DB13_T 5584-2022-兔須癬毛癬菌診斷與防治技術(shù)規(guī)程

1、ICS11.220CCSB 4113河北省地方標(biāo)準(zhǔn)DB 13/T 55842022兔須癬毛癬菌診斷與防治技術(shù)規(guī)程2022 - 05 - 31 發(fā)布2022 - 07 - 01 實(shí)施河北省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB 13/T 55842022前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：河北工程大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：柳煥章、劉建釵、于國杰、劉利強(qiáng)、劉會洽、杜鵑、劉彥威、劉娜、崔國林、劉艷莉、吳志勇、崔玉革、李晶晶、婁路平、李夫宏、劉孟嘯、趙梓筱。I兔須癬毛癬菌診斷與防治技術(shù)規(guī)程DB 13/T 5

2、5842022范圍本文件規(guī)定了兔須癬毛癬菌病的臨床診斷、實(shí)驗室診斷和綜合判定。本文件適用于兔類、牛、羊、犬、貓等須癬毛癬菌病的診斷及其須癬毛癬菌病原的檢測和防治。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB51/T 1419-2012 大熊貓須癬毛癬菌病檢驗技術(shù)規(guī)范術(shù)語和定義須癬毛癬菌 Trichophyton mentagrophytes 為人畜共患的皮膚真菌。縮略語下列縮略語適用于本文件。 PDA：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基； TSA：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基；YEP

3、D：酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基； DMSO：二甲基亞砜；臨床診斷當(dāng)兔出現(xiàn)以下部分或全部情形時，可作為初步診斷的依據(jù)。 臨床癥狀感染的兔皮膚出現(xiàn)瘙癢、脫毛和皮膚炎癥，以頭部、四肢部位最多。各種年齡的兔均可感染。 病理變化病變部位因脫毛而露出粉紅色的皮膚并發(fā)炎，有的出現(xiàn)結(jié)痂，有的結(jié)痂下面出現(xiàn)化膿性炎癥。實(shí)驗室診斷包括常規(guī)檢測和定量PCR檢測技術(shù)。 常規(guī)檢測樣品采集將患皮癬病的兔，用75%酒精對患處消毒，取無菌手術(shù)刀刮取患處及邊緣的皮屑、痂皮和被毛等病料，放入無菌的離心管中于冷藏保存。病原菌的分離純化與形態(tài)觀察把采集的病料接種到沙氏培養(yǎng)基（含0.5 mg/mL氯霉素）平板，放入27真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)10

4、d， 觀察菌落生長情況菌落特征，并涂片鏡檢，確定純化后保存?zhèn)溆谩φ胀庙毎_毛癬菌菌典型菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒別（參見附錄A ）。1DB 13/T 55842022病料顯微鏡檢查（改良的 KOH 法）取少量病料（皮屑、被毛等），放在清洗干凈的載波片上，滴加改良復(fù)方KOH溶液（KOH 15 g加入30 mL蒸餾水中溶解后，依次加入DMSO 40 mL，甘油20 mL，搖勻后加入蒸餾水至1000 mL混勻）1 2滴，加蓋玻片，用濾紙吸凈周邊溢液，在顯微鏡下鏡檢。結(jié)果判斷：將同種病料連續(xù)重復(fù)兩次檢查，以病料中查到特征性菌絲和孢子為陽性結(jié)果，以檢查不到菌絲和孢子為陰性。 定量 PCR 檢測樣品

5、采集從發(fā)病的兔場選擇有典型皮膚真菌病的家兔，在病變與健康皮膚組織交界處，用無菌手術(shù)刀片刮取皮屑，放入滅菌的平皿中冷藏保存?；蚪M DNA 提取使用真菌DNA提取試劑盒提取。引物合成參照GenBank中兔須癬毛癬菌benAfum基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（KP099602），使用Primer Express 6.0軟件設(shè)計特異性引物（預(yù)期擴(kuò)增片段大小140bp）：上游引物F：（5-GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG-3） 下游引物R：(5-GGAGACCATCTGTGAGAGTT-3)定量 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序采用25 L的反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq（2）12.5 L，上

6、、下游引物各0.5 L，DNA模板1.0 L，用雙蒸水補(bǔ)足至25 L。反應(yīng)程序為：94 預(yù)變性60 S；94 10 S，60 30 S， 72 30 S，進(jìn)行40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，作熔解曲線，采用軟件自動分析。6.2.5 結(jié)果判斷當(dāng)待測樣品實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果有“S”型擴(kuò)增曲線，Ct值36.5，且Tm值介于86.48 86.65 之間時，判定待測樣品中含有須癬毛癬菌。未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線和Tm值，則判斷樣品中不含須癬毛癬菌。綜合判定結(jié)合臨床診斷、實(shí)驗室檢測結(jié)果，可確診兔須癬毛癬菌病。綜合防治 預(yù)防措施環(huán)境病原菌的凈化?？刹捎没鹧鎳姎⒒蚧饓A等消毒產(chǎn)品的噴灑，保持兔舍和運(yùn)動場寬敞，陽光充足；保持墊料清潔干燥，發(fā)現(xiàn)病兔及時隔離或移除?？茖W(xué)飼養(yǎng)管理，提高兔群的免疫力和抗病能力。 治療措施根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選擇敏感抗真菌藥物治療。對病兔的藥物治療宜采用內(nèi)服與外敷相結(jié)合的方法。2DB 13/T 55842022AA附 錄 A（資料性）須癬毛癬菌形態(tài)學(xué)判斷A.1 須癬毛癬菌形態(tài)學(xué)判斷須癬毛癬菌菌落形態(tài)特征為：在PDA培養(yǎng)基上，菌落為白色，中央致密稍凸起，