電鏡超薄切片

1、透射電子顯微鏡生物制品制備技術(shù) 1234冷凍蝕刻法超薄切片5冷凍蝕刻法 冷凍割斷術(shù)6細(xì)胞化學(xué)法7免疫組織化學(xué)技術(shù) 免疫電鏡法8電鏡放射自顯影術(shù) 放射自顯影技術(shù)9掃描電鏡技術(shù)被吞噬的紅細(xì)胞10現(xiàn)有的透射電鏡生物制品制備技術(shù)分為兩類：一類是透射電鏡的基本制備技術(shù)，包括超薄切片和負(fù)染色法；另一類是生物制品的特殊技術(shù)，其中包括冷凍蝕刻法、冰凍割斷術(shù)、細(xì)胞化學(xué)法、免疫電鏡法、放射自顯影技術(shù)、X線微區(qū)分析技術(shù)等。 111、 超薄切片樣品的制備（1） 取材 基本要求是在活體情況下進(jìn)行取材的原則(快、準(zhǔn)、輕、小、冷的原則）1） 快速：1分鐘之內(nèi)投入固定液。2） 塊小：0.5-1mm3或截面1mm2的長條。3）

2、 部位準(zhǔn)4） 損傷小：器械應(yīng)銳利，避免牽拉、擠壓，防止組織受機(jī)械損傷。5） 低溫：0-4oC12取材的方法1）動物材料： 對神經(jīng)組織等要進(jìn)行原位固定或灌注固定，待組織適當(dāng)硬化后再取材。13胚胎干細(xì)胞的研究142）培養(yǎng)細(xì)胞： 生長在瓶中的細(xì)胞到足夠的量，先倒去培養(yǎng)液，然后倒入適量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分鐘、彎頭吸管吹打或用軟器械輕輕地刮下貼壁的細(xì)胞，將這種混合液倒入離心管中，2000rpm低速離心15-20分鐘，使細(xì)胞呈團(tuán)，棄去上清液，換一次固定液，將其移入修塊臺，修快成標(biāo)準(zhǔn)塊4oC固定、待用。153）單細(xì)胞懸液：精子、血球等其他不易聚集的懸浮游離材料，可加入等量的戊二醛和其他類型的固定

3、液，輕輕地把他們懸浮在固定液中。經(jīng)過固定處理后再離心成團(tuán)，在50oC中棄去上清液，加入適量的經(jīng)50oC預(yù)溫的2%的瓊漿，使團(tuán)懸浮，將懸浮團(tuán)和瓊脂液一同在薄片上展層，固定后切成1mm3的小塊。16（2）固定 固定的目地是把細(xì)胞在活體狀態(tài)時的結(jié)構(gòu)盡可能完整的保存下來，避免自身酶的分解而出現(xiàn)自溶，或外界微生物的侵入而產(chǎn)生腐敗，致細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)破壞。171）固定液的作用A阻止細(xì)胞自溶。B 穩(wěn)定細(xì)胞物質(zhì)成分。C 在一些組分的分子之間以化學(xué)反應(yīng)和物理反應(yīng)建立鉸鏈，提供一個骨架來穩(wěn)定各種細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)。D能提供一定的電子反差 18 理想的固定劑，應(yīng)具備以下條件：能迅速而均勻地滲入組織細(xì)胞內(nèi)部，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)各種

4、成分；能即刻將細(xì)胞“殺死”，盡可能保持細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)，減少死后變化；對細(xì)胞不產(chǎn)生收縮及膨脹作用，不產(chǎn)生人工假象及變形；可保存酶的活性，以利于細(xì)胞化學(xué)測定工作的進(jìn)行。192）影響固定效果的因素固定液的酸堿度(pH值)固定液的pH值滲透壓緩沖液的類型固定的溫度和時間當(dāng)前采用的是在04下固定1 4小時。203）常用的幾種固定劑A 四氧化鋨（osmium tetroxide,OsO4）亦稱鋨酸：鋨酸實際上不是酸，它的水溶液是中性的，為一種強(qiáng)氧化劑。0.5-1g包裝，淡黃色晶體。具有揮發(fā)性和毒性，在室溫下易揮發(fā)，其蒸氣對粘膜有刺激作用，在通風(fēng)櫥內(nèi)徑相配制。21優(yōu)點對蛋白質(zhì)和脂類固定較好。對作為細(xì)胞骨架的磷

5、酸脂蛋白的作用好，對核蛋白保護(hù)作用很好，因為在有機(jī)體內(nèi)核酸和碳水化合物與蛋白制成復(fù)合的形式，因此鋨酸幾乎和所有的細(xì)胞成分結(jié)合。分子密度高，產(chǎn)生良好的反差，因此鋨酸固定本身也起到生物染色作用。缺點不能固定糖元和核酸，對微管固定較差。擴(kuò)散慢，穿透能力差。具有揮發(fā)性和粘膜毒性。不適于進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)工作。22B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2）純的容易聚合，目前使用25%水溶液進(jìn)口分裝。存放時間久了容易變質(zhì)，影響固定。 優(yōu)點 (1)對組織穿透力強(qiáng)。(2)能保存某些酶的活性，對糖元、細(xì)胞膜、核基質(zhì)等有較好的作用。(3)而且組織塊在溶液中可保存較長的時間，適用于進(jìn)行超微細(xì)胞化學(xué)研究。 23

6、C 甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉劑配制。其分子小，滲透力強(qiáng)，固定迅速，對酶的活性保存好。 24252）固定的方法A 單固定法：對單細(xì)胞或固定液易于浸透的組織，一般單獨用1-2%四氧化鋨固定液固定1-2小時可達(dá)到固定的目地。B 雙固定法：戊二醛（2.5% 4oC 2h）-鋨酸（1% 4oC 2h）。C 原位固定和灌注固定：將動物麻醉、解剖進(jìn)行原位固定。灌注固定：通過血液循環(huán)將醛類的固定液灌流到所需組織中。神經(jīng)組織、視網(wǎng)膜、腎臟。26附 幾種常見固定劑的配制 固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,對含水較多的組織可用PH值8.0，細(xì)菌、病毒可用PH值在7.0以下

7、。0. 2mol/L磷酸緩沖液的配制 磷酸二氫鈉（NaH2PO4.H2O） 2.6g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O） 29g 重蒸水 加到500ml 調(diào)PH到7.4270.2mol/L二甲坤酸鹽酸緩沖液重蒸水 25ml二甲坤酸鈉（Na(CH3)2AsO2.3H2O） 2.14g0. 1mol/L鹽酸 8ml重蒸水 加至50ml調(diào)PH到7.4 28B 固定液的配制鋨酸固定液的配制2%的鋨酸固定液的配制：清洗烘干器皿-1G鋨酸+50ml雙蒸水（棕色瓶）數(shù)日可用。0.1mol/L磷酸鹽緩沖液或二甲坤酸鹽緩沖液配制的1%鋨酸固定液。 2%的鋨酸緩沖液 10ml 0.2mol/L緩沖液 10m

8、l 調(diào)節(jié)PH應(yīng)為7.3-7.429戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml） 0.4 1 1.6重蒸水（ml） 4.6 4 3.40.2ml/L緩沖液（ml） 5 5 5戊二醛最終濃度 1 2.5 4調(diào)節(jié)固定液PH值到7.3-7.430（3） 脫水1）清洗:固定后均用和固定液相同的緩沖液沖洗3次，每次15分鐘2） 脫水：常用的脫水劑為乙醇和丙酮。乙醇引起組織中脂類物質(zhì)抽提較丙酮少，且不會使組織變硬、變脆，故為常用脫水劑，然乙醇不容易和用于包埋劑的環(huán)氧樹脂相混溶，因此在進(jìn)入包埋劑之前常用中間劑環(huán)氧丙烷置換。31脫水程序如下表濃度50%70%90%100%時間10-1510-1510-153次（每次1

9、0-15）溫度4oC4oC轉(zhuǎn)室溫室溫32經(jīng)驗：脫水劑臨時配制。濃度梯度上升。脫水時間和濃度。脫水時的連續(xù)性。脫水劑的選擇。33（4）浸透：其目的是通過脫水劑稀釋包埋劑，最終讓包埋劑取代脫水劑，使其滲透到組織中去。 脫水和包埋劑的比例2:11:2純包埋劑時間1-2h2-3h2h溫度室溫室溫37oC溫箱34經(jīng)驗：浸透時間。浸透溫度。35（5） 包埋：目的:包埋的目的是讓包埋劑完全浸透到組織內(nèi)部，經(jīng)加溫逐漸聚合成堅硬的固體，成為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的支架，能夠承受切片的各種力的作用，有利于切薄片。包埋劑的性質(zhì):粘度適中，有良好的切割性能。能耐受電子束的轟擊，高溫不易升華、不變形。透明度好。對人無害。36包埋劑的

10、種類環(huán)氧樹脂類：目前國內(nèi)使用較多的環(huán)氧樹脂有進(jìn)口的Epon 812和國產(chǎn)的618。原理:環(huán)氧樹脂具有環(huán)氧基和羥基兩個主要化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)，環(huán)氧基是線型聚合物的末端，易與其它含活性氫原子的化合物如胺類反應(yīng)，形成首尾相接的長鏈狀聚合物。而單體中的羥基能與酸酐結(jié)合，形成分子間的橫橋連接。因此，將環(huán)氧樹脂、胺類和酸酐三者按比例混合，在一定溫度條件下，可形成具有三維空間結(jié)構(gòu)的交鏈狀聚合物。37這種聚合物收縮率小、均勻，組織損傷小，耐電子束的轟擊。包埋后可保存細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu)。其缺點是粘度較大，操作不便、切片較為困難，而且反差較弱。38低粘度包埋劑(Spurr) 為適應(yīng)臨床診斷電鏡的需要，目前低粘度包埋劑的應(yīng)

11、用已日趨廣泛。這是一種低粘度的樹脂，能較好地滲入組織內(nèi)部，對組織結(jié)構(gòu)保存好，耐電子束轟擊，可廣泛應(yīng)用于各種生物材料，尤其適宜于較致密的組織。 39水溶性包埋劑： 是進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)研究較理想的包埋劑。 原理:水溶性包埋劑可以在較低溫度的紫外線照射下進(jìn)行聚合，避免了一般包埋劑必須在高溫下聚合而給酶活性帶來的破壞，所以是酶活性定位和定量研究十分優(yōu)良的包埋劑。 包埋劑:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(簡稱GMA)、聚乙二醇、Aquon等 40所加的固化劑，有十二烯基虎鉑酸酐（DDSA）和甲基內(nèi)次甲基四氫苯二甲酸酐（MNA）,增韌劑為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速劑為2,4,6,一三苯酚（DMP3

12、0）。411） 環(huán)氧樹脂的性能和配制：618樹脂 5ml十二烯基丁二酸酐 DSA（固化劑） 5ml苯二甲酸二丁酯 DBP（增塑劑） 0.3ml2,4.6三苯酚 稱DMP30（加速劑） 0.1ml60oC烘箱內(nèi)加溫使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化劑、增塑劑、加速劑，邊加邊攪拌，最后充分?jǐn)嚢?0分鐘，至37oC溫箱中使氣泡逸出。 42Epon812的配制A液：Epon812 62ml DDSA(固化劑) 100mlB液：Epon812 100ml MNA(固化劑) 89mlA液和B液分別配制，使用時用不同比例將二者混合后再加1.5%DMP-30(加速劑)即可。A液和B液的比例：冬季2

13、：8。夏季1：9。B液可以增加包埋塊的硬度。431） 包埋的方法44常規(guī)包埋 將浸透在包埋劑的組織塊，轉(zhuǎn)移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋劑。 把寫好標(biāo)本塊編號的小紙條卷成環(huán)狀，放入囊中，插入包埋劑中。 不加蓋，37oC過夜，這也就是純包埋劑浸透。 次日，升溫到60oC48小時固化。 固化完畢，關(guān)溫箱，自然冷卻。 去掉外殼，取出組織包埋塊將組織包埋塊，存放在干燥器中。 45定向包埋：注意事項防潮、干燥。包埋劑要充分混勻。防氣泡。包埋后立即清洗器皿。自身保護(hù)。干燥器中存放包埋塊。 46（6）切片1）選擇和清洗載網(wǎng)。常用的載網(wǎng)有圓形的銅網(wǎng)，細(xì)胞化學(xué)和免疫組織化學(xué)常用鎳網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)和銀絲網(wǎng)。

14、直徑為3mm，目數(shù)為200-300 472） 支持膜的制備： 福爾莫瓦膜：常用氯仿配制的 0.2%-1.5%的聚乙烯醇縮甲醛液（formrar）。注：制膜時室內(nèi)的溫度小于60%，否則會出現(xiàn)白點。 火棉膠膜：特點，火棉膠膜的機(jī)械強(qiáng)度比福爾莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸異戊酯溶液采用漏斗法和貼附法制膜。 帕羅丁支持膜：目前國外比較常用，一般配制30%左右的帕羅丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉膠同。 碳膜：炭膜的機(jī)械程度和穩(wěn)定性較好，適用于高分辨率的觀察，用真空噴鍍儀采用碳升華噴鍍法制備。 復(fù)合膜：有機(jī)膜上噴鍍5-10nm的碳膜。 微孔支持膜：高分辨率觀察使用。482） 包埋塊修整：修成四面錐

15、體（45oC角）495）超薄切片機(jī)的構(gòu)造 6）切片操作 7） 切片厚度: 灰色 40-50nm 銀灰色 50-70nm 金黃色 70-90nm 紫色 90nm以上50(7)染色1） 常用的電子染色劑醋酸鈾(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，對光不穩(wěn)定，儲存、染色最好閉光，變混則失效。廣泛使用，能產(chǎn)生較高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和結(jié)締組織纖維成分的反差；對糖分、分泌顆粒、溶酶體等也能染色，但對膜的結(jié)構(gòu)染色較差。常用濃度：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的時間：組織塊染色時間為1-2h或過夜。片染30min即可。 51枸櫞酸鉛（lead acetate）：特點：毒性大。與空氣中的二氧化碳結(jié)合形成白色的碳酸鉛沉淀。高PH（11-12）染色效果好。也是目前最廣泛使用的染色液。它具有很高的電子密度，對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均有廣泛的親和性，能提高細(xì)胞膜系統(tǒng)及酯類的反差。枸櫞酸鉛（lead citrate）溶液的配制硝酸鉛Pb(NO3)2 1.33g枸櫞酸鈉Na3(C6H6O7).2H2O 1.76g雙蒸水 30ml混合后振蕩30min呈乳白色，加1.0mol/L新鮮