幾乎所有的生物都能合成自身所需要的酶

1、 Enzymes for Molecular Cloning1酶幾乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括許多病毒。酶參與所有生命活動(dòng)過(guò)程，其在細(xì)胞內(nèi)的分布、含量、活性等隨生物生長(zhǎng)、發(fā)育及外界條件的改變而改變。Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白質(zhì)。定義：由活細(xì)胞產(chǎn)生，能在體外和體內(nèi)起同樣催化的一類(lèi)具有特殊空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸等。2用于基因克隆的酶ER連接酶DNA聚合酶:Klenow酶、Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶、 末端轉(zhuǎn)移酶堿性磷酸酶多核苷酸激酶核酸酶3RE 如果在細(xì)菌中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)ER，現(xiàn)代生物學(xué)和重組DNA就不可能發(fā)展起來(lái)。4Restriction Endonucl

2、easedefinition:molecular knivesHundreds known, commercially available.function: R-M defense mechanism against foreign DNA. prevent invasion by foreign DNA such as viral DNA,by cutting it up.修飾酶又稱(chēng)甲基化酶。5三大類(lèi) I：最早發(fā)現(xiàn)3個(gè)亞基： HsdS識(shí)別特定DNA序列 HsdM-甲基化 HsdR-限制性?xún)?nèi)切酶功能三個(gè)亞基組成復(fù)合體，全酶才有活性。biochemistry：need ATP,Mg+,SAM

3、cutting：long sequences(1000-5000nt),at randomunspecial,cant be used in genetic engineering6III：2個(gè)亞基組成： HsdM、 HsdR需要SAM、ATP、Mg2+類(lèi)似于I應(yīng)用同樣受限制7II:應(yīng)用最廣酶最簡(jiǎn)單(Mg2+)不需要特殊條件HsdM 和 HsdR亞單位切割特異8derivation：first three names from the latin names of the microorganism that produces them.first letter(genus),next two

4、 letters(species)writing：前三個(gè)字母用斜體，其他用正體表示。如果酶存在于一種特殊菌株中，三個(gè)字母后加上菌株名稱(chēng)符號(hào),名稱(chēng)最后部分往往包含羅馬數(shù)字,表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)這種酶的先后次序。 9recognition sequence:cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic (symmetrical) recognition sequences to leave a 5-phosphate and a 3-OH. They leave blunt ends,or protruding 5-

5、or 3-termini.EcoR: * 5G A A T T C 3 3C T T A A G 5 * 10 recognition sequence enzymes 5 GTT AAC 3 Hpa blunt end 3 CAATTG 5 5 GAATTC 3 EcoR 5protruding end 3 CTTAAG 5 5 AAGCTT 3 Hind 5protruding end 3 TTCGAA 5 5 GGATCC 3 BamH 5protruding end 3 CCTAGG 5 5 CTGCAG 3 Pst 3protruding end 3 GACGTC 5 11估算ER識(shí)

6、別序列在DNA上出現(xiàn)的頻率:識(shí)別序列的頻率=1/4N Sau3A(4bp)=1/4 4 256bp EcoRI、PstI(6bp)=1/46 4096 NotI(8bp)= 1/48 65536 (rare cutters) 僅是理論推測(cè)12Restriction digestsdigestion of plasmid or genomic DNA,for analytical or preparative purposes, using commercial enzymes and buffer solutions.All RE require Mg2+,usually at a conce

7、ntration of up to 10mM,but different enzymes require different pHs,NaCl concentrations or other solution constituents for optimum activity.13同裂酶(isoschizomer)或異源同工酶:不同來(lái)源的限制酶可切割同一靶序列同尾酶(isocaudiners)：來(lái)源不同、識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同粘性末端的酶。 遠(yuǎn)距離裂解酶(distant cleavage)：識(shí)別位點(diǎn)與切割位置不一致可變酶：識(shí)別序列中的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸是可變的Subset酶：一種酶的識(shí)別序列包

8、含于另一些酶的識(shí)別序列之中14enzymes activity1個(gè)活性單位：在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下(包括溫度、pH和離子強(qiáng)度等),1h 內(nèi)在50l容積中完全酶解1ug特定DNA底物(通常用DNA)所需要的酶量。15星號(hào)活力 在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下,也能切割一些與其特異識(shí)別序列類(lèi)似的序列。在酶的名稱(chēng)右上角加一個(gè)星號(hào)(*)表示,如EcoR*。 因此,只有在相當(dāng)特殊的條件下,酶活才與發(fā)表的結(jié)果相符。 必須采用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)步驟,堅(jiān)持應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。16底物位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)效應(yīng) 酶對(duì)同一個(gè)DNA底物上的不同酶切位點(diǎn)的切割速率不同17Applications 透析到含50甘油的貯藏緩沖液,保存在-20。 消化DNA時(shí),

9、稀釋到1-3單位/l。 反應(yīng)緩沖液可在有關(guān)書(shū)籍中查找到。 18 酶切反應(yīng)注意事項(xiàng)價(jià)格昂貴決不能用水稀釋,以免變性失活。預(yù)先加入除酶以外的所有其他試劑。取酶立即放于冰上。分裝小份避免反復(fù)凍融。使用無(wú)菌的新吸頭。少加水,使體積最小,但保證酶液體積不超過(guò)總體積的10,否則酶液中的甘油會(huì)抑制酶活性。 19restriction mapDNA physical map：a series of ERDemonstration:Linear or circleapplication： DNA sequencing, genome function map, gene library construction

10、, RFLPMethods：virous ER，single or double digestion, fragments size20DNA Ligase定義：催化DNA上裂口兩側(cè)(相鄰)核苷酸裸露的3羥基和5磷酸之間形成共價(jià)結(jié)合的磷酸二酯鍵，使斷開(kāi)的DNA裂口連接起來(lái)。用途：具有修復(fù)單鏈或雙鏈的能力,在DNA重組、復(fù)制和損傷后的修復(fù)中都起關(guān)鍵作用。提?。涸S多原核和真核生物及病毒中。21T4 DNA ligase 一條多肽鏈(Mr=68000)，還可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作輔因子。22E.coli DNA ligaseMr=74000,作用于5端帶磷酸基團(tuán)的DNA底物NAD+

11、可促進(jìn)該催化反應(yīng)分子克隆使用不多，亦不能連接RNA。用途: cDNA第二鏈合成。23T4 RNA ligase由噬菌體編碼催化單鏈DNA或RNA連接。主要用途是對(duì)RNA進(jìn)行3末端標(biāo)記24Ligation of DNA fragments in vivo and in vitroin vivo：不僅形成重組分子的效率低,而且還可能伴隨著末端核苷酸的缺失。in vitro： 減小了DNA進(jìn)入細(xì)胞后遭受降解危險(xiǎn)； 粘性末端體外連接將保護(hù)原來(lái)識(shí)別序列的完整 可以控制連接時(shí)的反應(yīng)條件25affecting factorsT：多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的Tm值在15以下,然而保持連接酶活性的最適溫度卻是37

12、, 因此最適溫度是粘性末端的Tm值和連接酶最適溫度的折衷。經(jīng)常采用12.5（4-15）。DNA concentrations：外源片段濃度比載體DNA濃度高10-20倍防止環(huán)化：堿性磷酸酶預(yù)先處理質(zhì)粒載體time：O/N better26polymerase 催化核酸體外合成反應(yīng)27DNA polymerase依賴(lài)于DNA的DNA聚合酶: DNA聚合酶(全酶); DNA聚合酶大片段 (klenow片段); 耐熱DNA聚合酶 (Taq 酶)依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶:反轉(zhuǎn)錄酶。不依賴(lài)于DNA的DNA聚合酶:末端轉(zhuǎn)移酶。28RNA polymerase 催化RNA體外合成反應(yīng)依賴(lài)DNA的RNA聚合

13、酶不依賴(lài)DNA的RNA聚合酶 29nuclease以核酸為底物的水解酶按底物專(zhuān)一性分：RNase、DNase、非專(zhuān)一性核酸酶按作用位點(diǎn)分：內(nèi)切或外切酶 5-核酸酶或3-核酸酶常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、綠豆核酸酶、RNaseA RNaseT1、DNase、外切核酸酶、噬菌體 外切核酸酶等。許多核酸酶兼有內(nèi)切和外切活性30 核酸酶的分類(lèi) 內(nèi)切酶 非專(zhuān)一性 外切酶 3-核酸酶 核酸酶 內(nèi)切酶 5-核酸酶 RNA 外切酶 專(zhuān)一性 非限制性 內(nèi)切酶 限制性 DNA 外切酶 31Kinase激酶:對(duì)核酸末端羥基進(jìn)行磷酸化的酶。用途： 放射性標(biāo)記DNA鏈的5末端，探針標(biāo)記 Maxam-Gilbert化學(xué)法的DNA序列分析；使缺少5磷酸的DNA片段和合成接頭磷酸化。 該酶很難純化,酶制品經(jīng)常不純。 銨離子是該酶的