獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教材(共27頁)

1、獸醫(yī)(shuy)實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)暨生物安全(nqun)管理培訓(xùn)班教程呂梁市動(dòng)物(dngw)疫病預(yù)防控制中心二一年六月目 錄一動(dòng)物疫病診斷(zhndun)技術(shù)1、口蹄疫正向間接血凝試驗(yàn)(shyn)操作規(guī)程2、禽流感血凝抑制(yzh)試驗(yàn)3、新城疫血凝抑制試驗(yàn)4、豬瘟正向間接血凝試驗(yàn)操作規(guī)程5、布氏桿菌凝集試驗(yàn)6、ELISA檢測方法二、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室儀器操作規(guī)程三、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全管理四、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量控制五、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室管理制度第一部分 動(dòng)物(dngw)疫病診斷技術(shù)口蹄疫正向(zhn xin)間接血凝試驗(yàn)操作規(guī)程一、原理(yunl) 用已知血凝抗原檢測未知血清抗體的試驗(yàn)，稱為正向間接血凝試驗(yàn)，亦稱

2、間接血凝。 抗原與其對(duì)應(yīng)的抗體相遇，在一定條件下形成抗原抗體復(fù)合物。但這種復(fù)合物的分子團(tuán)很小，肉眼看不見。將抗原吸附（致敏）在紅血球表面，再與抗體結(jié)合，紅血球便出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，不僅肉眼能看見，而且反應(yīng)的敏感性大大提高。本法就是將口蹄疫純化病毒致敏到綿羊紅血球表面，制成口蹄疫血凝抗原，用于檢測動(dòng)物血清中的口蹄疫抗體水平。 二、適用范圍 主要(zhyo)用于檢測口蹄疫疫苗接種動(dòng)物血清抗體效價(jià)。 三、試驗(yàn)(shyn)器材 1、 96孔110120度V型醫(yī)用血凝板，與血凝板大小(dxio)相同的玻板。 2、 微量移液器與吸頭。 3、 口蹄疫血凝抗原（口蹄疫正向血凝診斷液）。 4、 口蹄疫陰性血清。 5、

3、 口蹄疫陽性血清。 6、 稀釋液 7、 待檢血清（被檢血清） 四、試驗(yàn)方法 1、加稀釋液 在血凝板上16排的19孔；第7排的14孔，第67孔；第8排的112孔各加稀釋液50微升。 2、稀釋待檢血清 取1號(hào)待檢血清50微升加入第1排第1孔，混勻（避免產(chǎn)生過多的氣泡），取出50微升移入第2孔，混勻后取出50微升移入第3孔直到第9孔混勻后取出50微升丟棄。此時(shí)第1排19孔待檢血清的稀釋度（稀釋倍數(shù)）依次為：1:2,1:4,1:8,1:16,1;32,1:64,1:128,1:256,1:512。 取2號(hào)待檢血清加入第2排；取3號(hào)待檢血清加入第3排均按上法稀釋，注意！每取一份血清時(shí)，必須更換(gnhu

4、n)吸頭一個(gè)。 3、稀釋陰性(ynxng)對(duì)照血清 在血凝板上的第7排第1孔加陰性血清50微升，對(duì)倍稀釋至第4孔，混勻后從該孔取出50微升丟棄。此時(shí)(c sh)陰性血清對(duì)照孔依次為：1:2,1:4,1:8,1:16。第67孔為稀釋液對(duì)照。4、稀釋陽性對(duì)照血清 在血凝板上的第8排第1孔加入陽性血清50微升，對(duì)倍稀釋至第12孔，混勻后從該孔取出50微升丟棄，此時(shí)陽性血清稀釋倍數(shù)為1:21:4096。 5、加血凝抗原 被檢血清各孔、陰性對(duì)照血清各孔、陽性對(duì)照血清各孔、稀釋液對(duì)照孔均各加血凝抗原25微升（充分搖勻，瓶底應(yīng)無稀釋液對(duì)照）。 6、振蕩混勻 將血凝板置于微量振蕩器上振蕩1分鐘，如無振蕩器，用

5、手搖勻亦可。然后將血凝板放在白紙上觀察各孔紅血球是否混勻，不出現(xiàn)血球沉淀為合格。蓋上玻板，室溫下靜置1.52小時(shí)判定結(jié)果，也可延至翌日判定。 7、 判定標(biāo)準(zhǔn) 移去玻板，將血凝板放在白紙(bi zh)上，先觀察陰性對(duì)照血清1:16孔，稀釋液對(duì)照孔，應(yīng)無凝集，或僅出現(xiàn)“+”凝集。 陽性血清對(duì)照1:21:256各孔應(yīng)出現(xiàn)(chxin)“+”凝集為合格。 在對(duì)照孔合格的前提下，再觀察(gunch)待檢血清各孔，以呈現(xiàn)“+”凝集的最大稀釋倍數(shù)為該份血清的抗體效價(jià)。例如1號(hào)待檢血清15孔呈現(xiàn)“+”凝集，67孔呈現(xiàn)“+”凝集，第8孔呈現(xiàn)“+”凝集，第9孔無凝集，那么就可判定該份血清的口蹄疫抗體效價(jià)為1:12

6、8。 接種O型口蹄疫滅活苗的豬群血清O型抗體效價(jià)達(dá)到1:128（或1:128以上）為免疫合格。 五、注意事項(xiàng) 1、 為使您的檢測獲得正確結(jié)果，請(qǐng)您在檢測前仔細(xì)閱讀試劑盒內(nèi)的說明書。 2、 嚴(yán)重溶血或嚴(yán)重污染的血清樣品不宜檢測，以免發(fā)生非特異性反應(yīng)。 3、 勿使用90度和130度血凝板，以免誤判結(jié)果。 4、 用過的血凝板應(yīng)及時(shí)在水龍頭下沖凈血球，再用蒸餾水或去離子水沖洗2次，甩干水份放37恒溫箱內(nèi)干燥備用。檢測用具應(yīng)煮沸消毒，37干燥備用。 5、 每次檢測(jin c)只做一份陰性、陽性和稀釋液對(duì)照。禽流感血凝抑制(yzh)試驗(yàn)（HI）一、原理(yunl)禽流感病毒在適宜的條件下對(duì)雞、人、豚鼠的

7、紅細(xì)胞具有凝集作用，這種血凝作用可被特異性抗體所抑制，抗體與病毒結(jié)合后，可使血凝素不能吸附于紅細(xì)胞表面的受體上，禽流感血凝抑制試驗(yàn)可應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)病毒液測定血清中的相應(yīng)抗體，也可應(yīng)用特異性抗體鑒定新分離的病毒。 二、試劑(shj)與材料 1器材：96孔V型微量血凝反應(yīng)板；單、多道微量移液器；滴頭；微量振蕩器；普通天平(tinpng)；分析天平；普通離心機(jī)；高壓滅菌器。 2試劑(shj) 2.1禽流感病毒血凝素分型抗原和標(biāo)準(zhǔn)分型陽性血清。 2.2 1%雞紅細(xì)胞懸液（RBC） 2.3 PH7.20.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS） 三、操作步驟 3.1微量血凝試驗(yàn)（HA） 于V微量血凝反應(yīng)板的每孔中

8、滴加PBS25ul，共滴四排。 吸取病毒抗原滴加于第一列孔，每孔25ul，然后由左至右順序倍比稀釋至第11列孔，再從第11列孔各吸取25ul棄之。 于每孔中再加入PBS25ul。 于每孔中加入1%雞紅細(xì)胞懸液25ul。 置微型振蕩器上振蕩混勻，室溫（約20）靜置40分鐘，或460分鐘，應(yīng)在對(duì)照孔的RBC顯著呈鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果。 以紅細(xì)胞完全凝集（+）的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝效價(jià)，表示一個(gè)HA單位（HAU）。每次四排重復(fù)，以幾何均值表示結(jié)果。 計(jì)算(j sun)出含4個(gè)血凝單位的抗原濃度，按如下公式進(jìn)行計(jì)算： 抗原(kngyun)應(yīng)稀釋倍數(shù)=血凝滴度/4 3.2 微量血凝抑制(yzh)試驗(yàn)

9、（HI） 于微量血凝反應(yīng)板111孔中加入25ulPBS，第12孔加入50ulPBS。 吸被檢血清25ul于第1孔中，混勻后吸于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，最后棄去25ul。 1-11孔均加入含4個(gè)HAU的病毒抗原液，室溫下靜置不少于30分鐘，4不少于60分鐘。 滴加25ul1%紅細(xì)胞懸液與各孔中，振蕩混合后，室溫下靜置40min,或460分鐘，應(yīng)在對(duì)照孔的RBC顯著呈鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果。 四、結(jié)果判定 完全抑制4HAU抗原的最高血清稀釋倍數(shù)為HI效價(jià)。 陰性對(duì)照血清效價(jià)不高于2log2,和陽性對(duì)照血清效價(jià)應(yīng)在已知效價(jià)的一個(gè)稀釋度以內(nèi)，結(jié)果有效。HI效價(jià)小于或等于3log2判定HI試驗(yàn)陰性；H

10、I效價(jià)等于4log2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)，HI效價(jià)大于或等于5log2為陽性。五、注意 在該試驗(yàn)中，雞血清極少出現(xiàn)非特異性陽性反應(yīng)，沒有必要(byo)在試驗(yàn)前對(duì)血清進(jìn)行處理，除雞外有些禽的血清可能對(duì)雞紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性凝集素，每0.5ml血清中加入0.025ml雞紅細(xì)胞，輕搖后靜置至少30分鐘，800轉(zhuǎn)離心25分鐘，小心移去吸附的血清。新城疫紅細(xì)胞血凝抑制(yzh)試驗(yàn)1、 儀器設(shè)備： a. 微量血凝板：V型、96孔;b. 微型(wixng)振蕩器； c. 塑料采血管；d. 微量可調(diào)移液器：50L 2 、試劑 2.1 稀釋液 PH7.07.2磷酸緩沖鹽水 氯化鈉(GB16677) 170g 磷酸

11、二氫鉀(GB127477) 13.6g 氫氧化鈉(GB62977) 3.0g 蒸餾水 1000mL 高壓(goy)滅菌，4保存(bocn)，使用時(shí)作20倍稀釋 2.2 濃縮抗原 2.3 0.5%紅細(xì)胞懸液 采成年雞血，用20倍量磷酸緩沖鹽水洗滌34次，每次以2000r/min離心34min，最后一次5min，用磷酸緩沖鹽水配成0.5%懸液。 2.4 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清 3、 被檢血清 每群雞隨機(jī)采血2030份血樣，分離血清。 采血法：先用三棱針刺破翅下靜脈，隨即用塑料管引流血液至68cm長。將管一端燒融封口，待凝固析出血清后以1000r/min離心5min，剪斷塑料管，將血清倒入一塊塑料板小孔中。若

12、需較長時(shí)間保存，可在離心后將凝血塊一端剪去，滴融化石蠟封口，于0保存。 4、 操作方法 4.1 微量血凝試驗(yàn) 4.1.1 于微量血凝板(1.1)的每孔中滴加稀釋液(2.1)50L，共滴四排。 4.1.2 吸取1:5稀釋抗原滴加于第一列孔，每孔50L，然后由左至右順序倍比稀釋至第11列孔，再從第11列孔各吸取50L棄之。最后一列不加抗原作對(duì)照。 4.1.3 于每孔中加入0.5%紅細(xì)胞懸液(2.3)50L。 4.1.4 置微型振蕩器(1.2)上振蕩1min，或手持血凝板繞圓圈混勻。 4.1.5 放室溫下(1820)3040min，根據(jù)血凝圖象判定結(jié)果。 以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝

13、滴度。每次四排重復(fù)，以幾何均值表示結(jié)果。 4.1.6 計(jì)算出含4個(gè)血凝單位的抗原濃度。按以下公式進(jìn)行計(jì)算： 抗原應(yīng)稀釋倍數(shù)=血凝滴度/4 4.2 微量血凝抑制試驗(yàn) 4.2.1 先取稀釋液(2.1)50L，加入微量血凝板(1.1)的第1孔，再取濃度為4個(gè)血凝單位的抗原依次加入312孔，每孔50L，第2孔加濃度為8個(gè)血凝單位的抗原50L。 4.2.2 吸被檢血清(3)50L于第1孔（血清對(duì)照）中，擠壓混勻后吸50L于第2孔，依次倍比稀釋至第12孔，最后棄去50L。 4.2.3 置室溫(1820)不作用20min. 4.2.4 滴加50L0.5%紅細(xì)胞懸液(2.3)于各孔中，振蕩混合后，室溫下靜置3

14、040min，判定結(jié)果。 4.2.5 每次測定應(yīng)設(shè)已知滴度的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(2.4)對(duì)照。 5 結(jié)果判定 5.1 在對(duì)照出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，以完全抑制紅細(xì)胞凝集的最大稀釋度為該血清的血凝抑制滴度。 5.2 若有10%以上的雞出現(xiàn)11(log2)以上的高血凝抑制滴度，說明雞群已受新城強(qiáng)毒感染。 5.3若監(jiān)測雞群的免疫水平，則血凝抑制滴度在4(log2)的雞群保護(hù)率為50%左右；在4(log2)以上的保護(hù)率達(dá)90%100%；在以4(log2)下的非免疫雞群保護(hù)率約為9%，免疫過的雞群約為43%。雞群的血凝抑制滴度以抽檢樣品的血凝抑制滴度的幾何平均值表示，如平均水平在4(log2)以上，表示該雞群為

15、免疫雞群。 6 影響血凝抑制試驗(yàn)的因素 6.1 稀釋液 最常用的稀釋液為生理鹽水，要求其無菌、無雜質(zhì)。試驗(yàn)前要先調(diào)整其pH為7.0。若稀釋液生理偏酸性，易使紅細(xì)胞溶解；偏堿時(shí)，吸附于紅細(xì)胞上的病毒易脫落。 6.2 紅細(xì)胞的配制 針管內(nèi)加3.8的枸椽酸鈉抗凝，從翅靜脈（或心臟）采集成年健康未免疫的公雞血，配平，以2 000 rmin離心5 min，3次，生理鹽水洗滌3次，吸去上清液和白細(xì)胞層，配成1紅細(xì)胞懸液，4冰箱中可保存3天，時(shí)間再長會(huì)發(fā)生溶血，最好現(xiàn)配現(xiàn)用，使結(jié)果出現(xiàn)的快且明顯。 6.3 4單位抗原的配制 用血凝試驗(yàn)測出標(biāo)準(zhǔn)抗原的血凝價(jià)，倒退2孔，為此病毒的4單位抗原?？乖×糠盅b，免反

16、復(fù)凍融引起效價(jià)下降，每隔3周測定一次抗原效價(jià)。4單位抗原要現(xiàn)配現(xiàn)用，并設(shè)置對(duì)照。 6.4 反應(yīng)板 最好用96孔V型板，切記不可用試管刷刷板，以免破壞孔內(nèi)壁的光滑性。板必須刷凈，不干凈會(huì)出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。試驗(yàn)完畢后，用自來水反復(fù)沖洗反應(yīng)板，浸在2鹽酸溶液中過夜，再用自來水沖洗，浸入1氫氧化鈉中15min后，拿出用自來水沖洗，最后浸泡于蒸餾水中30min以上，撈出將孔內(nèi)水甩凈，倒放于37恒溫箱中烘干備用。 6.5 被檢血清 采血時(shí)，要一雞一針一管，血清新鮮無雜質(zhì)，無溶血。 6.6 其它因素 要求技術(shù)人員態(tài)度認(rèn)真，技術(shù)熟練，在對(duì)被檢血清進(jìn)行倍比稀釋時(shí)，定量移液器要插入液面以下，出現(xiàn)氣泡，會(huì)影響結(jié)果。加4

17、單位病毒和1紅細(xì)胞懸液時(shí)滴頭要離開液面，最好從后往前加。此外，檢查定量移液器刻度是否精確；做一個(gè)血樣換一個(gè)吸頭；恒溫箱溫度要準(zhǔn)確等等。 綜上所述，在進(jìn)行HI試驗(yàn)的過程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，盡量消除不利因素，減少誤差。豬瘟(zh wn)間接血凝操作方法一、 試驗(yàn)(shyn)材料1、 6孔110-120微量血凝板。2、 10-100微升可調(diào)微量移液器3、 吸頭(tip頭)4、 豬瘟間接血凝抗原(kngyun)（豬瘟正向血凝診斷液），每瓶5毫升，可檢測血清25-30頭份。5、 陽性(yngxng)對(duì)照血清，每瓶2毫升；陰性對(duì)照血清每瓶2毫升6、 稀釋液每瓶10毫升(ho shn)7、 待檢血清(xuq

18、ng)每份0.2-0.5毫升（56水浴滅活30分鐘）二、 操作步驟1、 檢測前，應(yīng)將凍干診斷液每瓶加稀釋液5毫升浸泡7-10天后方可應(yīng)用。2、 稀釋待檢血清：在血凝板上的第一孔第六孔各加稀釋液50ul加入第一孔，混勻后從中取出50ul加入第二孔，依此類推直至第六孔混勻后丟棄50ul，從第一孔第六孔的血清稀釋度依次為1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。3、 稀釋陰性血清和陽性血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀釋液60ul，取陰性血清20ul混勻后取出30ul丟棄。此孔即為陰性血清對(duì)照孔。在血凝板上的第12排第1孔加稀釋液70ul，第2孔第7孔各加稀釋液50ul 。吸取陽性血清

19、10ul，加入第1孔混勻并從中取出50ul加入第2孔直到第7孔混勻并丟棄50ul。該孔的陽性血清稀釋度則為1：512。4、 在血凝板上的第1排第8孔加稀釋液50ul即為稀釋液對(duì)照(duzho)孔。5、 滴加抗原：第1排18孔和對(duì)照孔各加血凝抗原25ul立即置微量震蕩(zhndng)器上震蕩1分鐘，或用手搖勻。室溫下靜置1.5-2小時(shí)。6、 判定方法和標(biāo)準(zhǔn)(biozhn)：先觀察陰性血清對(duì)照好和稀釋液對(duì)照孔，紅血球應(yīng)全部沉入孔底，無凝集現(xiàn)象（）或呈陽性（+）的輕度凝集為合格；陽性血清對(duì)照應(yīng)呈(+)凝集為合格。在以上3孔對(duì)照合格的情況下，觀察待檢血清各孔的凝集程度，以呈“+”凝集的待檢血清最大稀釋

20、度為血凝效價(jià)（血凝價(jià)）。血清的血凝價(jià)達(dá)到1：16為免疫合格?！啊北硎炯t血球100沉于孔底，完全不凝集“+”表示約有25的紅血球發(fā)生凝集“+”表示50紅血球出現(xiàn)凝集“+”表示75紅血球凝集“+”表示90-100紅血球凝集7、 注意事項(xiàng)（1） 勿用90或130血凝板，以免(ymin)誤判。（2） 污染嚴(yán)重或溶血(rn xu)嚴(yán)重的血清樣品不宜檢測。（3） 凍干血凝抗原，必須加稀釋液浸泡710天，方可使用，否則(fuz)易發(fā)生自凝現(xiàn)象。（4） 用過的血凝板，應(yīng)及時(shí)沖洗干凈，勿用毛刷或其它硬物刷洗板孔，以免影響孔內(nèi)光潔度。（5） 使用血凝抗原時(shí)，必須充分搖勻，瓶底應(yīng)無血球沉積。（6） 液體血凝抗原4-

21、8貯存，有效期三年。（7） 如來不及判定結(jié)果或靜置2小時(shí)結(jié)果不清晰，也可放置第二天判定。（8） 每次檢測，只設(shè)陰性、陽性血清和稀釋液對(duì)照各1孔。（9） 稀釋不同的試驗(yàn)要素時(shí)，必須更換塑料咀。（10） 血凝板和塑料咀洗凈后，自然干燥，可重復(fù)使用。 布氏桿菌血清學(xué)診斷(zhndun) 應(yīng)用血清(xuqng)學(xué)方法檢出血清中有抗體存在，則說明被檢動(dòng)物為布氏桿菌病患畜。動(dòng)物感染布氏桿菌以后首先出現(xiàn)的是凝集抗體，再過一段時(shí)間才出現(xiàn)補(bǔ)體結(jié)合抗體，最后產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)性。補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)是一種高度特異性的，其陽性反應(yīng)與感染的符合率，比血清凝集試驗(yàn)與感染的符合率高。此種方法用來鑒別注苗后和自然感染所引起的血清學(xué)反應(yīng)很

22、有價(jià)值，如48個(gè)月犢牛注射19號(hào)菌苗、和山羊注射Revl號(hào)菌苗，經(jīng)過6個(gè)月后補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)為陰性，而血清凝集反應(yīng)仍為陽性或可疑。 我國的家畜布氏桿菌病檢疫應(yīng)用的免疫生物學(xué)方法(fngf)主要是凝集試驗(yàn)，補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)及變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。 1試管凝集反應(yīng)；本試驗(yàn)按家畜布氏桿菌病試管凝集反應(yīng)技術(shù)操作規(guī)程及判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。 (1)材料準(zhǔn)備： 抗原：由獸醫(yī)生物藥品廠生產(chǎn)供應(yīng)。使用時(shí)用0.5石炭酸生理鹽水作1：20稀釋，長霉或出現(xiàn)凝集塊的抗原不能應(yīng)用。被檢血清：必須新鮮，無明顯蛋白凝固，無溶血現(xiàn)象和腐敗氣味。陽性血清和陰性血清：由獸醫(yī)(shuy)生物藥品廠生產(chǎn)供應(yīng)。稀釋液：0.5石炭酸生理鹽水，用化學(xué)純石炭酸與氯

23、化鈉配制，經(jīng)高壓(goy)滅菌后備用。檢疫羊用稀釋液用0.5石炭酸10氯化鈉溶液。 (2)操作步驟： 被檢血清稀釋度：一般情況，牛、馬和駱駝?dòng)?：50、1：100、1：200和1：400四個(gè)稀釋度；豬、山羊、綿羊(minyng)和狗用1：25、1：50、1：100和1：200四個(gè)稀釋度。大規(guī)模檢疫時(shí)也可用兩個(gè)稀釋度，即牛、馬和駱駝?dòng)?：50和1：100；豬、羊、狗用1；25和1：50。 稀釋血清和加入抗原的方法：以羊、豬為例的是：，每份被檢血清用5支小試管(810m1)，第1管加入稀釋液23ml，第2管不加，第3、4和第5管各加入05ml，用lml吸管取被檢血清02ml，加入第1管中，混勻(一

24、般吸吹34次)吸取混合液分別加入第2管和第3管各05ml，將第3管混勻，吸05ml加入第4管，第4管混勻吸取05ml加入第 5管，第5管混勻后棄去05ml。如此稀釋后從第2管起血清稀釋度分別為l：12.5、1：25、1：50和1：100。然后將1：20稀釋的抗原由第2管起，每管加入05ml，血清最后稀釋度由第2管起依次為1：25、1：50、1：100和1；200。 試管凝集試驗(yàn)也可用簡便方式進(jìn)行(jnxng)，即以02ml吸管將被檢血清以0.08、0.04、0.02及0.01分別加入4支小試管內(nèi)，然后每管加入1：40稀釋的抗原lml，充分搖勻，這樣4管血清的最后稀釋度分別為1：25、1：50、

25、1：100、1：200。 牛、馬和駱駝的血清稀釋和加抗原的方法(fngf)與前述者一致，不同的僅第1管加稀釋液 2.4ml及被檢血清0.1ml。加抗原后從第2管到第5管血清稀釋度依次為l：50、1：100、1：200和1：400。每次試驗(yàn)須作三種對(duì)照，陰性血清對(duì)照須將血清稀釋到其原有滴度，其他(qt)步驟同上?？乖瓕?duì)照即將當(dāng)時(shí)使用的乙稀釋抗原0.5ml加稀釋液0.5m1。 每次試驗(yàn)須制備比濁管，以為記錄結(jié)果的依據(jù)，配制方法即以當(dāng)時(shí)使用的已稀釋抗原加等量稀釋液，按表11比例配制。表1l 比濁管配制方法管 號(hào)抗原稀釋液(m1)試驗(yàn)用稀釋液(m1)清 亮 度()標(biāo) 記1234500025050751

26、0007505025001007550250+-全部(qunb)試管充分振蕩后，置3738溫箱中，2224h后用比濁管對(duì)照檢查記錄(jl)結(jié)果。出 現(xiàn)50以上凝集的最高稀釋度就是這份血清的凝集價(jià)，因此50亮度的比濁管很重要。 (3)結(jié)果判定：牛、馬和駱駝血清凝集價(jià)為l：100以上(yshng)，豬、羊和狗1：50以上者，判為陽性。牛、馬和駱駝血清凝集價(jià)為1：50，豬、羊和狗為1：25者判為可疑，可疑反應(yīng)的家畜經(jīng)34周重檢，牛、羊重檢時(shí)仍為可疑，判為陽性。豬和馬重檢時(shí)仍為可疑，但農(nóng)場中未出現(xiàn)陽性反應(yīng)及無臨診癥狀的家畜，判為陰性； 鑒于豬血清常有個(gè)別出現(xiàn)非特異性凝集反應(yīng)，在試驗(yàn)時(shí)須結(jié)合流行病學(xué)判定

27、結(jié)果。如果出現(xiàn)個(gè)別弱陽性(例如凝集價(jià)為1：1001：200)，但豬群中均無臨診癥狀(流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎、睪丸炎)，可以考慮此種反應(yīng)為非特異性，經(jīng)34周可采血重檢。2平板凝集反應(yīng)(fnyng)：這種試驗(yàn)反應(yīng)按家畜布氏桿菌病平板凝集反應(yīng)技術(shù)操作規(guī)程及判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。(1)操作步驟 最好用平板凝集試驗(yàn)箱。無此設(shè)備可用清潔玻璃板，劃成4cm2方格，橫排5格，縱排可以數(shù)列(shli)，每一橫排第一格寫血清號(hào)碼，用02ml吸管將血清以0.08、0.04、 0.02、0.01ml分別依次加于每排4小方格內(nèi)，吸管須稍傾斜并接觸玻璃板，然后以抗原滴智垂直于每格血清上滴加1滴平板抗原(1滴等于0.03ml，如為自制滴管，

28、須事先測定準(zhǔn)確)，或用0.2ml吸管每格加0.03ml。腫牙簽或細(xì)金屬棒將血清抗原混合，均勻。一份血清用一根牙簽，以0.01、0.02、0.03和0.04的順序混合?；旌贤戤厡⒉０寰鶆蚣訙丶s300C左右(無凝集反應(yīng)箱可使用燈泡或酒精火焰)，58min按下列(xili)標(biāo)準(zhǔn)記錄反應(yīng)結(jié)果： +：出現(xiàn)大凝集片或小粒狀物，液體完全透明，即100凝集。 +：有明顯凝集片和顆粒，液體幾乎完全透明，即75凝集。 +：有可見凝集片和顆粒，液體不甚透明，即50凝集。 ：僅僅可以看見顆粒，液體渾濁，即25凝集。 一：液體均勻渾濁，無凝集現(xiàn)象。平板凝集反應(yīng)的血清量0.08、0.04、0.02和0.01ml加入(jir)抗原后，其效價(jià)相當(dāng)于