組織制片技術(shù)概述2013

1、組織制片技術(shù)1 組織制片技術(shù)的概述 組織制片技術(shù)的方法 組織制片技術(shù)的基本程序 蘇木精伊紅染色2 組織制片技術(shù)的發(fā)展史 從16世紀(jì)60年代Hook發(fā)明顯微鏡，開始觀察和描述軟木塞中的細(xì)胞至今，組織制片技術(shù)隨著生命科學(xué)的發(fā)展而不斷進(jìn)步。345678 組織制片技術(shù)的發(fā)展史 在19世紀(jì)中期，隨著生物、物理和化學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展，以及顯微鏡和切片機(jī)的逐步完善，組織學(xué)也建立起一整套完整科學(xué)的組織制片技術(shù)。9 組織制片技術(shù)的發(fā)展史 特別是20世紀(jì)50年代以來，由于組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)等新技術(shù)和新儀器的出現(xiàn)，使組織制片技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)期。 101112 利用組織制片技術(shù)的方法所制出的標(biāo)本，

2、顯示了組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)、組織細(xì)胞之間的相互連接及組織細(xì)胞中的某些化學(xué)成分的種類和含量。 提供最直觀的依據(jù)。組織制片是研究醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的一個(gè)最基本的手段。組織制片的意義和目的13組織制片技術(shù)的方法 非組織切片法 組織切片法 14非組織切片法 組織不經(jīng)過切片制成觀察標(biāo)本的方法。非組織切片法的種類 涂片、壓片、鋪片、磨片、消化分離標(biāo)本、活體標(biāo)本、整裝標(biāo)本、血管注射標(biāo)本。15涂片 將所采的血液、骨髓或者脫落細(xì)胞涂抹于載玻片上經(jīng)瑞氏、姬姆薩染色、常規(guī)HE染色。16壓片 先將組織處理成小塊物質(zhì)，然后用化學(xué)藥品進(jìn)行軟化和染色，再用蓋玻片壓封于載玻片上。例如運(yùn)動(dòng)終板和寄生蟲標(biāo)本等。17鋪片：將需要觀察的薄

3、片組織用手工的方法直接鋪于載玻片上，然后經(jīng)過固定、染色等程序制成。例如蛙的腸系膜鋪片，大白鼠的皮下組織鋪片等。18磨片：對(duì)于骨，牙齒等組織，不經(jīng)脫鈣和切片，直接在磨石上用手工磨成大約50微米左右的薄片，然后再進(jìn)行染色封固在載玻片上。19消化分離標(biāo)本：先將組織分離成小塊，然后利用相應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)將細(xì)胞間質(zhì)消化溶解，再用機(jī)械分離的方法，如水的震蕩沖擊力，使小塊組織分離成單個(gè)而又完整的細(xì)胞，經(jīng)染色后涂于載玻片上進(jìn)行封固。例如平滑肌分離標(biāo)本，脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞等。20 活體標(biāo)本 將所采的觀察標(biāo)本加生理鹽水后直接滴于載玻片上在顯微鏡下觀察。21整裝標(biāo)本 將胚胎或小動(dòng)物經(jīng)前期固定后整體封藏于盛滿固定劑的透明

4、容器中 。將發(fā)育至某一階段的雞胚整體取出，經(jīng)固定、染色、脫水、透明后封固于載玻片上的標(biāo)本。22血管注射標(biāo)本 將有色物質(zhì)注射進(jìn)血管，用酸或鹼將血管周圍的組織腐蝕后做成的整體封藏的血管標(biāo)本。 將有色物質(zhì)注射進(jìn)血管后，經(jīng)一系列制片技術(shù)處理后封固于載玻片上供顯微鏡下觀察的標(biāo)本。23組織切片法 利用化學(xué)試劑將組織經(jīng)過一系列的固定、脫水、透明后，再利用石蠟、火棉膠或者明膠等支持物滲透進(jìn)組織內(nèi)部，使組織保持一定的硬度，并包埋成塊，然后依靠切片機(jī)將包埋好的組織塊切成以微米計(jì)的薄片，再根據(jù)需要進(jìn)行各種染色得到的供顯微鏡下觀察的標(biāo)本的方法。 24組織切片法的種類 冰凍切片 石蠟切片、火棉膠切片、明膠切片25 冰凍

5、切片 將所取材的新鮮組織，經(jīng)快速冷凍后再切片，以保持組織內(nèi)所含的脂類或某些酶類的活性。 為觀察急待結(jié)果的組織，如臨床手術(shù)所取組織，也可用這種方法。 26組織切片標(biāo)本制作的基本程序: 1. 取材 2. 固定和固定后處理 3. 脫水 4. 透明 5. 浸蠟與包埋 6. 切片 7. 染色 8. 封固 27 取 材一、動(dòng)物的處死 手法迅速、快捷。 常用方法： 1. 麻醉法：吸入麻醉（乙醚）和注射麻醉（烏拉坦或者戊巴比妥）。 2. 空氣栓塞法：耳靜脈，2030ml空氣 3. 擊頭法：重物猛擊，迅速致死。 4. 頸椎脫臼法：小白鼠 5. 破壞腦和脊髓：金屬探針，蛙 6. 股動(dòng)脈放血：麻醉后放血使大動(dòng)物迅速

6、死亡。2829二、取材的步驟 選擇動(dòng)物選擇取材部位選擇切面方向30 應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)工作的目的和經(jīng)濟(jì)能力選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 肝臟豬肝 卵巢貓 胃狗 運(yùn)動(dòng)終板爬蟲類動(dòng)物 肥大細(xì)胞大、小白鼠的皮下組織 間皮和內(nèi)皮蛙的腸系膜31 根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇取材部位 胰腺胰尾部 脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元頸膨大和腰膨大處 肺 肺門 胃胃底部 32 根據(jù)器官組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選擇取材時(shí)切面的方向 腎臟腎門處作縱切 33頭皮順毛根的方向縱切 34大小腸的環(huán)行皺襞縱切35氣管和食管橫切36三、取材時(shí)應(yīng)注意的問題 ： 組織新鮮：取材動(dòng)作快捷，迅速投入固定液 注意環(huán)境溫度的影響：冰上取材或者冷固定 材料應(yīng)小而?。?不超過1.51.5 0

7、.5cm3 固定液會(huì)造成組織收縮，注意保持組織原有形態(tài) 取材手術(shù)器械鋒利規(guī)范操作，防止組織損害 注意取材環(huán)境和器械干凈，防止組織污染37固定和固定后處理一、固定的目的 ： 固定劑使細(xì)胞的成分凝固，防止組織細(xì)胞自溶和腐敗，保持細(xì)胞生活時(shí)的狀態(tài)。 固定劑的酶染作用使細(xì)胞各成分易于被染料著色。 使組織適度硬化，利于制作薄片。38二、固定的方法： 1. 直接固定：最常用。 2. 蒸汽固定：12鋨酸或者甲醛揮發(fā)的蒸汽，多用于涂片固定。 3.灌注固定：（必須進(jìn)行后固定） 局部灌注固定：肺、腎臟、眼球、肝臟 全身灌注固定：神經(jīng)系統(tǒng)39三、固定的注意事項(xiàng)： 固定劑的用量 一般為組織塊體積的15倍左右 固定劑的

8、配制 現(xiàn)配現(xiàn)用 固定的時(shí)間 受較多因素的影響。一般過夜或者24小時(shí)可達(dá)到固定要求。 40四、常用固定劑單純固定劑 甲醛、乙醇、冰乙酸、升汞、苦味酸、 重鉻酸鉀、丙酮、 鉻酸、四氧化鋨 固定組織時(shí)，只單用某一種試劑尚難對(duì)各種組織成分有較理想的固定作用。因此，常加入其它試劑，根據(jù)對(duì)組織的作用與反應(yīng)，配成混合固定劑，以求得補(bǔ)償某試劑對(duì)組織所致的缺陷。混合固定劑 中性甲醛液、乙醇甲醛液、 Bouin氏液、 苦味酸硫酸液 、Carnoy氏液 、Helly氏液41甲醛(Formeldedhyde)固定濃度： 4%甲醛溶液固定時(shí)間： 12小時(shí)24小時(shí)固定后處理： 流水沖洗12小時(shí)24小時(shí)配制方法： 甲醛10

9、ml + 生理鹽水/蒸溜水90ml特性： 甲醛放置時(shí)間過長易產(chǎn)生白色沉淀“三聚甲醛”，氧化后變?yōu)榧姿幔谷芤鹤優(yōu)樗嵝?，?yán)重時(shí)可影響到細(xì)胞核著色（）。42乙醇(Ethyl alcohol) 固定濃度： 80%-90%乙醇液 固定時(shí)間： 一般4小時(shí)12小時(shí) 固定后處理： 直接入脫水劑 配制方法： 無水乙醇 + 蒸餾水 特性： 乙醇具有固定、脫水等多種功能。組織在高濃度乙醇中放置時(shí)間過長時(shí)，易發(fā)脆。50%以上濃度的乙醇可溶解組織內(nèi)脂肪、類脂體、色素等，注意制片的目的（） 。43中性甲醛液 配制方法： 40%甲醛 120ml 蒸餾水 880ml 磷酸二氫鈉 4g 磷酸氫二鈉 13g固定時(shí)間： 24小時(shí)

10、固定后處理： 流水沖洗24小時(shí)適用組織： 常用固定劑，適用廣泛（）44乙醇甲醛液（AF液） 配制方法： 95%乙醇90ml 40%甲醛10ml 固定時(shí)間：組織塊固定412小時(shí)， 鋪片固定 510分鐘。 固定后處理：直接入脫水劑。 適用組織：肥大細(xì)胞，糖原的固定（） 。 45Bouin氏液配制方法：飽和苦味酸溶液75ml 40%甲醛25ml 冰乙酸5ml固定時(shí)間：1224h固定后處理：70%乙醇脫去苦味酸產(chǎn)生的黃色適用組織：常備固定液，特別適用于固定皮膚和胚胎組織。46五、固定后處理 除去組織中滲入的固定液和一些由固定液產(chǎn)生的沉淀、結(jié)晶和色素的步驟稱為固定后處理。主要有以下六種方法：流水沖洗 ：

11、重鉻酸鉀、甲醛固定的組織，要經(jīng)過流水沖洗24h。酒精脫黃 : 含有苦味酸的固定液固定的組織，必須經(jīng)過70乙醇洗滌脫去黃色。 47碘酒脫汞 ：氯化汞固定的組織有汞結(jié)晶，碘酒浸泡除去。脫甲醛色素 ：甲醛長期固定的組織易產(chǎn)生黑色結(jié)晶， 70乙醇濃氨水溶液除去。 組織漂白 ：鋨酸固定的組織為黑色。漂白液漂白才上色。 脫鈣：含鈣組織骨、牙齒和內(nèi)耳。48脫 水一、定義 用某種能與透明劑互溶的化學(xué)試劑將組織內(nèi)的水分逐漸置換出來的過程。 要點(diǎn)：緩慢、徹底、勿過度。二、常用脫水劑 乙醇、丙酮、正丁醇 49乙醇固定劑 + 脫水劑上行酒精脫水70%（30%）100%，以10遞增。丙酮脫水強(qiáng)，但對(duì)組織的收縮脆化作用也

12、強(qiáng)；主要用于組織的固定兼脫水或切片的快速脫水，以保護(hù)某些特殊染色的標(biāo)本不被褪色。 50透 明一、定義 對(duì)組織的最后脫水處理。 在經(jīng)過前一階段的“脫水”后，還要借某種有機(jī)溶媒將酒精完全置換，使組織與所用的包埋介質(zhì)相溶而浸滲。二、常用透明劑 二甲苯、苯甲酸甲脂、三氯甲烷 、冬青油 51二甲苯 為無色透明的液體，易揮發(fā)，長期接觸對(duì)呼吸道粘膜有較強(qiáng)的刺激作用20分鐘1個(gè)小時(shí)，大塊組織可適當(dāng)延長時(shí)間。作用迅速，浸泡時(shí)間過長易發(fā)生過度收縮和脆化苯甲酸甲脂為無色透明的液體，易揮發(fā)透明作用較二甲苯緩慢，透明時(shí)間12-24小時(shí)。對(duì)組織塊的收縮和脆化的影響較小。苯甲酸甲脂與火棉膠互溶，用于火棉膠切片的透明52 用

13、石蠟做為支撐劑將組織包埋成塊使其硬化的過程 包括浸蠟和包埋兩步一、浸蠟 組織透明后，用石蠟置換組織內(nèi)部的透明劑的過程稱為浸蠟。 組織塊浸蠟一般先經(jīng)過低熔點(diǎn)蠟，再經(jīng)過高熔點(diǎn)蠟。 包 埋 53高溶點(diǎn)蠟也稱硬蠟溶點(diǎn)在60-62硬蠟箱的溫度控制在62-64之間組織浸蠟時(shí)間一般不超過1小時(shí)低溶點(diǎn)蠟也稱軟蠟溶點(diǎn)在48-50 軟蠟箱的溫度控制在5254之間 組織浸蠟時(shí)間一般可達(dá)24小時(shí)54二、包埋 組織浸蠟完成后，接著進(jìn)行組織塊包埋。用于包埋的是硬蠟。包埋在包埋器中完成。 修整蠟塊時(shí)，組織塊應(yīng)距蠟塊邊緣23毫米，以利于連續(xù)切片。 55切 片 石蠟切片 組織切片中應(yīng)用最為廣泛的一種切片就是用石蠟作為包埋劑制作

14、的切片。易于制作大量菲薄的組織標(biāo)本，而且包埋塊可長期保存。56一、儀器及器材57二、切片過程： 調(diào)節(jié)恒溫水箱水溫至47左右； 固定蠟塊于固定器； 快修裝置修整包埋面； 調(diào)節(jié)切片厚度至46微米； 連續(xù)切片； 攤片于水箱內(nèi)； 將蠟片貼于涂好粘片劑的載玻片上； 置于溫箱內(nèi)烤片。58三、切片的注意事項(xiàng) 切片前要將切片機(jī)各部位的螺絲旋緊，否則會(huì)引起切片機(jī)各部件震動(dòng)，造成切片厚薄不勻。 包埋塊的切面和切片刀的傾斜度之間的夾角應(yīng)按切片機(jī)刀臺(tái)上的刻度作適當(dāng)調(diào)整。 恒溫水箱的溫度應(yīng)比包埋蠟的溶點(diǎn)低5-6。59染 色 一、染料 指分子中含有發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)的有機(jī)化合物，有鮮艷的色彩，對(duì)于組織有極強(qiáng)的親和力。 根據(jù)來

15、源可分為兩類： 天然染料（卡紅、蘇木精） 人工合成染料（苦味酸、桔黃G） 根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)分為： 堿性染料(basic dye) 酸性染料(acid dye) 中性(neutrophilia)染料60二、染色的原理 染色就是染料和組織細(xì)胞的分子相互結(jié)合，使組織和細(xì)胞著色。 化學(xué)反應(yīng) 在組織細(xì)胞內(nèi)含有酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)。染色時(shí)酸性物質(zhì)與堿性染料結(jié)合；堿性物質(zhì)與酸性染料結(jié)合。細(xì)胞核中主要由酸性物質(zhì)組成（如核酸等），所以與蘇木精等堿性染料有很強(qiáng)的親和力。細(xì)胞質(zhì)主要由堿性物質(zhì)組成，所以與伊紅等酸性染料有很強(qiáng)的親和力。 能被堿性染料著色的物質(zhì)：嗜堿性(basophilia)； 能被酸性染料著色的物質(zhì)：嗜酸

16、性(acidophilia)。61物理反應(yīng) 細(xì)胞中有許多微小的毛細(xì)小孔，染料的色素離子通過這些小孔滲入細(xì)胞內(nèi)，染料與細(xì)胞沒有牢固的結(jié)合，但分散的色素離子和組織細(xì)胞分子之間通過分子間相互作用使細(xì)胞著色。62三、染色的注意事項(xiàng)：1.溶媒：水和乙醇。2.濃度：低濃度，長時(shí)間。3. 溫度：高，染色效果明顯。4. 適當(dāng)使用媒染劑、促染劑和分化劑。媒染劑：能增強(qiáng)染料對(duì)組織的著色能力，其本身與染料或組織發(fā)生結(jié)合的試劑。如配制各種蘇木精染色液時(shí)添加的鉀明礬、銨明礬等。促染劑：能增強(qiáng)染料對(duì)組織的著色能力，本身并不參與染色反應(yīng)。如伊紅染色液中添加的冰乙酸等。分化劑：能除去組織上和切片上過染的染色液，使染色部位與周

17、圍組織對(duì)比鮮明，著色深淺適當(dāng)；例如低濃度的鹽酸、醋酸、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等。63封 固一、定義 最后一道程序是滴加封固劑，用蓋玻片覆蓋，以利于鏡下觀察。 阻斷組織片與外界的接觸，防止組織片脫片、受潮、干裂、機(jī)械磨損等，延長切片的使用時(shí)間。 這一步驟稱為封固。 封固分為干封和濕封兩種。64干封：切片染色經(jīng)脫水和透明后，用中性樹膠之類無水封固劑封固。數(shù)年不褪色。濕封：切片染色后直接用含甘油、明膠及少量的水和防腐劑組成的封固劑封固。濕封的標(biāo)本保存時(shí)間不長，主要用于某些組織化學(xué)或特殊染色的標(biāo)本。65二、封固時(shí)的注意事項(xiàng)： 封固時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。 封固劑應(yīng)濃度適中。 選擇大小合適的蓋玻片，以蓋好組織后四周約有2毫米左右的間隙為適當(dāng)。 封固劑應(yīng)避光保存 。 66蘇木精(hematoxylin)-伊紅(eosin)（H-E染色）一、脫蠟與入水1二甲苯510分鐘 2次；2無水乙醇5分鐘 2次；395