哺乳類動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式

1、哺乳類動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式 深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。 一、分批式培養(yǎng)（batch culture） 是細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中其體積不變，不添加其它成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。 該方式的特點(diǎn): 操作簡(jiǎn)單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過(guò)程中與外部環(huán)境沒(méi)有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進(jìn)行其他任何控制，因此操

2、作簡(jiǎn)單，容易掌握； 直觀反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過(guò)程。因培養(yǎng)期間細(xì)胞生長(zhǎng)代謝是在一個(gè)相對(duì)固定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營(yíng)養(yǎng)成分,因此可直觀的反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過(guò)程,是動(dòng)物細(xì)胞工藝基礎(chǔ)條件或小試研究常用的手段； 可直接放大。由于培養(yǎng)過(guò)程工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強(qiáng)，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過(guò)程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器(Genetech)規(guī)?？蛇_(dá)12000L。 分批培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)分為五個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期，見圖1。分批培養(yǎng)的周期時(shí)間多在3-5天，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對(duì)

3、數(shù)生長(zhǎng)期（48-72h）細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗劫或代謝毒副產(chǎn)物的累積細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)周期。收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。 二、流加式培養(yǎng)（feeding culture） 1.流加式培養(yǎng)是在批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/21/3，在培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到較高的水平，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程沒(méi)有流出或回收，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期或衰亡期后進(jìn)行終止回收整個(gè)反應(yīng)體

4、系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白。 2.流加培養(yǎng)特點(diǎn)： 流加培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應(yīng)的流加過(guò)程，保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。 培養(yǎng)過(guò)程以低稀釋率流加，細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時(shí)間較長(zhǎng)，總細(xì)胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。 流加培養(yǎng)過(guò)程須掌握細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，能量代謝動(dòng)力學(xué)，研究細(xì)胞環(huán)境變化時(shí)的瞬間行為。流加培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個(gè)培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。 在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過(guò)程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放

5、大。 流加培養(yǎng)是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢(shì)的培養(yǎng)工藝，也是近年來(lái)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進(jìn)行流加的時(shí)間多在指數(shù)生長(zhǎng)后期，細(xì)胞在進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。可以添加一次，也可添加多次，為了追求更高的細(xì)胞密度往往需要添加一次以上，直至細(xì)胞密度不再提高；可進(jìn)行脈沖式添加，也可以降低的速率緩慢進(jìn)行添加，但為了盡可能的維持相對(duì)穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境，后者采用較多；添加的成分比較多，凡是促細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)均可以進(jìn)行添加。流加的總體原則是維持細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)成分即不過(guò)剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營(yíng)養(yǎng)利用效率下降而成為無(wú)

6、效的利用；也不缺乏導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制或死亡。 3.流加工藝中的營(yíng)養(yǎng)成分主要分為三大類： 葡萄糖：葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高是會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。 谷氨酰胺：谷氨酰胺是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當(dāng)其濃度較高是會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進(jìn)行其濃度控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳； 大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無(wú)血

7、清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。 氨基酸、維生素及其他：主要包括營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸、營(yíng)養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營(yíng)養(yǎng)成分如膽堿、生長(zhǎng)刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進(jìn)行添加時(shí)，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進(jìn)行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動(dòng)泵進(jìn)行緩慢連續(xù)流加。 4.流加式培養(yǎng)分為兩種類型：?jiǎn)我谎a(bǔ)料分批式培養(yǎng)和反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)。 單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時(shí)投入一定量

8、的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時(shí)期，開始連續(xù)補(bǔ)加濃縮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達(dá)到生物反應(yīng)器的最大操作容積，停止補(bǔ)加，最后將細(xì)胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時(shí)間內(nèi)。 反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在單一補(bǔ)料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個(gè)一定時(shí)間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過(guò)反應(yīng)器的最大操作容積，從而在理論上可以延長(zhǎng)培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。 三、半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture） 1.半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中

9、，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。 這種類型的操作是將細(xì)胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長(zhǎng)至一定的密度，在細(xì)胞生長(zhǎng)至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體積的1/23/4，以維持細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加?；蛘咴诩?xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細(xì)胞、載體一起取出，然后補(bǔ)加細(xì)胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無(wú)需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由

10、于細(xì)胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當(dāng)高的接種量，經(jīng)過(guò)幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過(guò)程，細(xì)胞密度常常會(huì)提高。 2.半連續(xù)式特點(diǎn)： 培養(yǎng)物的體積逐步增加； 可進(jìn)行多次收獲； 細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。 該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。 四、連續(xù)式培養(yǎng)（continuous culture） 1.連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式是將細(xì)胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞

11、達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過(guò)程可無(wú)限延續(xù)下去。 2.連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長(zhǎng)分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長(zhǎng)速率可維持不變。細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來(lái)的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個(gè)較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細(xì)胞和細(xì)胞碎片及時(shí)清除

12、，細(xì)胞活性高最終細(xì)胞密度得到提高；可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并為提高；尤其是細(xì)胞和產(chǎn)物不斷的稀釋，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、細(xì)胞增長(zhǎng)速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。 3.連續(xù)式培養(yǎng)不足： 由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，容易造成污染； 在長(zhǎng)周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性以及分泌產(chǎn)物容易變異； 對(duì)設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。 連續(xù)式培養(yǎng)操作使用的反應(yīng)器多數(shù)是攪拌式生物反應(yīng)器，也可以是管式反應(yīng)器。 4.連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)： 細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng)； 產(chǎn)物體積不斷增長(zhǎng)； 可控制衰退期與下降期。 五、灌流式培養(yǎng)（perfusion culture） 1.灌流式培養(yǎng)是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)

13、和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時(shí)同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。 灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過(guò)濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。 中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過(guò)小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過(guò)程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年來(lái)中空纖維生物反

14、應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。 另外一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器，固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長(zhǎng)，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營(yíng)養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長(zhǎng)。流化床生物反應(yīng)器是通過(guò)流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。 2.灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量； 連續(xù)灌流系統(tǒng)，

15、使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低； 反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高； 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。 連續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應(yīng)用連續(xù)灌流工藝的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。這種方法最大困難是污染機(jī)率較高，長(zhǎng)期培養(yǎng)中細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性，規(guī)模放大過(guò)程中工程問(wèn)題。 六、細(xì)胞工廠培養(yǎng) 細(xì)胞工廠(cell factory)是一種設(shè)計(jì)精巧的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了最大限度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間,并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無(wú)菌性，從而避免因污染而帶來(lái)的原料、勞務(wù)和時(shí)間損失。它是對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。 丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細(xì)胞工廠是目前應(yīng)用較多的細(xì)胞工廠系統(tǒng)?？捎糜谌缫呙纭?/p>