基于FMDV2A新型多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

1、 HYPERLINK javascript:void(0) 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(63004601)作者簡(jiǎn)介：劉丹清，女，碩士，研究方向：乙肝相關(guān)性肝癌機(jī)制研究，電話E-mail： HYPERLINK mailto: 通訊作者：廖勇，電話：02363893780，E-mail： HYPERLINK mailto:y8982000 y8982000；任紅，電話：02363693029，E-mail：renhong0531基于FMDV 2A新型多基因共表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)劉丹清，殷文偉，劉俊英，盛云建，童師雯，湯慧，廖勇，任紅(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院感染科，重慶醫(yī)科

2、大學(xué)病毒性肝炎研究所，重慶4000l0)摘要 目的 構(gòu)建基于口蹄疫病毒 （Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV) 2A片段的多順?lè)醋虞d體，在293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)HBx基因、人Sox2基因及人c-Myc基因的共表達(dá)。方法 以FMDV 2A序列連接HBx、帶HA標(biāo)簽Sox2和c-Myc編碼序列形成一個(gè)開(kāi)放讀碼框（open reading frame ，ORF），化學(xué)法合成DNA序列，通過(guò)酶切連接構(gòu)建多基因共表達(dá)載體pEGFPC-XSM。應(yīng)用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pEGFPC-XSM轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent p

3、rotein，GFP)，Western blot驗(yàn)證HBx基因、Sox2基因和c-Myc基因的表達(dá)。結(jié)果 重組質(zhì)粒pEGFPC-XSM經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定，目的序列插入位點(diǎn)及讀碼框正確；轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下pEGFP-C1、pEGFPC-XSM組可見(jiàn)GFP表達(dá)；Western blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pEGFPC-XSM的293T細(xì)胞高效共表達(dá)含GFP標(biāo)簽的HBx融合蛋白、含HA標(biāo)簽的Sox2融合蛋白和c-Myc蛋白。結(jié)論 成功構(gòu)建多順?lè)醋虞d體pEGFPC-XSM，利用相同的FMDV 2A序列實(shí)現(xiàn)HBx、Sox2和c-Myc蛋白的非融合共表達(dá)。關(guān)鍵詞 口蹄疫病毒2A；多順?lè)醋?；共表達(dá)；質(zhì)粒 中圖

4、法分類號(hào) R735.7；R512.6+2Construction of a new vector for the co-expression of multigenes based on FMDV2ALiu Danqing，Yin Wenwei，Liu Junying，Sheng Yunjian，Tong Shiwen，Tang Hui，Liao Yon，Ren Hong（Department of Infectious Diseases of the Second Affiliated Hospital，Institute for Viral Hepatitis，Chongqing Medi

5、cal University， Chongqing，400010，China）Abstract Objective To construct a multicistronic vector for co-expression of HBx gene, human Sox2 gene and human c-Myc gene in 293T cells by using Foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2A segment. Methods Sequence of the open reading frame (ORF) composed of codin

6、g sequences of HBx, Sox2 with HA tag and c-Myc connected by FMDV 2A was obtained by chemical synthesis. Multigene expression vector was constructed through restriction enzyme digestion and DNA ligation. The recombinant plasmid pEGFPC-XSM was transferred into 293T cells under the mediation of lipofec

7、tamine. Forty-eight hours after transfection, the expression of green fluorescent protein (GFP) was examined by fluorescence microscopy and the expression of HBx protein, Sox2 protein and c-Myc protein was tested by Western blot. Results The cloning site and reading frame of objective sequence was c

8、onfirmed by restriction endonuclease analysis and DNA sequencingAfter forty-eight hours, GFP was observed in groups transfected with pEGFP-C1 and pEGFPC-XSM. Western blot revealed highly efficient co-expression of GFP-HBX fusion protein, HA-Sox2 fusion protein and c-Myc protein in 293T cells transfe

9、cted with pEGFPC-XSM. Conclusion Multicistronic expression vector pEGFPC-XSM was successfully constructed and the same FMDV 2A sequence facilitate co-expression of HBx, Sox2 and c-Myc independentlyKey words Foot-and-mouth disease virus 2A; Multi-cistron; Plasmid; Co-expressionSupported by the Genera

10、l Program of National Natural Science Foundation of China (63004601)Corresponding author: Liao Yon，Tel: 023 63893780，E-mail： HYPERLINK mailto:y8982000 y8982000；Ren Hong，Tel: 023 63693029， E-mail：renhong0531腫瘤的發(fā)生往往是多基因共同作用的結(jié)果，過(guò)去人們受限于基因工程技術(shù)的發(fā)展，僅能單一地調(diào)節(jié)12個(gè)基因的表達(dá)，對(duì)腫瘤進(jìn)行有限的基因治療和生物醫(yī)學(xué)研究。近年來(lái)，利用多基因轉(zhuǎn)化策略從遺傳學(xué)角度調(diào)控腫

11、瘤相關(guān)功能基因高效表達(dá)，從而觀察共表達(dá)對(duì)分化、發(fā)育、病變的影響，已成為當(dāng)前研究腫瘤發(fā)病機(jī)制和基因治療的趨勢(shì) ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_1 o Okita K, 2010 #3239 1, HYPERLINK l _ENREF_2 o Szymczak, 2004 #3202 2。目前的多基因共表達(dá)策略主要包括：多載體共轉(zhuǎn)法、構(gòu)建多啟動(dòng)子(multiple promotors)載體、構(gòu)建剪接載體(splicing)、形成融合基因（fusions）、蛋白酶解分離（proteolytic processing）、內(nèi)部核糖體

12、進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site , IRES)連接目的基因、基因之間連接自剪切2A(self-cleavage 2A)元件等（表1）。然而前幾種方法因載體容量有限、工作量大、融合蛋白功能影響、上下游基因表達(dá)差異等缺陷逐步被放棄 ADDIN EN.CITE de Felipe2002324433244324417de Felipe, P.University of St. Andrews, Centre for Biomolecular Sciences, St. Andrews, KY16 9ST, Scotland, United Kingdom. pdf

13、st-andrews.ac.ukPolycistronic viral vectorsCurr Gene TherCurr Gene Ther355-78232002/08/23Artificial Gene Fusion*Genetic VectorsHumansPromoter Regions, GeneticProtein Processing, Post-TranslationalRNA SplicingSatellite Viruses/geneticsViruses/*genetics2002Sep1566-5232 (Print)1566-5232 (Linking)121897

14、21/pubmed/12189721eng HYPERLINK l _ENREF_3 o de Felipe, 2002 #3244 3。而FMDV 2A及源于其他病毒的類2A元件，可通過(guò)翻譯時(shí)自剪切，順式切開(kāi)前后連接的氨基酸序列，實(shí)現(xiàn)上下游蛋白共表達(dá) ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_3 o de Felipe, 2002 #3244 3, HYPERLINK l _ENREF_4 o Carey, 2009 #3201 4。FMDV 2A具有結(jié)構(gòu)小、上下游基因表達(dá)平衡、剪切效率高等優(yōu)點(diǎn)，因此該元件為多基因協(xié)同作用的生物學(xué)

15、效應(yīng)研究提供了重要途徑。肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，但HCC發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。越來(lái)越多的研究表明肝癌的發(fā)生源于肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells，LCSCs)，并與HCC的進(jìn)展、耐藥、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān) ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_5 o Roskams, 2006 #3246 5, HYPERLINK l _ENREF_6 o Yamashita, 2009 #3247 6。對(duì)LCSCs起源的假說(shuō)，有學(xué)者認(rèn)為

16、是已分化成熟的子代細(xì)胞再激活干細(xì)胞程序轉(zhuǎn)化而來(lái)。而且，最近研究發(fā)現(xiàn)分化成熟的體細(xì)胞僅需四個(gè)體細(xì)胞核再編程因子參與，即Oct3/4, Sox2, c-Myc和KLF4，便可誘導(dǎo)出與胚胎干細(xì)胞極其相似的可誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells） ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_7 o Takahashi, 2006 #3252 7。LCSCs與iPS細(xì)胞在自我更新、分化潛能和細(xì)胞增殖等特征上極其相似。因此，借鑒研究iPS細(xì)胞的方法，用核重編程因子Sox2, c-M

17、yc等聯(lián)合HBx或其他致癌基因用于研究HCC具有重要的醫(yī)學(xué)意義。本研究使用兩段相同的FMDV 2A序列連接各目的基因形成多順?lè)醋?，通過(guò)重組構(gòu)建多基因共表達(dá)載體pEGFPC-XSM并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢驗(yàn)FMDV 2A是否能高效自剪切，從而共表達(dá)HBx蛋白、Sox2蛋白和c-Myc蛋白，為下一步深入研究HCC奠定基礎(chǔ)。1材料與方法材料1.1.1 主要試劑 大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)至天根生化科技公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)至Qiagen。限制性內(nèi)切酶Bgl II、 Sal I，T4 DNA Ligase購(gòu)至Thermo scientific，DNA Marker 購(gòu)至Novoprotein。細(xì)胞培養(yǎng)基

18、DMEM購(gòu)至Thermo scientific，胎牛血清購(gòu)至Gbico。Lipofectamine TM 2000 reagent購(gòu)至Invitrogen。小鼠抗Myc單克隆抗體和兔抗HA多克隆抗體購(gòu)至abcam、兔抗GFP多克隆抗體購(gòu)至Cell Signaling，小鼠抗HBX單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗均購(gòu)至Santa cruz。1.1.2 質(zhì)粒 pEGFP-C1由本實(shí)驗(yàn)室保存，pCR4TOPO-C0263G為華大基因購(gòu)買(mǎi)。1.1.3 細(xì)胞 293T人胚腎細(xì)胞株(下文中簡(jiǎn)稱293T細(xì)胞) 購(gòu)至ATCC。1.2方法1.2.1 化學(xué)合成由FM

19、DV 2A連接的多順?lè)醋有蛄性贜CBI中查找血清型為ayr的HBV基因定位NC_003977，編碼HBx蛋白的cDNA含465個(gè)核苷酸。相似的方法查找人Sox2基因及c-Myc基因定位NM_003106和NM_002467，其cDNA分別由954、1320個(gè)核苷酸序列組成。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，獲得HA標(biāo)簽序列和FMDV O1K16型 2A序列 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_8 o Hasegawa, 2007 #3199 8, HYPERLINK l _ENREF_9 o Wang, 2011 #3278 9。以FMDV 2A

20、連接各基因cDNA序列，同時(shí)去除其上游cDNA的終止密碼子形成一個(gè)ORF，即組合為:HBx-2A-HA-Sox2-2A-c-Myc多順?lè)醋?。將設(shè)計(jì)的多順?lè)醋有蛄兴腿A大基因科技公司化學(xué)合成。1.2.2 真核表達(dá)載體pEGFPC-XSM的構(gòu)建將pEGFP-C1(4.7kb)及pCR4TOPO-C0263G(7kb)用Bgl II、 Sal I雙酶切后，凝膠回收目的片段與酶切回收的載體pEGFP-C1用T4 DNA連接酶22連接過(guò)夜，得到重組質(zhì)粒pEGFPC-XSM多順?lè)醋诱婧吮磉_(dá)載體。將連接產(chǎn)物pEGFPC-XSM熱激轉(zhuǎn)化入DH5感受態(tài)大腸桿菌，涂布于含卡那霉素（Kanamycin，Kan）50m

21、g/L的LB固體培養(yǎng)基平板上，37，培養(yǎng)過(guò)夜，次日，挑取單菌落，提質(zhì)粒酶切電泳初步篩選檢測(cè)后送上海生工生物公司測(cè)序鑒定。1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 采用含10胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，在37、5CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前12小時(shí)取呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的293T細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞覆蓋孔面積約50%-60%時(shí)用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)Lipofectamine TM 2000：DNA比例為9ul：3ug，分別用250ul的Opti-MEM稀釋混勻后，將質(zhì)粒與脂質(zhì)體等比例混勻，室溫下放置15-20

22、min；每孔加入500ul混合物輕輕混勻，于細(xì)胞培養(yǎng)箱37、5CO2培養(yǎng)。5小時(shí)后移去含Lipofectamine TM 2000的Opti-MEM，用含10 FBS 的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。同時(shí)以轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照。124 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞GFP的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，于暗室熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞GFP表達(dá)情況。125 HBx、Sox2和c-Myc蛋白表達(dá)的鑒定 移去轉(zhuǎn)染pEGFPC-XSM質(zhì)粒的293T細(xì)胞株培養(yǎng)液，用冰PBS洗3次，加入蛋白裂解液RIPA 100ul/孔，1ul 100mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF 100），反應(yīng)5分鐘后將細(xì)胞刮下，繼續(xù)在

23、冰上反應(yīng)10分鐘。然后，于4，13000rpm/離心30分鐘，取上清進(jìn)行western blot分析。2結(jié)果2.1 化學(xué)合成多順?lè)醋有蛄屑皃EGFPC-XSM的構(gòu)建設(shè)計(jì)的多順?lè)醋有蛄蠬Bx-2A-HA-Sox2-2A-c-Myc送深圳華大基因科技公司化學(xué)法人工合成，得到質(zhì)粒pCR4TOPO-C0263G。這樣所得DNA序列準(zhǔn)確性高，避免了傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)多輪擴(kuò)增可能帶來(lái)的錯(cuò)配，導(dǎo)致基因序列的改變。pCR4TOPO-C0263G經(jīng)Bgl II和 Sal I雙酶切后可見(jiàn)4kb載體片段及3kb的目的片段，將目的片段定向克隆至Bgl II和 Sal I雙酶切后4.7kb的載體pEGFP-C

24、1中，得到重組質(zhì)粒pEGFPC-XSM（圖1，圖2A）。圖1 pEGFPC-XSM的構(gòu)建及2A自剪切介導(dǎo)的多順?lè)醋颖磉_(dá)Fig.1 Construction of pEGFPC-XSM and multicistronic expression via the 2A-mediated self-cleaving mechanism2.2 多基因共表達(dá)載體pEGFPC-XSM的鑒定化學(xué)合成的多順?lè)醋悠慰寺〉絧EGFP-C1中，構(gòu)建的重組pEGFPC-XSM多基因共表達(dá)載體經(jīng)Bgl II單酶切和0.7%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)一長(zhǎng)約7.7kb的DNA條帶，Bgl II、 Sal I雙酶切后產(chǎn)生兩條DNA

25、條帶，分別4.7kb和3kb（圖2B）。酶切電泳結(jié)果顯示目的序列插入表達(dá)載體位點(diǎn)正確。同時(shí)，測(cè)序結(jié)果顯示構(gòu)建的多基因共表達(dá)載體所含目的序列正確（圖3）。圖2 質(zhì)粒pEGFPC-XSM的構(gòu)建與鑒定(A) M. DL10 000 DNA Marker；1. pEGFP-C1 Bgl II酶切；2. pEGFP-C1 Bgl II/Sal I酶切；3. pCR4TOPO-C0263G Bgl II酶切；4. pCR4TOPO-C0263G Bgl II/Sal I酶切；5. 陰性對(duì)照(B) M. DL10 000 DNA Marker；1. pEGFPC-XSM Bgl II酶切；2. pEGFPC

26、-XSM Bgl II/Sal I酶切；3. 陰性對(duì)照Fig.2 Construction and identification of pEGFPC-XSM圖3 測(cè)序鑒定pEGFPC-XSMFig.3 Sequencing identify of pEGFPC-XSM2.3 GFP在293T細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-C1和重組質(zhì)粒pEGFPC-XSM 48 h后，熒光顯微鏡下觀察兩組293T細(xì)胞均可見(jiàn)特異性的綠色熒光，表明質(zhì)粒pEGFP-C1和重組質(zhì)粒pEGFPC-XSM均成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，而且轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFPC-XSM的293T細(xì)胞表達(dá)的GFP結(jié)構(gòu)未被其他共表達(dá)蛋白影響（圖

27、4）。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞不能觀察到綠色熒光，表明293T未受其他表達(dá)綠色熒光的載體污染。圖4 熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白A. 空白對(duì)照組 ；B. 空載pEGFP-C1組；C. pEGFPC-XSM組Fig.4 Green fluorescent protein observed by fluorescent microscopy （100）2.4 293T細(xì)胞中HBx蛋白、Sox2蛋白及c-Myc蛋白表達(dá)的檢測(cè)Western blot檢測(cè)HBx蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示（圖5A），在轉(zhuǎn)染多基因共表達(dá)質(zhì)粒pEGFPC-XSM組，可檢測(cè)到C-端含2A殘端并含有GFP標(biāo)簽的HBX融合蛋白條帶，GFP-

28、HBx-2A融合條帶約47kD，而對(duì)照、空載pEGFP-C1組沒(méi)有表達(dá)，空載pEGFP-C1組僅表達(dá)27kD的GFP蛋白，GAPDH為內(nèi)參；同時(shí)，在pEGFPC-XSM組中檢測(cè)到含HA標(biāo)簽和2A殘端的Sox2融合蛋白條帶，HA-Sox2-2A蛋白條帶約38kD，對(duì)照、空載pEGFP-C1組無(wú)表達(dá)（圖5B）；檢測(cè)c-Myc蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示，對(duì)照、空載pEGFP-C1、pEGFPC-XSM組均可見(jiàn)約49kD的c-Myc蛋白條帶，但對(duì)照、空載pEGFP-C1組僅微弱表達(dá)，pEGFPC-XSM組c-Myc蛋白表達(dá)水平明顯高于前兩組（圖5C）。在pEGFPC-XSM組中，各目的蛋白條帶大小與預(yù)期結(jié)果一

29、致，而且HBx蛋白、Sox2蛋白和c-Myc蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度接近，說(shuō)明FMDV 2A自剪切作用準(zhǔn)確，表達(dá)蛋白產(chǎn)物較均衡（圖5A，B，C）。在蛋白表達(dá)過(guò)程中，相同的FMDV 2A序列在同一讀碼框中仍具有高效自剪切活性，2A氨基酸序列連接的上下游蛋白分別表達(dá)，剪切作用較完全，僅見(jiàn)極少量大分子多聚蛋白條帶（圖5C）。 A B C圖5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染pEGFPC-XSM后293T細(xì)胞中蛋白的表達(dá)Fig.5 Protein expression of 293T cells after transfection demonstrated by Western blot討論隨著人類迎來(lái)后基

30、因組時(shí)代，HCC的研究及治療已逐漸向多基因、多靶點(diǎn)方向發(fā)展。早期研究者探索了各種多基因共表達(dá)方法，但很多方法因?qū)嶒?yàn)投入高、效率低而逐漸被放棄（表1）。其中最常用的是多啟動(dòng)子法，各啟動(dòng)子分別與不同基因形成獨(dú)立的ORF并串聯(lián)于同一個(gè)表達(dá)載體，但多啟動(dòng)子占據(jù)載體克隆空間，而且啟動(dòng)子間存在轉(zhuǎn)錄干擾，使各基因難以有效表達(dá) ADDIN EN.CITE Proudfoot19863231103231323117Proudfoot, N. J.Transcriptional interference and termination between duplicated alpha-globin gene co

31、nstructs suggests a novel mechanism for gene regulationNatureNature562-532260791986/08/07*Gene Expression RegulationGenesGlobins/*geneticsHeLa CellsHumansPromoter Regions, GeneticRNA Polymerase II/genetics*Transcription, Genetic1986Aug 7-130028-0836 (Print)0028-0836 (Linking)3736674/pubmed/373667410

32、.1038/322562a0eng HYPERLINK l _ENREF_10 o Proudfoot, 1986 #3231 10。后來(lái)人們把目光聚焦到IRES序列，該序列最初在小核糖核酸病毒(picornavirus)中發(fā)現(xiàn)，IRES在上游啟動(dòng)子控制下可使與之相連的下游基因轉(zhuǎn)錄，并以不依賴5端帽子(cap)結(jié)構(gòu)的方式啟動(dòng)下游基因mRNA的翻譯，從而實(shí)現(xiàn)多基因共表達(dá)。但是，IRES結(jié)構(gòu)大(0.5 kb)，載體容量往往有限，共表達(dá)基因超過(guò)2個(gè)就相當(dāng)困難；不依賴帽子結(jié)構(gòu)的翻譯效率低，下游基因表達(dá)量?jī)H能達(dá)到上游基因的2050，限制了其廣泛應(yīng)用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE

33、.DATA HYPERLINK l _ENREF_11 o Mizuguchi, 2000 #3197 11。表1 各種多基因共表達(dá)策略比較Tab.1 Comparison of different methods for multigene co-expression多基因共表達(dá)策略方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)多載體共轉(zhuǎn)法多個(gè)單基因載體同時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞各基因表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量可控工作量大、共表達(dá)效率低多啟動(dòng)子載體多個(gè)啟動(dòng)子分別與不同基因形成獨(dú)立ORF，各ORF串聯(lián)于一個(gè)表達(dá)載體不同種類啟動(dòng)子協(xié)調(diào)各基因表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄干擾，啟動(dòng)子抑制，載體重編構(gòu)建剪接載體在基因兩端輔以剪接信號(hào)序列，轉(zhuǎn)錄后剪接形成不同的mRNA分別表

34、達(dá)各基因剪接信號(hào)結(jié)構(gòu)短，減輕載體負(fù)擔(dān)剪接不可控、表達(dá)效率不穩(wěn)定形成融合基因多個(gè)目的基因編碼序列融合在同一個(gè)ORF，表達(dá)融合蛋白操作簡(jiǎn)便、目的基因等量表達(dá)蛋白功能受影響蛋白酶解分離在各基因間插入蛋白酶特異識(shí)別位點(diǎn)，翻譯后蛋白酶切割分離各目的蛋白結(jié)構(gòu)小、各基因表達(dá)水平相當(dāng)?shù)鞍酌覆环€(wěn)定，可酶解細(xì)胞其他蛋白IRES連接基因IRES序列插入需共表達(dá)的目的基因之間確保多基因共表達(dá)自身結(jié)構(gòu)較大，載體容量受限；上下游基因表達(dá)差異2A自剪切元件2A片段連接各目的基因編碼序列，通過(guò)翻譯后自剪切作用使各蛋白分離結(jié)構(gòu)小、剪切效率高、基因高水平共表達(dá)少量不完全剪切自剪切2A元件的發(fā)現(xiàn)，為構(gòu)建共表達(dá)三個(gè)及以上目的基因的多

35、順?lè)醋虞d體提供了可行性 ADDIN EN.CITE Kaji20093200123200320017Kaji, K.Norrby, K.Paca, A.Mileikovsky, M.Mohseni, P.Woltjen, K.MRC Centre for Regenerative Medicine, Institute for Stem Cell Research, University of Edinburgh, Edinburgh EH9 3JQ, UK. keisuke.kajied.ac.ukVirus-free induction of pluripotency and subseq

36、uent excision of reprogramming factorsNatureNature771-545872392009/03/03AnimalsBiological Markers/analysisCell LineCells, CulturedFibroblasts/cytologyGene Expression ProfilingGenetic Vectors/*geneticsHumansMiceNuclear Reprogramming/*geneticsPluripotent Stem Cells/*cytology/metabolismTransfection/*me

37、thodsTransgenes/genetics2009Apr 91476-4687 (Electronic)0028-0836 (Linking)19252477/pubmed/19252477266791010.1038/nature07864nature07864 piieng HYPERLINK l _ENREF_12 o Kaji, 2009 #3200 12。自剪切2A最早在FMDV中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV編碼外殼蛋白前體（PI-2A)和2BCP3的基因中即含2A序列，轉(zhuǎn)錄形成一條長(zhǎng)的mRNA，可編碼產(chǎn)生PI-2A和2BCP3多聚蛋白，而在翻譯到2A氨基酸序列時(shí)以類順式水解酶元件(cis-

38、acting hydrolase element,CHYSEL)發(fā)揮“剪切”作用 ADDIN EN.CITE de Felipe20043253133253325317de Felipe, P.Centre for Biomolecular Sciences, School of Biology, Biomolecular Sciences Building, University of St, Andrews, North Haugh, St, Andrews KY16 9ST, Scotland, UK. pdfst-andrews.ac.uk.Skipping the co-expres

39、sion problem: the new 2A CHYSEL technologyGenet Vaccines TherGenet Vaccines Ther13212004/09/152004Sep 131479-0556 (Print)1479-0556 (Linking)15363111/pubmed/1536311152149710.1186/1479-0556-2-131479-0556-2-13 piiEng HYPERLINK l _ENREF_13 o de Felipe, 2004 #3253 13。但是，與CHYSEL不同，2A分離多聚蛋白的整個(gè)過(guò)程不需要任何蛋白酶參與。

40、這種剪切效應(yīng)由2A高度保守的固有基序(Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro)決定，在翻譯過(guò)程中，2A固有序列高級(jí)結(jié)構(gòu)阻礙C-端甘氨酸、脯氨酸（Gly、Pro）形成肽鍵，上游蛋白釋放出來(lái)，而核糖體能繼續(xù)翻譯下游蛋白 ADDIN EN.CITE Szymczak2004320223202320217Szymczak, A. L.Workman, C. J.Wang, Y.Vignali, K. M.Dilioglou, S.Vanin, E. F.Vignali, D. A.Correction of multi-gene deficiency in vivo usi

41、ng a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vectorNature biotechnologyNature biotechnologyNat Biotechnol589-942252004/04/06Amino Acid SequenceAnimalsCell Line*Genetic VectorsHumansMiceMice, Inbred C57BLMolecular Sequence DataPeptides/chemistry/genetics/*metabolismRetroviridae/*

42、geneticsSequence Homology, Amino Acid2004May1087-0156 (Print)1087-0156 (Linking)15064769/pubmed/1506476910.1038/nbt957nbt957 piieng HYPERLINK l _ENREF_2 o Szymczak, 2004 #3202 2（圖1）。其中，2A氨基酸C-端高度保守序列是高剪切活力的保證。FMDV 基因表達(dá)產(chǎn)物中無(wú)多聚蛋白前體，即FMDV 2A天然剪切效率可達(dá)100%。然而，F(xiàn)MDV 2A元件用于體外多順?lè)醋颖磉_(dá)載體構(gòu)建，表達(dá)產(chǎn)物不能完全剪切，剪切效率約80%90%以

43、上 ADDIN EN.CITE Mattion19963260143260326017Mattion, N. M.Harnish, E. C.Crowley, J. C.Reilly, P. A.Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics, Viral Vaccine Research, Pearl River, New York 10965, USA. nmattion.Foot-and-mouth disease virus 2A protease mediates cleavage in attenuated Sabin 3 poliovirus vect

44、ors engineered for delivery of foreign antigensJ VirolJ Virol8124-770111996/11/01Amino Acid SequenceAntigens, Viral/genetics/*metabolismAphthovirus/*enzymology/geneticsCysteine Endopeptidases/genetics/*metabolismGene Transfer TechniquesGenetic Engineering*Genetic VectorsHeLa CellsHumansMolecular Seq

45、uence DataPoliovirus Vaccine, Oral/*geneticsVaccines, Attenuated/*geneticsViral Envelope Proteins/genetics/*metabolism*Viral Proteins1996Nov0022-538X (Print)0022-538X (Linking)8892938/pubmed/8892938190887eng HYPERLINK l _ENREF_14 o Mattion, 1996 #3260 14。Hasegawa等分別用IRES和FMDV 2A連接GFP、RFP基因構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)

46、果表明IRES下游RFP表達(dá)明顯弱于FMDV 2A介導(dǎo)的RFP表達(dá)，且FMDV 2A剪切效率超過(guò)93%，GFP：RFP蛋白條帶表達(dá)強(qiáng)度約為1:1.2 ADDIN EN.CITE Hasegawa2007319983199319917Hasegawa, K.Cowan, A. B.Nakatsuji, N.Suemori, H.Laboratory of Embryonic Stem Cell Research, Stem Cell Research Center, Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, 53 Kaw

47、aharacho, Shogoin, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Japan.Efficient multicistronic expression of a transgene in human embryonic stem cellsStem cells (Dayton, Ohio)Stem cells (Dayton, Ohio)Stem Cells1707-122572007/03/31AnimalsEmbryonic Stem Cells/cytology/*metabolismFoot-and-Mouth Disease Virus/genetics*Gen

48、e ExpressionHumansMiceTransgenes/*geneticsViral Proteins/genetics2007Jul1066-5099 (Print)1066-5099 (Linking)17395772/pubmed/173957722006-0813 pii10.1634/stemcells.2006-0813eng HYPERLINK l _ENREF_8 o Hasegawa, 2007 #3199 8。本研究中，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)四種表達(dá)產(chǎn)物，GFP-HBx融合蛋白、HA-Sox2融合蛋白、c-Myc蛋白及GFP-HBx-2A-HA-Sox2

49、-2A-c-Myc多聚蛋白。表達(dá)形成的多聚蛋白產(chǎn)物含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于已剪切蛋白，表明FMDV 2A在293T細(xì)胞中也能高效自剪切。而多聚蛋白殘留可能是因?yàn)?A固有序列周?chē)被嵝蛄谢虻鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)影響了其自剪切活性。已有實(shí)驗(yàn)證明，改變Gly-Pro剪切位點(diǎn)下游序列并不影響FMDV 2A剪切效率，而改變上游序列則會(huì)影響其效率 ADDIN EN.CITE de Felipe19993266153266326617de Felipe, P.Martin, V.Cortes, M. L.Ryan, M.Izquierdo, M.Departamento de Bioquimica y Biologia Mo

50、lecular, Universidad Autonoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Spain.Use of the 2A sequence from foot-and-mouth disease virus in the generation of retroviral vectors for gene therapyGene TherGene Ther198-208621999/08/063T3 CellsAcetyltransferases/geneticsAnimalsAntiviral Agents/pharmacologyAphthovir

51、us/*geneticsBlotting, WesternChimeraGanciclovir/pharmacologyGene ExpressionGenetic Therapy/*methods*Genetic VectorsGenome, ViralHumansMicePlasmidsThymidine Kinase/geneticsTumor Cells, Cultured1999Feb0969-7128 (Print)0969-7128 (Linking)10435104/pubmed/1043510410.1038/sj.gt.3300811eng HYPERLINK l _ENR

52、EF_15 o de Felipe, 1999 #3266 15。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，GFP-HBx融合蛋白、HA-Sox2融合蛋白、c-Myc蛋白在表達(dá)量上無(wú)明顯差異，說(shuō)明FMDV 2A并非選擇性剪切，上下游基因順序?qū)ζ浠钚曰緹o(wú)影響。FMDV 2A構(gòu)建多順?lè)醋颖磉_(dá)系統(tǒng)已用于腺病毒（Adenovirus）、逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retroviral）、慢病毒載體（Lentivirus）等，但目前以質(zhì)粒做載體的多順?lè)醋颖磉_(dá)系統(tǒng)研究較少 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_2 o Szymczak, 2004 #3202 2, HYPERLINK

53、 l _ENREF_16 o Fang, 2005 #3272 16。本研究以pEGFPC1做載體，巨細(xì)胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)啟動(dòng)子作為調(diào)控序列，以完全相同的FMDV 2A元件連接HBx、Sox2和c-Myc的編碼序列形成真核共表達(dá)質(zhì)粒載體。以質(zhì)粒作載體避免了病毒載體可能導(dǎo)致的隨機(jī)整合，引起插入誘變或基因功能障礙。已有研究發(fā)現(xiàn)，在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中使用相同的2A序列會(huì)導(dǎo)致部分基因刪除或載體序列重組 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_2 o Szymczak, 2004 #3202 2, HYPERLIN

54、K l _ENREF_13 o de Felipe, 2004 #3253 13。本研究構(gòu)建的pEGFPC-XSM多順?lè)醋颖磉_(dá)載體，經(jīng)酶切瓊脂糖凝膠電泳及核苷酸測(cè)序鑒定，片段大小和目的序列都符合預(yù)期，說(shuō)明pEGFPC-XSM中相同的2A序列并未引起基因刪除或載體重組。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)法人工合成的目的序列避免了傳統(tǒng)PCR多輪擴(kuò)增可能引起堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致基因序列的改變及翻譯蛋白結(jié)構(gòu)影響。然而，F(xiàn)MDV 2A自剪切形成的C-端氨基酸殘基和N-端Pro是否會(huì)影響蛋白生物活性？Varshavsky 等研究表明，N-端連接Pro的蛋白仍然具有生物活性 ADDIN EN.CITE Varshavsky19963

55、274173274327417Varshavsky, A.Division of Biology, California Institute of Technology, Pasadena 91125, USA. varshavskyaThe N-end rule: functions, mysteries, usesProc Natl Acad Sci U S AProc Natl Acad Sci U S A12142-993221996/10/29Acyltransferases/metabolismAmidohydrolases/metabolism*Amino Acid Sequen

56、ceAnimalsEvolution, MolecularFemaleFungal Proteins/chemistry/metabolismGTP-Binding Proteins/chemistry/metabolismHalf-LifeLigases/metabolismMaleMice*Models, Biological*Models, ChemicalProtein ConformationProteins/*metabolismProto-Oncogene Proteins c-mos/metabolismRabbits*Saccharomyces cerevisiae Prot

57、eins*Ubiquitin-Protein Ligases1996Oct 290027-8424 (Print)0027-8424 (Linking)8901547/pubmed/890154737957eng HYPERLINK l _ENREF_17 o Varshavsky, 1996 #3274 17。Furler等證實(shí)與2A自剪切C-端氨基酸殘基形成融合蛋白的上游蛋白，其生物活性不受任何影響 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_3 o de Felipe, 2002 #3244 3, HYPERLINK l _EN

58、REF_18 o Furler, 2001 #3275 18。而且，隨著抗C-端氨基酸殘基抗體的研發(fā)，2A自剪切C-端殘基可作為標(biāo)簽抗體用于檢測(cè)與之相連的上游蛋白。本實(shí)驗(yàn)將目的基因以完全相同的FMDV 2A序列連接在pEGFP-C1真核表達(dá)質(zhì)粒中，首次實(shí)現(xiàn)了HBX、Sox2、c-Myc這三個(gè)肝癌相關(guān)基因高效共表達(dá)，避免了其他方法工作量大，共表達(dá)效率低等缺點(diǎn)。FMDV 2A自剪切介導(dǎo)的新型多基因聯(lián)合表達(dá)策略高效、簡(jiǎn)單、實(shí)用、可靠，為下一步探索共表達(dá)HBX、Sox2、c-Myc蛋白對(duì)細(xì)胞生物學(xué)影響乃至疾病模型的建立奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)： ADDIN EN.REFLIST 1Okita K, Hon

59、g H, Takahashi K, et al. Generation of mouse-induced pluripotent stem cells with plasmid vectors J. Nat Protoc, 2010;5(3):418-28.2Szymczak A L, Workman C J, Wang Y, et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single self-cleaving 2A peptide-based retroviral vector J. Nat Biotechnol, 2

60、004;22(5):589-94.3de Felipe P. Polycistronic viral vectors J. Curr Gene Ther, 2002;2(3):355-78.4Carey B W, Markoulaki S, Hanna J, et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector J. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009;106(1):157-62.5Roskams T. Liver stem cells an