BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明書

1、默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteam定量試劑盒iMERCKH默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteam默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteam試劑盒簡(jiǎn)介以下貨號(hào)試劑盒可參照此說(shuō)明書操作：建議同時(shí)參考本說(shuō)明書英文原文（說(shuō)明書編號(hào)TB380）。BCAProteinAssayKit：500/2500rxn貨號(hào)71285-3BCA蛋白定量方法是基于雙縮脲反應(yīng)，即在堿性溶液中蛋白將Cu2+還原成Cu1+，而根據(jù)檢測(cè)到的單價(jià)Cu離子的濃度可以檢測(cè)體系中對(duì)應(yīng)蛋白的量。Bicinchoninicacid是一種顯色劑，可以螯合被還原的銅離子，產(chǎn)生一種在562nm

2、有強(qiáng)吸收的紫色復(fù)合物。Novagen的BCA試劑盒可以用于測(cè)定濃度在20-2,000g/ml范圍內(nèi)的蛋白的濃度，根據(jù)樣品量分為標(biāo)準(zhǔn)型和微型兩種形式進(jìn)行測(cè)定。試劑盒提供的組分足夠用于500次標(biāo)準(zhǔn)型反應(yīng)（50I蛋白樣品加上1ml反應(yīng)試劑）或2,500次微型測(cè)定（25I蛋白樣品加上200l反應(yīng)試劑，可以在96孔板中進(jìn)行高通量定量）。試劑盒中提供的BSA（牛血清白蛋白，2mg/ml）為用戶制作標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線提供了便利。Novagen的BCA試劑盒準(zhǔn)確度高，兼容性好，能與各種化學(xué)試劑和表面活性劑兼容，可以方便地配合默克Novagen的BugBuster，PopCulture，CytoBuster，Repo

3、rtasol和InsectPopCulture抽提蛋白的細(xì)胞裂解試劑一起使用。有些化學(xué)成分，例如螯合劑，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、還原劑等，可能會(huì)干擾BCA法采用的還原及螯合定量過(guò)程，詳細(xì)情況請(qǐng)看說(shuō)明書后附列表。試劑盒提供的組分500mlBCA反應(yīng)液（0.1MNaOH緩沖的bicinchoninicacid，碳酸鈉，酒石酸鈉，碳酸氫鈉，pH11.25）15ml4%硫酸銅3X1mlBSA標(biāo)準(zhǔn)品（2mg/ml）儲(chǔ)存室溫存放。相關(guān)配套產(chǎn)品可以與默克Novagen各種蛋白抽提、純化試劑盒配套使用。BCA蛋白定量分析制備BSA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線下表是制備各稀釋梯度的BSA標(biāo)準(zhǔn)液的方法。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液都需要使用一個(gè)新的試管。為了

4、盡量保證定量的準(zhǔn)確性，建議采用與蛋白樣品一樣的緩沖液來(lái)稀釋、配制BSA標(biāo)準(zhǔn)液。如果緩沖液中有干擾BCA法的成分，建議用去離子水替代樣品的緩沖液，用以配制BSA濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。制備濃度梯度BSA標(biāo)準(zhǔn)液試管編號(hào)BSA的體積稀釋液的體積BSA的終濃度1從2mg/ml溶液中取250ul250ul1000ug/ml2從管1中取250ul250ul500ug/ml3從管2中取250ul250ul250ug/ml4從管3中取300ul300ul125ug/ml5從管4中取100ul400ul25ug/ml60400ul0ug/ml.MERCK加強(qiáng)型檢測(cè)的BSA濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液的制備試管編號(hào)BSA的體

5、積稀釋液的體積BSA的終濃度1從2mg/ml溶液中取100ul700ul250ug/ml2從管1中取400ul400ul125ug/ml3從管2中取300ul450ul50ug/ml4從管3中取200ul200ul25ug/ml5從管4中取100ul400ul5ug/ml60400ul0ug/mlBCA蛋白定量的工作液的制備下表給出了BCA工作液的制備建議。工作液是以50份的BCA反應(yīng)液與1份4%硫酸銅混合而成。注意：標(biāo)準(zhǔn)型測(cè)定的3C力工作液的體積是每反應(yīng)1ml；這對(duì)于小吸光杯0.7ml）足夠了，如果采用較大的吸光杯，則需要3m/以上的BCA工作液。BCA工作液的制備標(biāo)準(zhǔn)型定量每個(gè)樣品X20B

6、CA溶液1ml20ml4%硫酸銅20ul400ul微型定量BCA溶液200ul4ml4%硫酸銅4ul80ul定量的操作流程以下提供了2種定量操作：標(biāo)準(zhǔn)型定量需要的蛋白樣品較多（50ul），這種情況下BCA工作液與蛋白樣品的體積比是20:1,干擾定量的物質(zhì)的影響會(huì)較??；微型定量需要的蛋白樣品量較少（25ul），非常適合96孔板式的高通量操作。此種情況下BCA工作液與蛋白樣品的體積比是8:1,干擾定量的物質(zhì)的影響相對(duì)會(huì)較大。標(biāo)準(zhǔn)定量操作吸取50ul標(biāo)樣或樣品到標(biāo)記好的試管中。加入1mlBCA工作液。輕柔渦旋混勻。注意：如果吸光杯測(cè)量時(shí)要求的溶液體積較大，反應(yīng)體系體積可能需要增加到Ifem/（即3m

7、lBCA工作液加150/標(biāo)樣或樣品）。標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)：在37C孵育30min或室溫放置2-16h。加強(qiáng)型檢測(cè)：在60C孵育15min。將試管冷卻至室溫。注意：雖然在冷卻至室溫的過(guò)程中顯示反應(yīng)仍在繼續(xù)，如果m/門內(nèi)進(jìn)行讀數(shù)蛋白濃度也不會(huì)產(chǎn)生誤差。在一個(gè)干凈的吸光杯中加入1ml水，在波長(zhǎng)562nm調(diào)零。將待測(cè)液加入干凈的吸光杯。10min內(nèi)測(cè)定并記錄所有反應(yīng)液的吸光值（A）。校正的吸光值是將各標(biāo)樣和試樣的讀數(shù)減去空56白2樣吸光值。結(jié)合已知的BSA標(biāo)樣的量和校正過(guò)的吸光值畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各蛋白試樣的校正吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)讀出各樣品的蛋白濃度。根據(jù)樣品體積和稀釋度計(jì)算原來(lái)樣品中

8、的蛋白量。MERCK微型定量操作吸取25uI標(biāo)樣或樣品分別加入到96孔板的各孔中。每孔加入200ul的BCA工作液。搖晃混勻30s,蓋住各樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)：在37C孵育30min或室溫放置2-16h。加強(qiáng)型檢測(cè)：在60C孵育15min。冷卻至室溫。在562nm吸光值。注意：如果光度計(jì)沒(méi)有配備2門m濾波片，波長(zhǎng)在40-590門m范圍的都可以使用。校正的吸光值是將各標(biāo)樣和試樣的讀數(shù)減去空白樣吸光值。比照已知BSA量制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取蛋白濃度。注意：如果機(jī)器附帶提供標(biāo)準(zhǔn)曲線軟件可以幫助獲得最精確的結(jié)果。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各蛋白試樣的校正吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)讀出各樣品的蛋白濃度。根據(jù)樣品體積

9、和稀釋度計(jì)算原來(lái)樣品中的蛋白量。常見(jiàn)問(wèn)題及改善建議現(xiàn)象可能的原因所有反應(yīng)中都沒(méi)有顏色產(chǎn)生樣品中含有銅螯合劑緩沖液中含有硫醇所有反應(yīng)（包括空白對(duì)照）緩沖液中含有還原劑都呈現(xiàn)深紫色緩沖液中含有生物胺（例如兒茶酚胺類物質(zhì)）空白對(duì)照正常，但標(biāo)準(zhǔn)樣和波長(zhǎng)設(shè)定不對(duì)試樣吸光值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期樣品處于較強(qiáng)的酸性或堿性緩沖液中吸光值高于預(yù)期樣品中含有脂類或脂蛋白蛋白濃度過(guò)高改善建議可對(duì)樣品做透析、除鹽或稀釋處理增加BCA工作液的銅離子濃度（例如可用BCA溶液與4%CuSO4按50:2配制）可對(duì)樣品做透析或稀釋處理可對(duì)樣品做透析或稀釋處理可對(duì)樣品做透析或稀釋處理在562nm測(cè)吸光值；可以在540-590nm范圍測(cè)，

10、但是靈敏度會(huì)降低可對(duì)樣品做透析、除鹽或稀釋處理樣品中加入終濃度為2%的SDS以減少脂質(zhì)的影響稀釋樣品試劑兼容性不兼容試劑或物質(zhì)以下試劑或物質(zhì)濃度很低時(shí)也會(huì)干擾BCA法進(jìn)行定量，應(yīng)該在樣品中盡量避免出現(xiàn)。如果不能避免這些干擾成分，應(yīng)選用Non-InterferingProteinAssayKit（貨號(hào)488250）以準(zhǔn)確定量。這個(gè)表并不全面，還有一些試劑和物質(zhì)可能干擾定量未被列出。AsorhicEGTAIionSucrose(impureGlycerolLipidsTiyytophailCratiniiwHydr-ogeny-proxideKklihiosTyiosiiiCvsteineHydr

11、azidesPiienolRidIhicaod可兼容試劑下表中列出了與BCA蛋白定量方法兼容的試劑或物質(zhì)種類及其不干擾定量的最大濃度數(shù)值。這個(gè)表并不全面，還有一些試劑和物質(zhì)會(huì)或不會(huì)干擾定量未被列出。默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteam默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteamSubstanceConcentratiDirBACES.pH7.8AcetoneAcetonitrileArnmoniumsulfateAprotininBlclujc,pH8.4E&Tris,pH6.5Borate,pHSBB4jB-95Bru-58BugBuster*ProteinE

12、xtractionReagent(Cat.No7iX84)Calciumchloride(inTBS,pH8.0)CesLumhicaibonaieCHAPSCHAPSOCHES?pH0.OCobaltchloride(inTBS,pH8.0)CytxjBiimLecPmtintimlReagent(Cat.No71(IK)DeoxycholicacidDMFDMSODidiioeiythrito(DTE)DithiothreitQl(DPT)EDTAEPPS,pH8.0EthanolFerricchloride(inTES,pH8.0)GlucoseGlycLnHCLpHlS25mM10%1

13、0%1.BM10mg*LSJOniM33mMBOniM5%1%undiluted10mM103mM5%100mM0.8mMueldiluted10%10%jmMjmM10mM103mM10%10mM10mM103mMSubstanceConaentrationGLyicerrol(pure)Guanidine-HClHEPESHydrochJoricsiculImidazole,pH7.0In-scxrtPopCultutc*Rcogcnt(CatNo.71187)Leupeptin2-MeroaptoethanoMES.pHfl.lMethairolMOPS,pH7.2Nickelchlor

14、ide血TBS,pHS0)NorudetP-43(NP40)Octylp-gLacosidjeOctylp-thicglucapyrancsidePIPES,pH6.8PMSFPtxpCultufE(CatNo.71092)PotassiumthiocyanateReportasolExtraction.Buffer(Cat.No.TO909)SDSSodium,acetate,pH4.8SodiuniazideSodium,bicarbonateSodiiLmcHorideSodium,citrate,pH4.8orpH6.4SodimnhydroxideSodiuniphosphsceSucrose10%4M100mM100mM50mMimdiluted.10mg.L0.01%100mM10%100mM10mM59&5%5%100mM1mMLDidilui-ed9.0Mundiluted5%200mM0.2100mMIM200mMlODmM100mM40%默克生命科學(xué)服務(wù)熱線：4008208872bioteamSubstance(continuedJConcentrationsTBS(15