重組HSV-Ⅱ新型溶瘤病毒疫苗可行性報(bào)告

1、-. z.重組HSV-新型溶瘤病毒疫苗可行性報(bào)告摘要：經(jīng)過重組減毒的型溶瘤單純皰疹病毒在體外具有良好的溶瘤效果，經(jīng)過研究，目前已經(jīng)能建立以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的重組HSV一病毒疫苗反應(yīng)器微載體無血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝，最大病毒滴度可達(dá)到6.62 lgTCID50ml以上。為以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的無血清病毒疫苗規(guī)?；囵B(yǎng)提供了一種簡便、高效的工藝方法，可計(jì)劃用于工業(yè)化生產(chǎn)。關(guān)鍵詞：重組HSV-；Vero細(xì)胞；生物反應(yīng)器；微載體培養(yǎng)正文：產(chǎn)品的意義：目前惡性腫瘤已超過心腦血管類疾病成為首位人類致死性疾病 , 采用Vero細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的重組溶瘤性型單純皰疹病毒(HSV-)具有良好的溶源性、靶向性和安

2、全性 , 具有重要的應(yīng)用價(jià)值。國人類腫瘤疫苗的有關(guān)研究處于剛起步狀態(tài)，面臨多重難題，建立高效的腫瘤疫苗生產(chǎn)工藝具有非常重要的社會和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。經(jīng)過重組減毒的型溶瘤單純皰疹病毒作為高效新型病毒疫苗有望用于腫瘤的臨床研究。圖1.溶瘤病毒的作用機(jī)制生產(chǎn)材料：細(xì)胞培養(yǎng)：Vero 細(xì)胞病毒株：重組型溶瘤單純皰疹病毒HSVII，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。微載體：Cytode* 1生物反應(yīng)器圖2.產(chǎn)品外觀圖3. Cytode* 1微載體圖4.Vero細(xì)胞圖5.生物反應(yīng)器經(jīng)濟(jì)效益：經(jīng)查閱ATCC，Vero細(xì)胞為免費(fèi)（不包郵）；病毒株需向中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所申請?zhí)峁◣缀趺赓M(fèi)）；微載體Cytode* 1市

3、價(jià)為3元/瓶；生物反應(yīng)器可租借。成本保守估計(jì)（不算設(shè)備使用費(fèi)）：每支成本約為6元，預(yù)售價(jià)為98元，除去設(shè)備費(fèi)和人工生產(chǎn)費(fèi)，約可凈得利潤30RMB/支（1ml）。生產(chǎn)工藝流程：圖6.生產(chǎn)車間流程圖在反應(yīng)罐培養(yǎng)間中進(jìn)行重組HSV病毒疫苗的微載體懸浮培養(yǎng)，步驟如下：Cytode* 1微載體制備：稱取一定量Cytode* l置于二甲基二氯硅烷硅化的轉(zhuǎn)瓶瓶子，加入PBS(pH 72)水化，比例約為80150 mLg Cytode* 1，約3h后將PBS傾去，加入新PBS繼續(xù)水化約3 h(可過夜)，傾去并用新的PBS洗滌一次。高壓滅菌121，30min，冷卻后傾去PBS，用培養(yǎng)基洗滌一次后傾去，重新加入新

4、鮮培養(yǎng)基置4冰箱平衡過夜，待用。PBS繼續(xù)水化約3 h(可過夜)，傾去并用新的PBS洗滌一次。高壓滅菌121，30 min，冷卻后傾去PBS，用培養(yǎng)基洗滌一次后傾去，重新加入新鮮培養(yǎng)基置4C冰箱平衡過夜，待用。Vero細(xì)胞的生物反應(yīng)器培養(yǎng)：Cytode* 1濃度為3 gL，接種密度2O30 cellsMC，轉(zhuǎn)速45 rmin，溫度37C，溶解氧濃度(DO)通過Air，O 和N：的進(jìn)氣比控制在40空氣飽和度，pH通過調(diào)節(jié)CO 的進(jìn)氣量和75(wv)NaHCO 控制在71572，進(jìn)行15 L5L反應(yīng)器培養(yǎng)。Vero細(xì)胞的微載體球轉(zhuǎn)球轉(zhuǎn)移培養(yǎng)：Vero細(xì)胞于轉(zhuǎn)瓶反應(yīng)器微載體上培養(yǎng)24d，待長成單層時(shí)

5、，向培養(yǎng)基中加入一定體積的新微載體，與長滿細(xì)胞的老微載體按照一定比例混合，進(jìn)行間歇連續(xù)攪拌培養(yǎng)，待細(xì)胞轉(zhuǎn)移貼附成功后，進(jìn)行常規(guī)連續(xù)攪拌培養(yǎng)。Vero細(xì)胞的微載體在位消化轉(zhuǎn)移培養(yǎng)：Vero細(xì)胞于轉(zhuǎn)瓶反應(yīng)器微載體上培養(yǎng)24d，待細(xì)胞長成單層，即處于指數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行在位消化轉(zhuǎn)移培養(yǎng)。首先停止攪拌，待微載體沉降完全后將培養(yǎng)基排出，用37C溫浴的PBS以約150 ml PBSg MC的體積洗滌兩次。向微載體加入37C溫浴的胰蛋白酶(含002 (WV)EDTA 50 mlg MC)緩慢攪拌約2 min后傾去胰酶液，靜止待細(xì)胞變圓后，以一定的比例加入含新微載體的培養(yǎng)基，并以一定轉(zhuǎn)速快速攪拌約2 min后，

6、補(bǔ)足培養(yǎng)基并以3540 rmin的初始攪拌轉(zhuǎn)速連續(xù)攪拌培養(yǎng)。約培養(yǎng)12 h待細(xì)胞在微載體上完全貼附后，將微載體懸液放大到下一級生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。重組HSV-病毒的反應(yīng)器培養(yǎng)：Vero細(xì)胞于反應(yīng)器微載體上培養(yǎng)24d，待細(xì)胞生長至8090匯合時(shí)，接種病毒。接毒時(shí)將反應(yīng)器培養(yǎng)基排出并用PBS洗滌2次，加入含BSA的無血清病毒維持液(VDLSM)，同時(shí)將培養(yǎng)溫度由37C降為32進(jìn)行病毒培養(yǎng)。待細(xì)胞病變至8090后，將培養(yǎng)液進(jìn)行4C鹽裂解，收獲病毒。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果用ReedMunch公式計(jì)算TCID50。待細(xì)胞病變后收獲病毒。5高效構(gòu)建技術(shù)路線：利用病毒活性增效劑（輔助因子）與重組HSV病毒疫苗共同左右

7、增強(qiáng)產(chǎn)品效力。具體方案如下：首先選擇幾種能夠增強(qiáng)病毒活性的增效劑M1,M2,M3,M4，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)選出能夠有效增強(qiáng)該溶瘤病毒的增效劑。設(shè)置5個相同的培養(yǎng)基（合適的PH，溫度和滲透壓）放入等量腫瘤細(xì)胞作為唯一營養(yǎng)物質(zhì)，1-4號分別加入相同劑量的M1,M2,M3,M4增效劑，5號加入等量生理鹽水作為對照。放在適宜的環(huán)境下培養(yǎng)一定時(shí)間后分別對5個培養(yǎng)基中的腫瘤活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)并腫瘤活細(xì)胞最少的那一組，可以初步得出最佳增效劑。后期反復(fù)實(shí)驗(yàn)已確定前面結(jié)果的正確，最后選出最佳增效劑并適量加入到溶瘤病毒疫苗中，確認(rèn)其安全性后投入到臨床應(yīng)用。6產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：規(guī)格：本品為注射劑，1ml/支.每1次人用劑量為

8、1ml，病毒滴度=6.00 lgTCID50ml;重金屬：含重金屬不得超過百萬分之十;接種部位：手臂三角肌肌肉。無菌檢査：依法檢査（通則1101)，應(yīng)符合規(guī)定;重組病毒疫苗的GMP標(biāo)準(zhǔn):在工作場所，保護(hù)工人遠(yuǎn)離生物制劑暴露的風(fēng)險(xiǎn)；操作規(guī)，正確謹(jǐn)慎處理轉(zhuǎn)基因釋放的（微）生物體或生物體含有重組DNA分子；保證人或獸用生物制品和藥品的安全性，vero細(xì)胞來源的安全性等。7. 參考文獻(xiàn)：1Montagnon B，F(xiàn)anget B，Nicolas AThe largescale cultivation ofVERO cells in micro-carrier culture for virus vac

9、cine productionPreliminary results for killed poliovirus vaccineDevelopments in biological standardization，198147：552Barrett P N，Mundt W，Kistner O，et a1Vero cell platform invaccine production： moving towards cell culturebased viralvaccinesE*pert review of vaccines，2009，8(5)：607-6183Dennehy P H Rotav

10、irus vaccines：an overviewClinicalmicrobiology reviews，2008，21(1)：198-2084Tauber E，Kollaritsch H，Korinek M，et a1Safety and immunogenicity of a Verocellderived， inactivated Japanese encephalitis vaccine：a non-inferiority，phase III，randomised controlled tria1The Lancet，2007，370(9602)：184718535Howard M

11、K，Kistner O，Barrett P NPre-clinical development of cell culture(Vero)一derived H5N1 pandemic vaccinesBiologicalchemistry，2008，389(5)：569-5776Ahmedin Jemal，F(xiàn)reddie Bray，Melissa M Center，et a1Global cancer statisticsCA (a cancer joumal for clinicians)，201 1，61 (2)：69-907Michael J T，John O D，Melissa M C

12、The global buen ofcancer：priorities for prevention Life Sciences and Medicine，2010，31(1)：1001108Audrey L R，Danielle J，Julia T，et a1Scalable production ofinfluenza virus in HEK-2 93 cells for efficient vaccine manufacturingVaccine，2010，28(21)：366136719 Allen Chen，Swan L P，Christian D，et a1Serumfreemi

13、croearrier based production of replication deficient Influenzavaccine candidate virus lacking NS1 using Vero cells BMC Biotechnology，2011，11：8110Maranga L，Brazilo T F，Carrondo M JViruslike particle production at low multiplicities of infection with the baeulovirus insect cell systemBiotechnol Bioeng

14、，2003，84(2)：245-5311Kallel H，Rourou S，Majoul S，et a1A novel process for the production of a veterinary rabies vaccine in BHK-21 cells grown on microcarriers in a 201 bioreactorApplied Microbiology and Biotechnology，2003，61(5)：441_44612Kunal A，F(xiàn)rank J，Luis M，et a1Bioprocess optimization for cell cult

15、ure based influenza vaccine productionVaccine，201 1，29：3320-332813施桂蘭，莊秀芬，香萍，等新型溶瘤病毒oHSV2hGMCSF的構(gòu)建及其抗腫瘤作用中華腫瘤雜志，2012，34(2)：89-95Shi G L，Zhuang * F，Han * P，et al ， Constru ction of a newoncolytic virus oHSV2hGMCSF and its anti-tumor effectsChinese iourual of oncology，2012，34(2)：89-9514龔迪，易小萍，元興MDCK細(xì)胞

16、微載體懸浮培養(yǎng)放大工藝研究中國生物工程雜志，2012，32(009)：55-60GongD，Yi * P，Zhang Y *A study on scale-up process for microcarrier cultue of MDCK cells using low seru m mediumChina Biotechnology，2012，32(009)：55-6015Lehtinen MHSV infected RAJI-cells specify HSV specific immediate early andor early DNAbinding proteins Archives ofVirology，1986，87(1-2)：10711816立，嚴(yán)春，衛(wèi)民，等Vero細(xì)胞的微載體培養(yǎng)放大過程中的接種工藝華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版1998，24(006)：659-663Zhang L，Yan C，F(xiàn)an W M ，et a1Inoculum technology in large scaleeell culture on m