丙型肝炎病毒細胞和動物模型的研究進展(共8頁)

1、PAGE PAGE 10丙型肝炎病毒(bngd)細胞(xbo)和動物模型(mxng)的研究進展摘要：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一，目前全世界約有1.7億人感染HCV。由于缺少有效的HCV細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小動物模型，人們對其生活周期、作用機制等仍不是很清楚，從而嚴重阻礙了HCV疫苗及治療藥物的開發(fā)與研制。本文就近幾年在HCV細胞和動物模型方面的進展作一綜述。關鍵詞：丙型肝炎病毒細胞模型動物模型Progress in Establishment of HCV Cell and Animal Model Abstract: He

2、patitis C virus(HCV) is a major cause of chronic liver disease, such as chronic hepatitis, hepatic cirrhosis, hepatocelhlar carcinoma, with over 170 million persistently infected individuals worldwide. Lack of proper study models has brought difficulties in the study of the mechanism of viral infect

3、ion, life cycle and pathogenic mechanism of HCV and also become the major obstacles in the development of efficient vaccine and new drugs for hepatitis C. Here the advances on establishment of HCV infectious cell and animal models were reviewed.Key Words: Hepatitis C virus(HCV); cell model; animal m

4、odel丙型肝炎是全球關注的公共衛(wèi)生難題，目前全球約有1.7億人感染HCV，我國進行的全國HCV血清流行病學調查顯示，我國一般人群抗-HCV陽性率約為3.2%，全國共約4000萬人感染HCV，HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。約50-80的HCV感染者會轉變?yōu)槁愿腥净颊?，而大約20的患者會在20年內轉變?yōu)楦斡不?。一旦轉為肝硬化，每年將會有15的病人發(fā)展成為肝癌，嚴重地威脅著人類的健康。長期以來，缺少合適的研究模型一直是HCV研究的瓶頸，近年來HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)的建立使其相關研究提供了強有力的工具，為從根本上認識HCV奠定了基礎。本文概述了近年來HCV研究模型的開發(fā)進展。HCV

5、的基本分子生物學特征HCV屬黃病毒科丙型肝炎病毒屬，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長9.6 kb，含有一個開放的編碼區(qū)，可編碼一個多聚蛋白前體，此多聚蛋白前體由宿主和病毒的信號肽酶剪接成3個結構蛋El（Core、E1、E2）和7個非結構蛋白（NS1、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。HCV C蛋白由191個氨基酸殘基組成，是HCV基因組中較為保守的結構區(qū)域。5UTR區(qū)最為保守，而3UTR對于HCV RNA的正常復制是不可缺少的（圖1）1。圖1 HCV基因組結構(jigu)HCV的細胞(xbo)模型感染(gnrn)模型 感染是建立HCV細胞模型最簡單直接的方法，是用HCV

6、陽性血清直接和HCV敏感細胞共同培養(yǎng)使細胞感染。早在1992年，Shimizu等2報道用鼠逆轉錄病毒感染人T淋巴細胞系MOLT-4Ma和HPB-Ma，再用可連續(xù)感染大猩猩的病毒株和上述細胞共培養(yǎng)，24 d后仍可在細胞內檢測到病毒RNA的存在。隨后用人淋巴細胞白血病病毒HTLV-I預處理MT-2細胞系后再用HCV感染也得到類似的結果。研究人員分別在HPB-Ma、PBMC、Huh-7、Hep-G2和其他SV-40 T抗原永生化肝臟細胞系上也建立了HCV持續(xù)感染系統(tǒng)，同時觀察到此感染效率與病毒體內滴度密切相關，并可被相應抗體中和和干擾素抑制持續(xù)復制的病毒直徑約為50 nm，采用RT-PCR方法可間隙

7、性檢測出。Iacovacci 等3則選用人胎肝細胞作為培養(yǎng)HCV的靶細胞，用競爭性PCR定量檢測病毒RNA 分子，發(fā)現培養(yǎng)后30d 達到HCV復制水平的最高值。他們還發(fā)現血清中病毒顆粒的蔗糖梯度密度為1.181.36g/cm3，而細胞和上清中檢測到的病毒顆粒密度有高低兩種（高：1.181.36 g/cm3；低：1.051.105 g/cm3）。Rumin等4用HCV陽性血清和人肝細胞共同培養(yǎng)，觀察4個月，發(fā)現這些感染細胞在10d 后可檢測到正鏈RNA，而培養(yǎng)上清中的RNA 滴度在3個月中也有了升高。而Yoshikura H等5用HCV患者血清感染細胞時，也發(fā)現了病毒顆粒密度有高低兩部分，密度高

8、的部分感染性低，低密度的感染性高。對于這種現象，他們認為可能是HCV顆粒結合了抗HCV抗體，導致了密度的增加，同時干擾了HCV對細胞的吸附及在細胞中的復制，使HCV對細胞的感染性降低。用抗人免疫球蛋白對這種血清進行免疫檢測，證實了低感染性高密度HCV確實結合有IgG抗體。用陽性血清感染細胞方便快捷，缺點但病毒復制產量較低，且不能長期傳代培養(yǎng)。2.2 轉染模型(mxng)具體做法是利用RT-PCR方法(fngf)獲得的全長HCV cDNA，采用各種方法將其轉染進入易感細胞，通過胞內逆轉錄(zhun l)可產生和病毒相同的RNA轉錄本，從而模擬病毒的感染過程。相對于HCV病毒直接感染的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

9、，克隆的病毒基因組轉染模型保證了用于感染細胞的基因組的同源性，且能夠在體外大量合成。Kishine等6從感染細胞提取HCV RNA，逆轉錄出cDNA，將其改造后（ 剔除結構基因，保留與復制有關的非結構基因和3NCR、5NCR，以保證不影響復制）整合入pBR322MC中，并插入抗Huh-7 基因、ECMV-IRES，構建重組質粒pNNR22RU，轉染Huh-7 細胞培養(yǎng)，再從中選擇抗G418的Huh-7 細胞進行亞克隆。最后從這些細胞克隆中檢測到病毒產物（ 非結構蛋白）和亞基因RNA。實驗結果表明HCV 亞基因復制子能在一些細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中有效復制，并維持較長的時間，有利于將來進一步研究丙肝病毒復

10、制機制及新藥篩選。Pietschmann等7把構建好的選擇性全長HCV基因轉入Huh-7 中，并進行3 個突變來加強在細胞中的復制，結果發(fā)現能在細胞中持續(xù)檢測到該基因達6個月，結構蛋白穩(wěn)定表達。Lohmann等8在研究HCV 在細胞中復制時，發(fā)現Huh-7 是較好的病毒培養(yǎng)的細胞系統(tǒng)。選擇性亞基因復制子也需要核苷酸突變來加強病毒復制，NS3的突變對復制作用小，但在聯合高適應性突變時能加強病毒復制；而NS5、NS4B 的適應性突變作用可直接加強復制。另外也發(fā)現宿主細胞在RNA有效復制時也起了非常重要的作用，他們檢測了相同Huh-7 細胞系的幾代，發(fā)現不同代次的Huh-7在支持復制子擴增的能力相差

11、100倍。這些數據資料表明在細胞培養(yǎng)中HCV 的復制有效性很大可能是由病毒序列和宿主細胞本身共同決定的。動物模型3.1黑猩猩黑猩猩是公認的最好的HCV感染(gnrn)實驗動物(dngw)。已經(y jing)證實HCV在黑猩猩體內復制，黑猩猩對HCV的應答過程與人類相似。Shimizu等2研究發(fā)現，黑猩猩接種HCV后3-4天即可于血清中檢測出HCV RNA，7天時HCV RNA水平達到峰值，為107-108CID/L，同時血清ALT水平最高。感染后3天，肝細胞活檢可檢測到HCV RNA。同人類一樣，感染HCV的黑猩猩中有很大比例40%由于機體免疫系統(tǒng)不能清除病毒，而發(fā)展成持續(xù)性感染。人與黑猩猩

12、在HCV 轉為慢性感染的比例上的差別，可能是因為有許多患者急性期臨床表現不明顯而未能發(fā)現。但HCV在宿主體內是如何逃避免疫監(jiān)視而發(fā)展為慢性感染的機理仍不清楚。病理學研究表明，黑猩猩的肝臟損害沒有人類嚴重，觀察不到肝纖維樣變性和肝硬化，但在組織形態(tài)學和壞死性炎癥病變方面與人相似。總的來說，在人和黑猩猩身上所觀察到的臨床參數比較接近，用黑猩猩來研究病毒在體內復制情況和發(fā)病機理及篩選HCV疫苗都是非常有價值的。但由于黑猩猩作為丙肝模型缺乏慢性肝病的表現，使得在肝硬化和肝細胞癌發(fā)病機理的研究方面受到限制9。此外，費用等問題也限制了它的應用范圍。猴GBV-B是近年來發(fā)現的黃熱病毒屬中的一員，是一種單股正

13、鏈RNA病毒，在所有的動物病毒中，GBV-B與HCV有高度核酸同源性，其多聚蛋白在氨基酸水平上有2530的同源性，因此推想治療HCV感染的抗病毒化合物同樣會對GBV-B有作用，使得GBV-B作為HCV的替代病毒建立感染模型成為可能。GBV-B可以感染絨猴，GBV-B感染絨猴40-60 d后可達到108109拷貝，60-80 d后病毒逐漸被清除。原代培養(yǎng)的絨猴肝細胞培養(yǎng)上清中及細胞中也成功地檢測到了GBV-B的感染。用HCV蛋白酶抑制劑可以有效降低體外培養(yǎng)絨猴肝細胞上清中及絨猴體內的病毒含量。Martin等10用合成的GBV-B RNA直接注射入小絹猴的肝臟，可誘使其產生持續(xù)性GBV-B感染，兩

14、個感染動物中有一個感染后病毒血癥超過2年，且出現了門靜脈周圍單核細胞浸潤、線粒體結構改變及脂肪變性等慢性肝炎的組織病理學改變11。近年有關猴作為HCV感染模型的報道不多，其作為可供研究HCV使用模型的可能性有待驗證。樹鼩樹鼩是一種與靈長類親緣關系較近的哺乳動物，對多種人類病毒，包括(boku)甲、乙和丁型肝炎病毒易感。Xie等12對樹鼩進行病原接種發(fā)現，僅有1/4能感染HCV，在體內(t ni)檢測到短暫或間歇的低效價病毒血癥。 若樹鼩接受cGy750照射后再進行病原接種，HCV感染效率、病毒血癥及抗體效價均明顯提高。但由于樹鼩是野生動物，實驗室飼養(yǎng)困難，廣泛應用受到限制。小鼠3.4.1 轉基

15、因小鼠模型(mxng)小鼠主要有轉基因小鼠模型、質料轉染鼠模型和人鼠嵌合體肝移植鼠模型。轉基因技術自1980年代初發(fā)展起來現已成為生命科學領域中普遍應用的常規(guī)技術手段，HCV轉基因小鼠主要為結構基因轉基因小鼠，在病毒導致肝炎、肝脂肪及肝癌的致病機制方面的研究起了很大的作用。Pasquinelli等13將編碼HCV結構蛋白的C、E基因分別插入到鼠主尿蛋白下游，建立攜有HCV基因片段的轉基因小鼠。這種對T細胞免疫應答功能的抑制可能是由于HCV感染增強了T 淋巴細胞對Fas-介導的細胞凋亡的敏感性，HCV核心蛋白可能是通過促進Fas-介導的T 淋巴細胞凋亡以及肝臟的T 淋巴細胞浸潤而導致肝損傷。HC

16、V各組成蛋白的致癌機制也是以HCV轉基因小鼠模型進行研究的，Kato等14發(fā)現在飼養(yǎng)了1824個月后，HCV核心基因轉基因小鼠的肝臟內均未出現腫瘤，但是經四氯化碳處理后可發(fā)生肝細胞癌，因此認為HCV核心蛋白導致的肝細胞再生速率的提高可能是增強肝臟發(fā)生癌變機率的機制之一。成軍等15發(fā)現約80%的HCV結構基因的轉基因小鼠模型發(fā)生肝臟等內臟的脂肪變，為研究HCV慢性感染引起的脂肪變奠定了基礎。Kamegaya等16將HCV E1蛋白、E2蛋白和核心蛋白的轉基因小鼠用DEN處理后于第32周處死，然后檢測細胞的增殖和凋亡情況，發(fā)現兩組小鼠與正常小鼠間的細胞增殖沒有顯著差別，但核心-E1-E2 轉基因小

17、鼠的較大，而凋亡指數卻小于核心基因轉基因小鼠，因而認為HCV結構蛋白促進腫瘤生成的原因可能是由于抑制肝細胞凋亡而并不是促進肝細胞增殖。雖然轉基因小鼠作為HCV感染模型的報道較多，但各方研究不盡相同，且存在很多問題，轉基因小鼠處于免疫耐受狀態(tài)，對HCV導致肝細胞損傷的原因，究竟是病毒的直接作用還是病毒與機體免疫系統(tǒng)的相互作用尚有爭議，并難以用于疫苗的研發(fā)。3.4.2 質粒轉染鼠模型 由于HCV病毒不能直接感染小鼠，因此人們嘗試用含有HCV的質粒轉染小鼠肝細胞或體內轉染的方法表達HCV蛋白。詹林盛等17用含內部核糖體起始位點IRES的HCV 5NCR及部分多聚蛋白起始區(qū)序列與熒光素酶基因融合，然后

18、插入含CMV啟動子的Pci-neo質粒中，得到真核表達質粒Phcv-neo4，進一步采用水動力轉染法將pHCV-neo4表達載體轉染到小鼠體內，在小鼠肝臟檢測到熒光素酶的高水平表達，同時HCV IRES介導的熒光素酶在小鼠心、脾、腎臟組織中也得到表達，但表達量僅為肝臟的1100l1 000，可以作為體內瞬時評價以HCV IRES為靶位的抗HCV藥物活性的小鼠模型。3.4.3 人鼠嵌合體肝移植鼠模型(mxng)此方法是在免疫缺陷小鼠體內移植人肝細胞，通過肝門靜脈或脾髓注射(zhsh)，使小鼠感染HCV。Brown等19利用原代或無限增殖的人肝細胞進行實驗，結果表明所建立的HCV小鼠模型可用于HC

19、V的體內(t ni)研究。Mercer等20通過在纖維蛋白溶酶原激活蛋白轉基因的SCID小鼠肝臟內植入正常人肝組織，然后接種HCV患者血清建立了一種HCV嵌合感染的小鼠模型，該小鼠的肝臟中能檢測到病毒RNA的復制。其體內病毒滴度最高能達到1:1950，而且這種感染能連續(xù)傳遞三代。Galun等21采用的方法是給免疫缺陷小鼠（BNX）以放射性照射，然后用免疫缺陷小鼠的骨髓細胞進行重建，再把感染了HCV患者的肝碎片移植到用前述方法所制備的小鼠腎被膜下。這種三聯體小鼠在移植后1015天內，有50%以上用RT-PCR法可以檢測到HCV RNA。Ilan等22報道三聯體HCV小鼠感染率為85%，且可以用抗

20、病毒藥物減輕小鼠的病毒血癥，但這種方法由于免疫排斥，肝存活時間較短，且病毒血癥水平較低，而影響該鼠對人肝細胞產生免疫耐受。結語近幾年，在建立HCV動物模型技術上有了很大突破。新的動物模型基本上都是在人鼠嵌合體轉基因小鼠基礎上建立的，必將為HCV的研究帶來新的突破。鼠的免疫缺陷恰恰能滿足異種動物成分的介入，從而擴大了HCV模型的應用。但是還有待于進一步研究更加方便、精確的小動物模型，進行有關發(fā)病機制、藥物以及疫苗方面的研究。參考文獻Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer H, et al. HYPERLINK /pubmed/19821520 Cyclosporine

21、A inhibits hepatitis C virus nonstructural protein 2 through cyclophilin A. Hepatology. 2009, 50(5): 1638-1645.Shimizu YK, Lwamoto A，Hijikata M，et al. Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus genome in a human T-cell line. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89(12): 5477- 5481.Iacovacci S, M

22、anzin A, Barca S, et al. Molecular characterization and dynamoics of hepatitis C virus replication in human fetal heaptocytes infected in vitro. Hepatology, 2007, 26(5): 1328- 1337.Rumin S, Berthilion P, Tanaka E, et al. Dynamic analysis of hepatitis C virus replication and quasispecies aelection in

23、 long-term cultures of adult human heaptocytes in vitro. Genvirol, 1999, 80(11): 3007- 3009.Yoshikura H, Hijikata M, Nakajima N, et al. Replication of hepatitis C virus. J Viral Hepat, 1996, 3(1): 3- 10.Kishine H, Sugiyama K, Hijikata M, et al. Subgenomic replicon derived from a cell line infected w

24、ith the hepatitis C virus. Biochem Bioplys Res Commun, 2002, 293(3): 993- 999.Pietschmann T, Lohmann V, Rutter G, et al. Characterization of cell lines carrying serf-replicating hepatitis C virus RNAs. J Virol, 2001, 7(5): 1252-1264.Lohmann V, Komer F, Koch J, et al. Replication of subgenomic hepati

25、tis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science, 2009, 1(10): 113- 116.Ciesek S, Steinmann E, Wedemeyer H, et al. HYPERLINK /pubmed/19821520 Cyclosporine A inhibits hepatitis C virus nonstructural protein through cyclophilin A. Hepatology. 2009, 50(5): 1638- 1645.Martin A, Bodola F, Sangar DV, et

26、al. Chronic hepatitis associated with GB virus B persistence in a tamarin after intrahepatic inoculateion of synthetic viral RNA. PROC Natl Acad Sci USA, 2003, 100(17): 9962- 9967.Lemon SM, McKeating JA, Pietschmann T, et al. HYPERLINK /pubmed/20417376 Development of novel therapies for hepatitis C.

27、 Antiviral Res. 2010, 86(1): 79- 92.Xie ZC, Riezu BJ, Lasarte JJ, et al. Transmission of hepatitis C virus infection to tree shrews. Virology, 1998, 244(2): 513- 520.Pasquinelli C, Shoenberger JM, Chung J, et al. Hepatitis C virus core and E2 protein expression in transgenic mice. Hepatology 1997, 2

28、5(8): 719-727.Kato T, Wakita T, Pietschmann T, et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.Nat Med, 2005, 1(7): 791- 796.成軍, 任進余, 李莉, 等. 丙型肝炎病毒(bngd)結構基因轉基因小鼠引起肝臟脂肪變. 世界華人消化雜志, 2002,10(9): 1022- 1026.Kamegaya Y, Hiasa Y, Zukergerg L, et al. Repeated heaptocyte injury promotes hepatic tumori