丙型肝炎病毒細(xì)胞和動(dòng)物模型的研究進(jìn)展(共8頁(yè))

1、PAGE PAGE 10丙型肝炎病毒(bngd)細(xì)胞(xbo)和動(dòng)物模型(mxng)的研究進(jìn)展摘要：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一，目前全世界約有1.7億人感染HCV。由于缺少有效的HCV細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小動(dòng)物模型，人們對(duì)其生活周期、作用機(jī)制等仍不是很清楚，從而嚴(yán)重阻礙了HCV疫苗及治療藥物的開發(fā)與研制。本文就近幾年在HCV細(xì)胞和動(dòng)物模型方面的進(jìn)展作一綜述。關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒細(xì)胞模型動(dòng)物模型Progress in Establishment of HCV Cell and Animal Model Abstract: He

2、patitis C virus(HCV) is a major cause of chronic liver disease, such as chronic hepatitis, hepatic cirrhosis, hepatocelhlar carcinoma, with over 170 million persistently infected individuals worldwide. Lack of proper study models has brought difficulties in the study of the mechanism of viral infect

3、ion, life cycle and pathogenic mechanism of HCV and also become the major obstacles in the development of efficient vaccine and new drugs for hepatitis C. Here the advances on establishment of HCV infectious cell and animal models were reviewed.Key Words: Hepatitis C virus(HCV); cell model; animal m

4、odel丙型肝炎是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生難題，目前全球約有1.7億人感染HCV，我國(guó)進(jìn)行的全國(guó)HCV血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)一般人群抗-HCV陽(yáng)性率約為3.2%，全國(guó)共約4000萬(wàn)人感染HCV，HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。約50-80的HCV感染者會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥净颊撸蠹s20的患者會(huì)在20年內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不?。一旦轉(zhuǎn)為肝硬化，每年將會(huì)有15的病人發(fā)展成為肝癌，嚴(yán)重地威脅著人類的健康。長(zhǎng)期以來(lái)，缺少合適的研究模型一直是HCV研究的瓶頸，近年來(lái)HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立使其相關(guān)研究提供了強(qiáng)有力的工具，為從根本上認(rèn)識(shí)HCV奠定了基礎(chǔ)。本文概述了近年來(lái)HCV研究模型的開發(fā)進(jìn)展。HCV

5、的基本分子生物學(xué)特征HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)9.6 kb，含有一個(gè)開放的編碼區(qū)，可編碼一個(gè)多聚蛋白前體，此多聚蛋白前體由宿主和病毒的信號(hào)肽酶剪接成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋El（Core、E1、E2）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。HCV C蛋白由191個(gè)氨基酸殘基組成，是HCV基因組中較為保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域。5UTR區(qū)最為保守，而3UTR對(duì)于HCV RNA的正常復(fù)制是不可缺少的（圖1）1。圖1 HCV基因組結(jié)構(gòu)(jigu)HCV的細(xì)胞(xbo)模型感染(gnrn)模型 感染是建立HCV細(xì)胞模型最簡(jiǎn)單直接的方法，是用HCV

6、陽(yáng)性血清直接和HCV敏感細(xì)胞共同培養(yǎng)使細(xì)胞感染。早在1992年，Shimizu等2報(bào)道用鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人T淋巴細(xì)胞系MOLT-4Ma和HPB-Ma，再用可連續(xù)感染大猩猩的病毒株和上述細(xì)胞共培養(yǎng)，24 d后仍可在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到病毒RNA的存在。隨后用人淋巴細(xì)胞白血病病毒HTLV-I預(yù)處理MT-2細(xì)胞系后再用HCV感染也得到類似的結(jié)果。研究人員分別在HPB-Ma、PBMC、Huh-7、Hep-G2和其他SV-40 T抗原永生化肝臟細(xì)胞系上也建立了HCV持續(xù)感染系統(tǒng)，同時(shí)觀察到此感染效率與病毒體內(nèi)滴度密切相關(guān)，并可被相應(yīng)抗體中和和干擾素抑制持續(xù)復(fù)制的病毒直徑約為50 nm，采用RT-PCR方法可間隙

7、性檢測(cè)出。Iacovacci 等3則選用人胎肝細(xì)胞作為培養(yǎng)HCV的靶細(xì)胞，用競(jìng)爭(zhēng)性PCR定量檢測(cè)病毒RNA 分子，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)后30d 達(dá)到HCV復(fù)制水平的最高值。他們還發(fā)現(xiàn)血清中病毒顆粒的蔗糖梯度密度為1.181.36g/cm3，而細(xì)胞和上清中檢測(cè)到的病毒顆粒密度有高低兩種（高：1.181.36 g/cm3；低：1.051.105 g/cm3）。Rumin等4用HCV陽(yáng)性血清和人肝細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察4個(gè)月，發(fā)現(xiàn)這些感染細(xì)胞在10d 后可檢測(cè)到正鏈RNA，而培養(yǎng)上清中的RNA 滴度在3個(gè)月中也有了升高。而Yoshikura H等5用HCV患者血清感染細(xì)胞時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了病毒顆粒密度有高低兩部分，密度高

8、的部分感染性低，低密度的感染性高。對(duì)于這種現(xiàn)象，他們認(rèn)為可能是HCV顆粒結(jié)合了抗HCV抗體，導(dǎo)致了密度的增加，同時(shí)干擾了HCV對(duì)細(xì)胞的吸附及在細(xì)胞中的復(fù)制，使HCV對(duì)細(xì)胞的感染性降低。用抗人免疫球蛋白對(duì)這種血清進(jìn)行免疫檢測(cè)，證實(shí)了低感染性高密度HCV確實(shí)結(jié)合有IgG抗體。用陽(yáng)性血清感染細(xì)胞方便快捷，缺點(diǎn)但病毒復(fù)制產(chǎn)量較低，且不能長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。2.2 轉(zhuǎn)染模型(mxng)具體做法是利用RT-PCR方法(fngf)獲得的全長(zhǎng)HCV cDNA，采用各種方法將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入易感細(xì)胞，通過胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄(zhun l)可產(chǎn)生和病毒相同的RNA轉(zhuǎn)錄本，從而模擬病毒的感染過程。相對(duì)于HCV病毒直接感染的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

9、，克隆的病毒基因組轉(zhuǎn)染模型保證了用于感染細(xì)胞的基因組的同源性，且能夠在體外大量合成。Kishine等6從感染細(xì)胞提取HCV RNA，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，將其改造后（ 剔除結(jié)構(gòu)基因，保留與復(fù)制有關(guān)的非結(jié)構(gòu)基因和3NCR、5NCR，以保證不影響復(fù)制）整合入pBR322MC中，并插入抗Huh-7 基因、ECMV-IRES，構(gòu)建重組質(zhì)粒pNNR22RU，轉(zhuǎn)染Huh-7 細(xì)胞培養(yǎng)，再?gòu)闹羞x擇抗G418的Huh-7 細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。最后從這些細(xì)胞克隆中檢測(cè)到病毒產(chǎn)物（ 非結(jié)構(gòu)蛋白）和亞基因RNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HCV 亞基因復(fù)制子能在一些細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中有效復(fù)制，并維持較長(zhǎng)的時(shí)間，有利于將來(lái)進(jìn)一步研究丙肝病毒復(fù)

10、制機(jī)制及新藥篩選。Pietschmann等7把構(gòu)建好的選擇性全長(zhǎng)HCV基因轉(zhuǎn)入Huh-7 中，并進(jìn)行3 個(gè)突變來(lái)加強(qiáng)在細(xì)胞中的復(fù)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能在細(xì)胞中持續(xù)檢測(cè)到該基因達(dá)6個(gè)月，結(jié)構(gòu)蛋白穩(wěn)定表達(dá)。Lohmann等8在研究HCV 在細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)Huh-7 是較好的病毒培養(yǎng)的細(xì)胞系統(tǒng)。選擇性亞基因復(fù)制子也需要核苷酸突變來(lái)加強(qiáng)病毒復(fù)制，NS3的突變對(duì)復(fù)制作用小，但在聯(lián)合高適應(yīng)性突變時(shí)能加強(qiáng)病毒復(fù)制；而NS5、NS4B 的適應(yīng)性突變作用可直接加強(qiáng)復(fù)制。另外也發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞在RNA有效復(fù)制時(shí)也起了非常重要的作用，他們檢測(cè)了相同Huh-7 細(xì)胞系的幾代，發(fā)現(xiàn)不同代次的Huh-7在支持復(fù)制子擴(kuò)增的能力相差

11、100倍。這些數(shù)據(jù)資料表明在細(xì)胞培養(yǎng)中HCV 的復(fù)制有效性很大可能是由病毒序列和宿主細(xì)胞本身共同決定的。動(dòng)物模型3.1黑猩猩黑猩猩是公認(rèn)的最好的HCV感染(gnrn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(dngw)。已經(jīng)(y jing)證實(shí)HCV在黑猩猩體內(nèi)復(fù)制，黑猩猩對(duì)HCV的應(yīng)答過程與人類相似。Shimizu等2研究發(fā)現(xiàn)，黑猩猩接種HCV后3-4天即可于血清中檢測(cè)出HCV RNA，7天時(shí)HCV RNA水平達(dá)到峰值，為107-108CID/L，同時(shí)血清ALT水平最高。感染后3天，肝細(xì)胞活檢可檢測(cè)到HCV RNA。同人類一樣，感染HCV的黑猩猩中有很大比例40%由于機(jī)體免疫系統(tǒng)不能清除病毒，而發(fā)展成持續(xù)性感染。人與黑猩猩

12、在HCV 轉(zhuǎn)為慢性感染的比例上的差別，可能是因?yàn)橛性S多患者急性期臨床表現(xiàn)不明顯而未能發(fā)現(xiàn)。但HCV在宿主體內(nèi)是如何逃避免疫監(jiān)視而發(fā)展為慢性感染的機(jī)理仍不清楚。病理學(xué)研究表明，黑猩猩的肝臟損害沒有人類嚴(yán)重，觀察不到肝纖維樣變性和肝硬化，但在組織形態(tài)學(xué)和壞死性炎癥病變方面與人相似?？偟膩?lái)說(shuō)，在人和黑猩猩身上所觀察到的臨床參數(shù)比較接近，用黑猩猩來(lái)研究病毒在體內(nèi)復(fù)制情況和發(fā)病機(jī)理及篩選HCV疫苗都是非常有價(jià)值的。但由于黑猩猩作為丙肝模型缺乏慢性肝病的表現(xiàn)，使得在肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)理的研究方面受到限制9。此外，費(fèi)用等問題也限制了它的應(yīng)用范圍。猴GBV-B是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的黃熱病毒屬中的一員，是一種單股正

13、鏈RNA病毒，在所有的動(dòng)物病毒中，GBV-B與HCV有高度核酸同源性，其多聚蛋白在氨基酸水平上有2530的同源性，因此推想治療HCV感染的抗病毒化合物同樣會(huì)對(duì)GBV-B有作用，使得GBV-B作為HCV的替代病毒建立感染模型成為可能。GBV-B可以感染絨猴，GBV-B感染絨猴40-60 d后可達(dá)到108109拷貝，60-80 d后病毒逐漸被清除。原代培養(yǎng)的絨猴肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中及細(xì)胞中也成功地檢測(cè)到了GBV-B的感染。用HCV蛋白酶抑制劑可以有效降低體外培養(yǎng)絨猴肝細(xì)胞上清中及絨猴體內(nèi)的病毒含量。Martin等10用合成的GBV-B RNA直接注射入小絹猴的肝臟，可誘使其產(chǎn)生持續(xù)性GBV-B感染，兩

14、個(gè)感染動(dòng)物中有一個(gè)感染后病毒血癥超過2年，且出現(xiàn)了門靜脈周圍單核細(xì)胞浸潤(rùn)、線粒體結(jié)構(gòu)改變及脂肪變性等慢性肝炎的組織病理學(xué)改變11。近年有關(guān)猴作為HCV感染模型的報(bào)道不多，其作為可供研究HCV使用模型的可能性有待驗(yàn)證。樹鼩樹鼩是一種與靈長(zhǎng)類親緣關(guān)系較近的哺乳動(dòng)物，對(duì)多種人類病毒，包括(boku)甲、乙和丁型肝炎病毒易感。Xie等12對(duì)樹鼩進(jìn)行病原接種發(fā)現(xiàn)，僅有1/4能感染HCV，在體內(nèi)(t ni)檢測(cè)到短暫或間歇的低效價(jià)病毒血癥。 若樹鼩接受cGy750照射后再進(jìn)行病原接種，HCV感染效率、病毒血癥及抗體效價(jià)均明顯提高。但由于樹鼩是野生動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)困難，廣泛應(yīng)用受到限制。小鼠3.4.1 轉(zhuǎn)基

15、因小鼠模型(mxng)小鼠主要有轉(zhuǎn)基因小鼠模型、質(zhì)料轉(zhuǎn)染鼠模型和人鼠嵌合體肝移植鼠模型。轉(zhuǎn)基因技術(shù)自1980年代初發(fā)展起來(lái)現(xiàn)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域中普遍應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)手段，HCV轉(zhuǎn)基因小鼠主要為結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)基因小鼠，在病毒導(dǎo)致肝炎、肝脂肪及肝癌的致病機(jī)制方面的研究起了很大的作用。Pasquinelli等13將編碼HCV結(jié)構(gòu)蛋白的C、E基因分別插入到鼠主尿蛋白下游，建立攜有HCV基因片段的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種對(duì)T細(xì)胞免疫應(yīng)答功能的抑制可能是由于HCV感染增強(qiáng)了T 淋巴細(xì)胞對(duì)Fas-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性，HCV核心蛋白可能是通過促進(jìn)Fas-介導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞凋亡以及肝臟的T 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)而導(dǎo)致肝損傷。HC

16、V各組成蛋白的致癌機(jī)制也是以HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型進(jìn)行研究的，Kato等14發(fā)現(xiàn)在飼養(yǎng)了1824個(gè)月后，HCV核心基因轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟內(nèi)均未出現(xiàn)腫瘤，但是經(jīng)四氯化碳處理后可發(fā)生肝細(xì)胞癌，因此認(rèn)為HCV核心蛋白導(dǎo)致的肝細(xì)胞再生速率的提高可能是增強(qiáng)肝臟發(fā)生癌變機(jī)率的機(jī)制之一。成軍等15發(fā)現(xiàn)約80%的HCV結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)生肝臟等內(nèi)臟的脂肪變，為研究HCV慢性感染引起的脂肪變奠定了基礎(chǔ)。Kamegaya等16將HCV E1蛋白、E2蛋白和核心蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠用DEN處理后于第32周處死，然后檢測(cè)細(xì)胞的增殖和凋亡情況，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠與正常小鼠間的細(xì)胞增殖沒有顯著差別，但核心-E1-E2 轉(zhuǎn)基因小

17、鼠的較大，而凋亡指數(shù)卻小于核心基因轉(zhuǎn)基因小鼠，因而認(rèn)為HCV結(jié)構(gòu)蛋白促進(jìn)腫瘤生成的原因可能是由于抑制肝細(xì)胞凋亡而并不是促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。雖然轉(zhuǎn)基因小鼠作為HCV感染模型的報(bào)道較多，但各方研究不盡相同，且存在很多問題，轉(zhuǎn)基因小鼠處于免疫耐受狀態(tài)，對(duì)HCV導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的原因，究竟是病毒的直接作用還是病毒與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用尚有爭(zhēng)議，并難以用于疫苗的研發(fā)。3.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠模型 由于HCV病毒不能直接感染小鼠，因此人們嘗試用含有HCV的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞或體內(nèi)轉(zhuǎn)染的方法表達(dá)HCV蛋白。詹林盛等17用含內(nèi)部核糖體起始位點(diǎn)IRES的HCV 5NCR及部分多聚蛋白起始區(qū)序列與熒光素酶基因融合，然后

18、插入含CMV啟動(dòng)子的Pci-neo質(zhì)粒中，得到真核表達(dá)質(zhì)粒Phcv-neo4，進(jìn)一步采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法將pHCV-neo4表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，在小鼠肝臟檢測(cè)到熒光素酶的高水平表達(dá)，同時(shí)HCV IRES介導(dǎo)的熒光素酶在小鼠心、脾、腎臟組織中也得到表達(dá)，但表達(dá)量?jī)H為肝臟的1100l1 000，可以作為體內(nèi)瞬時(shí)評(píng)價(jià)以HCV IRES為靶位的抗HCV藥物活性的小鼠模型。3.4.3 人鼠嵌合體肝移植鼠模型(mxng)此方法是在免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植人肝細(xì)胞，通過肝門靜脈或脾髓注射(zhsh)，使小鼠感染HCV。Brown等19利用原代或無(wú)限增殖的人肝細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明所建立的HCV小鼠模型可用于HC

19、V的體內(nèi)(t ni)研究。Mercer等20通過在纖維蛋白溶酶原激活蛋白轉(zhuǎn)基因的SCID小鼠肝臟內(nèi)植入正常人肝組織，然后接種HCV患者血清建立了一種HCV嵌合感染的小鼠模型，該小鼠的肝臟中能檢測(cè)到病毒RNA的復(fù)制。其體內(nèi)病毒滴度最高能達(dá)到1:1950，而且這種感染能連續(xù)傳遞三代。Galun等21采用的方法是給免疫缺陷小鼠（BNX）以放射性照射，然后用免疫缺陷小鼠的骨髓細(xì)胞進(jìn)行重建，再把感染了HCV患者的肝碎片移植到用前述方法所制備的小鼠腎被膜下。這種三聯(lián)體小鼠在移植后1015天內(nèi)，有50%以上用RT-PCR法可以檢測(cè)到HCV RNA。Ilan等22報(bào)道三聯(lián)體HCV小鼠感染率為85%，且可以用抗

20、病毒藥物減輕小鼠的病毒血癥，但這種方法由于免疫排斥，肝存活時(shí)間較短，且病毒血癥水平較低，而影響該鼠對(duì)人肝細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。結(jié)語(yǔ)近幾年，在建立HCV動(dòng)物模型技術(shù)上有了很大突破。新的動(dòng)物模型基本上都是在人鼠嵌合體轉(zhuǎn)基因小鼠基礎(chǔ)上建立的，必將為HCV的研究帶來(lái)新的突破。鼠的免疫缺陷恰恰能滿足異種動(dòng)物成分的介入，從而擴(kuò)大了HCV模型的應(yīng)用。但是還有待于進(jìn)一步研究更加方便、精確的小動(dòng)物模型，進(jìn)行有關(guān)發(fā)病機(jī)制、藥物以及疫苗方面的研究。參考文獻(xiàn)Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer H, et al. HYPERLINK /pubmed/19821520 Cyclosporine

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