng)基及培養(yǎng)條件環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的類型和培養(yǎng)條件取決于所選用的檢測(jin c)方法，但必須具有廣譜性。 通常，營養(yǎng)瓊脂（NA)或大豆(ddu)胰蛋白胨瓊脂（TSA)培養(yǎng)基屬于全能型培養(yǎng)基。此類培 養(yǎng)基適用于多數(shù)環(huán)境微生物（包括真菌）的分離生長。但是，對(duì)專用于酵母菌分離生長的 特定培養(yǎng)基，仍應(yīng)另行選擇，如玫瑰紅鈉瓊脂、薩布羅（Sabourauds)培養(yǎng)基等都是常用 的真菌培養(yǎng)基。如果被監(jiān)測環(huán)境中使用過消毒劑或存在抗生素，則要向表面監(jiān)測用培養(yǎng)基 中加一些添加劑（聚山梨酯80、卵磷脂、偶氮凝集素或(3-內(nèi)酰胺酶等），以中和或盡量 減少消毒劑或抗生素的抑菌作用。例如，在對(duì)非抗

5、生素生產(chǎn)級(jí)區(qū)環(huán)境設(shè)施表面監(jiān)測時(shí)，通 常是在營養(yǎng)瓊脂或大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)添加0.7%的聚山梨酯80和0. 1%的卵 磷脂。應(yīng)對(duì)環(huán)境監(jiān)測用微生物培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證其在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間和溫度條件下檢出真菌 (包括酵母菌和霉菌）和細(xì)菌的能力。用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基，首先應(yīng)檢查其可靠地恢復(fù)微生物生長的能力。所有配好的培 養(yǎng)基批號(hào)，均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)，表14-4列出了環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基靈敏度檢查菌 種。必要時(shí)，應(yīng)使用中和劑，防止?jié)崈羰蚁緞┗虍a(chǎn)品殘留（如抗生素）抑制微生物生 長。培養(yǎng)基靈敏度檢查試驗(yàn)中，可加人環(huán)境監(jiān)測中分離的菌株進(jìn)行試驗(yàn)，接種量應(yīng)不超過 100個(gè)菌。培養(yǎng)基相關(guān)的其他內(nèi)容，參見“15.6

6、培養(yǎng)基”。表14 -4推薦環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基靈敏度檢查菌種分類菌 種菌株號(hào)箔氧菌祜草芽孢桿菌(Bacillus suhtUis)CMCC (B) 63 501ATCC 6633金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus )CMCC (B) 26 003ATCC 6538銅綠假單胞菌(Pscudomonas aeruginosa)CMCC (B) 10 104ATCC 9027環(huán)境監(jiān)測中分離的菌株厭氧菌生抱梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC (B) 64 941ATCC 11437 ATCC 18404真菌白色念珠菌（Candida albicans)CM

7、CC (F) 98 001ATCC 10231黑曲瘡(Aspergillus niger )CMCC (F) 98 003ATCC 16404一旦選定培養(yǎng)基，需確定培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。通常，需氧菌應(yīng)在30培養(yǎng) 48 72小時(shí)。酵母菌和霉菌數(shù)通常在20-ZSt,培養(yǎng)57天。監(jiān)測(jin c)方法的確認(rèn)方法確認(rèn)的手段包括(boku)以下幾種。進(jìn)行(jnxng)回顧性驗(yàn)證/確認(rèn)，即回顧環(huán)境監(jiān)測的歷史數(shù)據(jù)，并對(duì)這些監(jiān)測數(shù)據(jù)的重現(xiàn) 性予以評(píng)價(jià)。參進(jìn)行挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，證明監(jiān)測方法的回收率。該法應(yīng)用廣泛，也可作為回顧性驗(yàn) 證/確認(rèn)的支持性資料。進(jìn)行監(jiān)測后取樣點(diǎn)的清潔消毒效力測試。對(duì)接觸碟法和擦拭法，有時(shí)同樣需進(jìn)

8、行方法確認(rèn)。方法是，將從環(huán)境中分離到得代表 性微生物，接種于無菌的試驗(yàn)表面，接種量不超過100CFU，然后按常規(guī)方法進(jìn)行取樣及 處理，計(jì)算回收率。用于接種的試驗(yàn)表面通常為方形或圓形薄片，材料多為塑料、玻璃和 不銹鋼類，以盡可能模擬實(shí)際監(jiān)測時(shí)的環(huán)境設(shè)施表面。通?？梢圆蒘引用相關(guān)文獻(xiàn)或技術(shù) 報(bào)告的方法來證明該取樣方法的適用性。在方法確認(rèn)階段，應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度等進(jìn)行評(píng)估，以確定適于環(huán)境中 代表性微生物的最佳培養(yǎng)條件。同時(shí)，應(yīng)確定適用于真菌、厭氧微生物或特定的控制性微 生物（指可能嚴(yán)重影響環(huán)境的微生物）的選擇性培養(yǎng)基。一旦培養(yǎng)基供應(yīng)商、接觸碟、拭 子或監(jiān)測方法發(fā)生變更，則需重新確認(rèn)。如果

9、決定變更取樣方法，變更前必須進(jìn)行相應(yīng)的 驗(yàn)證/確認(rèn)性試驗(yàn)，以保證新方法等效或優(yōu)于現(xiàn)行方法。取樣計(jì)劃【背景介紹】環(huán)境監(jiān)測的取樣計(jì)劃在各生產(chǎn)企業(yè)各不相同，這取決于一些影響因素，包括但不局限 于產(chǎn)品的類型、生產(chǎn)過程、設(shè)施/工藝的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)密度、人為干擾、環(huán)境監(jiān)測歷史數(shù)據(jù) 等。沒有一個(gè)單獨(dú)的取樣方案適用于所有的監(jiān)測。環(huán)境監(jiān)測的頻率及取樣fi,最好能及時(shí) 發(fā)現(xiàn)所有人為干預(yù)、偶發(fā)事件及任何系統(tǒng)的損壞。由無菌工藝生產(chǎn)的無菌產(chǎn)品與最終滅菌 處理的無菌產(chǎn)品相比，前者的環(huán)境監(jiān)測尤為重要。取樣計(jì)劃應(yīng)隨著取樣頻率的變化而變 化，根據(jù)趨勢(shì)分析對(duì)取樣點(diǎn)數(shù)量做出相應(yīng)的調(diào)整，既可增加，也可減少。【技術(shù)要求】根據(jù)生產(chǎn)環(huán)境對(duì)產(chǎn)品

10、污染風(fēng)險(xiǎn)的高低，確定取樣計(jì)劃。例如，對(duì)無菌工藝產(chǎn)品的A級(jí) 區(qū)取樣頻率可設(shè)為每批一次；I)級(jí)區(qū)的非關(guān)鍵輔助區(qū)取樣頻率可設(shè)為每季度一次?！緦?shí)例分析】表14-5某公司(n s)無菌藥品不同生產(chǎn)用潔凈環(huán)境的常規(guī)取樣頻率和監(jiān)控項(xiàng)目（僅供參考)監(jiān)控區(qū)（潔凈度級(jí)別監(jiān)控頻率監(jiān)控項(xiàng)目最終滅菌產(chǎn)品 生產(chǎn)區(qū)域稱擻配料、配液 (以C級(jí)區(qū)為例）每月一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物灌封間 (以C/A級(jí)區(qū)為例）每周一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物軋蓋間、洗塞間 (以C/A級(jí)區(qū)為例）每月一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物容器

11、精洗區(qū) (以D級(jí)區(qū)為例）每季度一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物非最終 滅菌產(chǎn)品 生產(chǎn)區(qū)域稱傲配料、配液 (以C/A級(jí)區(qū)為例每周一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物無菌灌封輔助區(qū) (以C級(jí)區(qū)為例）每周一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物無菌潲封間 (以B/A級(jí)區(qū)為例）每批一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套和操作服表面微生物微生物實(shí)驗(yàn)室無菌實(shí)驗(yàn)室 (以B/A級(jí)區(qū)為例）每次實(shí)驗(yàn)空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套和操作服表面微生物限度檢查實(shí)驗(yàn)室(以C/A級(jí)區(qū)為例）每周一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌

12、 空氣沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物抗生素效價(jià)測定室 (以D級(jí)區(qū)為例）每月一次空氣懸浮粒子 空氣浮游菌 空氣沉降菌 表面微生物注：（1每月一次。14.3.4取樣(qyng)點(diǎn)及取樣量的設(shè)置 【背景介紹】取樣位點(diǎn)的選擇很大程度上取決于潔凈室的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)過程。在選擇取樣點(diǎn)時(shí)，應(yīng)對(duì) 每個(gè)程序仔細(xì)認(rèn)真地加以評(píng)估。取樣的主要的目的是提供有價(jià)值并可用于判斷的數(shù)據(jù)(shj)，以 便鑒別/識(shí)別特定程序、設(shè)備、材料和工藝相關(guān)的實(shí)際或潛在的污染(wrn)。取樣應(yīng)設(shè)在如果取 樣點(diǎn)受到污染，則產(chǎn)品很可能受到污染的那些位置，然而，必須謹(jǐn)慎地確定取樣點(diǎn)的位 置，靠近產(chǎn)品但不要接觸產(chǎn)品?！緦?shí)施指導(dǎo)】常規(guī)監(jiān)測取樣位

13、點(diǎn)應(yīng)考慮如下因素：在哪些部位的微生物污染，最可能對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量造成不良影響？在生產(chǎn)過程中，什么地點(diǎn)最容易長菌？取樣點(diǎn)的選擇需要統(tǒng)計(jì)學(xué)設(shè)計(jì)（例如，按照美國標(biāo)準(zhǔn)209E來計(jì)算）還是根據(jù)網(wǎng) 格法來確定？在常規(guī)監(jiān)測中，有一些點(diǎn)需要周轉(zhuǎn)取樣嗎？哪些地方是清潔、消毒或滅菌時(shí)最難覆蓋/接觸或最難奏效的部位？什么活動(dòng)會(huì)導(dǎo)致污染的擴(kuò)散？參在某一部位的取樣操作，足以導(dǎo)致測試數(shù)據(jù)的差錯(cuò)或污染產(chǎn)品嗎？取樣只應(yīng)在生 產(chǎn)結(jié)束或換班時(shí)進(jìn)行嗎？為了建立常規(guī)的取樣位點(diǎn)，必須考慮產(chǎn)品與其接觸或暴露的環(huán)境的程度。對(duì)反映產(chǎn)品 的微生物污染水平有代表性的取樣點(diǎn)必須取樣和進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測。與產(chǎn)品接觸的來源可能包 括壓縮氣體，房間空氣，生產(chǎn)設(shè)備，

14、工具，關(guān)鍵表面，儲(chǔ)存容器，傳送帶，手套，人員以 及水。不與產(chǎn)品直接接觸的來源可能包括：墻，地，天花板，門，長発，椅子，測試儀器 和緩沖間。但是，最關(guān)鍵點(diǎn)的位置作為取樣點(diǎn)并不一定適用。必須考慮環(huán)境監(jiān)測是否實(shí)際上會(huì)加 大產(chǎn)品污染風(fēng)險(xiǎn)的概率。此外，如果在生產(chǎn)過程中污染的概率很低，就不必要對(duì)關(guān)鍵點(diǎn)取 樣（例如，不再需要手工操作的已滅菌部件）。確立一個(gè)合適的取樣點(diǎn)需要考慮很多因素，比如廠方設(shè)施，生產(chǎn)線的設(shè)定，驗(yàn)證數(shù) 據(jù)，生產(chǎn)過程，歷史數(shù)據(jù)，測試方法等。潔凈區(qū)（室）監(jiān)測中的取樣點(diǎn)和取樣量可以比潔凈級(jí)別確認(rèn)時(shí)的取樣點(diǎn)和取樣量少， 應(yīng)該通過正式的風(fēng)險(xiǎn)分析研究和對(duì)監(jiān)測結(jié)果的分析（至少要有6個(gè)月以上的運(yùn)行數(shù)據(jù)作為

15、 分析基礎(chǔ)），來確定監(jiān)測頻次和限度。同時(shí)，監(jiān)測頻次和限度的確定也要考慮到生產(chǎn)工藝 因素，監(jiān)測限度及取樣點(diǎn)應(yīng)該定期進(jìn)行回顧驗(yàn)證，以保證監(jiān)測行為的有效性。國標(biāo) GB/T 162922010、GB/T 162932010 和 GB/T 162942010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室 (區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法(fngf)中規(guī)定了最少采樣點(diǎn)的數(shù)目。最少采樣點(diǎn)數(shù) 目可在以下兩種方法中任選一種。(1)利用(lyng)公式計(jì)算N,=AS最少采樣(ci yn)點(diǎn)數(shù)(四舍五人為整數(shù)）；-4潔凈室或潔凈區(qū)的面積，m2。注：在單向流悄況下.面積/!可以認(rèn)為fi垂直于氣流方向上的橫截面面積。(2)最少采樣點(diǎn)數(shù)可從表

16、14-6查到。表14-6潔凈區(qū)空氣懸浮粒子、浮游菌及沉降菌的最少取樣點(diǎn)數(shù)面積（m2)潔凈級(jí)別10010000100000102-322彡 10 20- 40822多 40 1001642彡 100- 20040103200- 40080206400- 10001604013彡 1000 200040010032彡200080020063注：此表摘自GB/T 162922010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子的測試方法。環(huán)境取樣在遵循最低取樣點(diǎn)數(shù)的同時(shí)，還須執(zhí)行以下規(guī)則?？諝鈶腋×Ｗ訁⑷魏螡崈魠^(qū)內(nèi)取樣點(diǎn)應(yīng)不少于兩個(gè)；除受潔凈(jijng)區(qū)的設(shè)備限制外，取樣點(diǎn)應(yīng)在整個(gè)潔凈區(qū)均勻布置；在一個(gè)區(qū)域內(nèi)應(yīng)最

17、少取樣(qyng)五次，每個(gè)取樣點(diǎn)的取樣次數(shù)可多于一次，不同取樣點(diǎn)的 取樣次數(shù)可以不同；為了確定A級(jí)區(qū)的級(jí)別(jbi)，每個(gè)采樣點(diǎn)的采樣量不得少于丨m3。參取樣點(diǎn)一般布置在距離地面0. 8 1. 5m之間或操作平臺(tái)的高度；參盡量避免在回風(fēng)口附近取樣，而且測試人員應(yīng)站在取樣口的下風(fēng)側(cè)。空氣浮游菌參除受潔凈區(qū)的設(shè)備限制外，取樣點(diǎn)應(yīng)在整個(gè)潔凈區(qū)均勻布置。在日常監(jiān)控時(shí)，那些與產(chǎn)品相鄰近的區(qū)域，以及可能與產(chǎn)品直接接觸的空氣及設(shè) 備附近均應(yīng)考慮增加取樣點(diǎn)和取樣次數(shù)（與產(chǎn)品非接觸區(qū)相比，這些區(qū)域應(yīng)視為 關(guān)鍵區(qū)h人員活動(dòng)頻繁或人員較集中的區(qū)域也應(yīng)被視為關(guān)鍵區(qū)，需加強(qiáng)監(jiān)控。參取樣點(diǎn)一般布置在距離地面0. 8 1

18、. 5m之間或操作平臺(tái)的高度。取樣時(shí)，取樣設(shè)備會(huì)對(duì)氣流產(chǎn)生干擾，因此，動(dòng)態(tài)測試空氣浮游菌取樣時(shí)應(yīng)避免 可能對(duì)氣流組織的干擾。參應(yīng)根據(jù)被測區(qū)域的浮游菌控制限度和取樣方式確定取樣量，每個(gè)點(diǎn)一般采樣一次。盡量避免在回風(fēng)口附近取樣（距離lm以上），且測試人員應(yīng)站在取樣口的下風(fēng) 側(cè)，并盡量少走動(dòng)。沉降菌測試取樣點(diǎn)的分布及其取樣位置與空氣浮游菌監(jiān)測相同；日常監(jiān)控可以根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析 結(jié)果，沉降菌與浮游菌交替或混合取樣。參沉降時(shí)間至少為半小時(shí)，但不得超過4小時(shí)。表面微生物測試表面微生物監(jiān)測的取樣點(diǎn)數(shù)應(yīng)依下列因素確定：參潔凈區(qū)（室）的大?。辉O(shè)備、管路等的復(fù)雜程度；參生產(chǎn)活動(dòng)的重要性；參易受污染的部位等。應(yīng)考慮包含以下部位：每扇門、每個(gè)門把手、地板（至少兩點(diǎn)）、墻壁（不易被清 潔/消毒的部位，至少兩點(diǎn)）、公用介質(zhì)的管路（不易被清潔/消毒部位）、生產(chǎn)設(shè)備的關(guān) 鍵性部位（如灌裝針、易與人員接觸的塑料簾膜、膠塞筒、傳輸帶）等。根據(jù)潔凈區(qū)內(nèi)設(shè)施、設(shè)備等表