生物藥物分析與檢測：第七章 雜志與安全檢查

1、標題 第七章 雜志與安全檢查第一節(jié) 藥物的雜質和雜質限量檢查 一、雜質的種類和來源 雜質（impurities）是指： 1. 有毒副作用的物質 2. 本身無毒副作用，但影響藥物的穩(wěn)定性和療效的物質（一）雜質的種類 藥物中的雜質按來源分為 1. 一般雜質：指在自然界中分布廣泛，在多種藥物生產和貯藏過程中容易引入的雜質。如酸、堿、水份、重金屬等。一般雜質其檢查方法收載在中國藥典的附錄中。 2. 特殊雜質：指某一個或某一類藥物的生產或貯藏過程中引入的雜質。如阿司匹林中的游離水楊酸、異煙肼中的游離肼、甾體激素中的其他甾體。特殊雜質檢查方法收載在中國藥典正文各藥品的質量標準中。（二）藥物中雜質的來源1.

2、 生產過程中引入（1）原料、反應中間體及副產物 （2）試劑、溶劑、催化劑類 （3）生產中所用金屬器皿、裝置以及其他 不耐酸、堿的金屬工具所帶來的雜質2. 貯藏過程中產生 水解、氧化、分解、異構化、晶形轉變、聚合、潮解和發(fā)霉等 易發(fā)生水解反應的結構： 酯、內酯、酰胺、鹵代烴、苷類等易發(fā)生氧化反應的結構： 醚、醛、酚羥基、巰基、亞硝基、雙鍵等（三）藥物的純度與化學試劑的純度 藥物的純度考慮雜質的生理作用，藥品只有兩個等級：合格或不合格。 化學試劑有很多等級，如基準試劑、優(yōu)級純（GR）、分析純（AR）、化學純（CP）、色譜純、光譜純。二、雜質的限量檢查(一)雜質限量檢查方法 雜質限量指藥物中允許雜質

3、存在的最大量。通常用百分之幾或百萬分之幾（ppm）來表示。 1. 對照法 取限度量的雜質對照品配制成對照液，與一定量的供試品配制成的供試品溶液，在相同的條件下處理，比較反映結果，以判斷供試品中所含有的雜質是否符合限量規(guī)定。 特點：不需知道雜質的準確含量3. 比較法 測定雜質的絕對含量，如測定吸收度、pH值等，與規(guī)定限量值比較。 特點：準確測定雜質的量，不需對照品 2. 靈敏度法 系指在供試品溶液中加入試劑，在一定反應條件下，不得有正反應出現(xiàn)。 特點：不需對照品 （二）雜質限量的計算供試品量允許雜質存在的最大量雜質限量=供試品量標準溶液濃度標準溶液體積雜質限量=例1，檢查某藥物中的的砷鹽，取標準

4、砷溶液2ml（每1ml相當于1g的As）制備標準砷斑，砷鹽限量為0.0001，應取供試品的量為 A. 0.20g B. 2.0g C0.020g D. 1.0g E. 0.10g已知：c1 g/ml1106 g/mlV2ml L0.0001%一、氯化物檢查法（一）原理：對照法 第二節(jié) 一般雜質檢查（二）檢查方法 除另有規(guī)定外，取各藥品項下規(guī)定量的供試品，加水溶解使成25ml（溶液如顯堿性，可滴加硝酸使成中性），再加稀硝酸10m1；溶液如不澄清，應濾過；置50ml納氏比色管中，加水使成約40m1，搖勻，即得供試溶液。另取各藥品項下規(guī)定量的標準氯化鈉溶液，置50ml納氏比色管中，加稀硝酸10m1，

5、加水使成40m1，搖勻，即得對照浴液。于供試溶液與對照溶液中，分別加入硝酸銀試液1.0m1，用水稀釋使成50m1，搖勻，在暗處放置5分鐘，同置黑色背景上，從比色管上方向下觀察，比較，即得。（三）測定條件 1. 標準NaCl溶液 10gCl/ml，50ml溶液中含5080g的Cl所顯渾濁梯度明顯，相當于標準NaCl溶液58ml。 2. 反應需在硝酸酸性條件下進行，且以50ml供試溶液中含稀硝酸10ml為宜。（1）加速AgCl渾濁的形成； （2）產生較好的乳濁； （3）避免弱酸銀鹽如碳酸銀、磷酸銀以及氧化銀沉淀的形成。 3. 試劑：硝酸銀 5. 避光、暗處放置5分鐘后比濁，因氯化銀見光易分解。 4

6、. 供試液和對照液稀釋后，再加硝酸銀溶液，使生成白色渾濁而不是白色沉淀。 6. 比濁方法：同置于黑色背景上，自上向下觀察。 7. 平行操作，操作溫度一般控制在3040。例2. 中國藥典 （2005年版） 規(guī)定，檢查氯化物雜質時，一般取用標準氯化鈉溶液（10gCl/mL）58mL的原因是（ ）A. 使檢查反應完全B. 藥物中含氯化物的量均在此范圍C. 加速反應D. 所產生的濁度梯度明顯E. 避免干擾 二、硫酸鹽檢查法（一）原理:對照法（二）測定條件 1. 標準K2SO4溶液0.1mg/mL，50mL溶液中含0.10.5mg的所顯渾濁梯度明顯，相當于標準K2SO4溶液15mL。 2. 反應需在鹽酸

7、酸性條件下進行，且以50mL供試溶液中含稀鹽酸2mL為宜。 3. 試劑：氯化鋇 4. 供試液和對照液稀釋后，再加氯化鋇溶液，使生成白色渾濁而不是白色沉淀 5. 比濁方法：同置于黑色背景上，自上向下觀察。 例3：藥物中硫酸鹽檢查時，所用的標準對照液是（ ） A. 標準氯化鋇 B. 標準醋酸鉛溶液 C. 標準硝酸銀溶液 D. 標準硫酸鉀溶液 E. 以上都不對 三、鐵鹽檢查法1. 原理：對照法（一）硫氰酸鹽法ChP（2005）、USP（28）2. 檢查方法 除另有規(guī)定外，取各藥品項下規(guī)定量的供試品，加水溶解使成25ml，移置50ml納氏比色管中，加稀鹽酸4ml與過硫酸銨50mg，用水稀釋使成 35m

8、1后，加30%硫氰酸銨溶液3ml，再加水適量稀釋成50ml，搖勻；如顯色，立即與標準鐵溶液一定量制成的對照溶液（取各藥品項下規(guī)定量的標準鐵溶液，置50ml納氏比色管中，加水使成25ml，加稀鹽酸4ml與過硫酸銨50mg，用水稀釋使成35m1后，加30%硫氰酸銨溶液3ml，再加水適量稀釋成50ml，搖勻）比較，即得。3. 測定條件 （1）用FeNH4(SO4)212H2O（硫酸鐵銨）配制標準鐵貯備液（加入硫酸防止Fe3+的水解），標準鐵溶液臨用前稀釋而成，標準鐵溶液10g Fe3+/ml，50ml溶液中含1050g的Fe3+顯色梯度明顯，一般取標準鐵溶液1.05.0ml。（2）反應需在鹽酸酸性條

9、件下進行，且以50ml供試溶液中含稀鹽酸4ml為宜。 （3）試劑：硫氰酸銨。加過量硫氰酸銨，使反應向正反應方向進行。（4）檢查Fe2+和Fe3+ （5）鐵鹽檢查時，加氧化劑氧化Fe2+為Fe3+。加過硫酸銨可氧化Fe2+為Fe3+，同時可防止光線使硫氰酸鐵還原或分解褪色。硝酸后加熱也可氧化Fe2+為Fe3+。（6）比色方法：同置于白色背景上，自上向下觀察。4. 干擾及排除（1）為了提高靈敏度或供試管與對照管色調不一致時，可用正丁醇提取后，分取正丁醇層比色。 （2）具環(huán)狀結構的有機藥物，需經700800熾灼破壞處理后再依法檢查。 （二）巰基醋酸法 （BP：對照法）本法靈敏度較高，但試劑較貴 例4

10、. 中國藥典（2005年版）規(guī)定，硫氰酸銨法檢查鐵鹽時，加入過硫酸氨的目的是（ ） A. 使藥物中鐵鹽都轉變?yōu)镕e3+ B. 防止光線使硫氰酸鐵還原或分解褪色 C. 使產生的紅色產物顏色更深 D防止干擾 E便于觀察、比較 四、重金屬檢查法（以鉛為代表）中國藥典（2005年版）共收載四法。 2. 測定條件（1）用硝酸鉛配制標準鉛貯備液（加硝酸防止Pb2+水解），標準鉛溶液臨用前稀釋而成，標準硝酸鉛溶液10g Pb2+/ml，適宜比色范圍為35ml溶液中含1020g的Pb2+。（2）本法用2ml pH3.5的醋酸鹽緩沖液控制溶液pH值為33.5。（3）顯色劑：從ChP（1990）開始改用硫代乙酰胺

11、做顯色劑。 （一）第一法硫代乙酰胺法1. 原理：對照法 適用于溶于水、稀酸和乙醇的藥物。 （1）供試品如有色，需經處理后方可檢查。 A. 外消色法：在對照管中加稀焦糖溶液或其他無干擾的有色溶液。 B. 內消色法 C. 改用第四法，微孔濾膜過濾法3. 干擾及排除 （2）若供試品中有微量Fe3+存在，會氧化硫化氫生成單質硫，干擾比色，加入抗壞血酸或鹽酸羥胺（0.51.0g）還原Fe3+為Fe2+，可消除干擾。（3）若供試品為鐵鹽，F(xiàn)e3+在鹽酸中生成HFeCl62-，用乙醚提取除去，剩余微量鐵在氨堿性溶液中，加KCN掩蔽，然后用第三法檢查。（4）若藥物本身能生成不溶性硫化物時，可加入掩蔽劑消除干擾

12、。如ZnSO4中重金屬的檢查，要在堿性下加KCN掩蔽Zn2+后，依第三法檢查。 （二）第二法熾灼殘渣法 適用于含芳環(huán)、雜環(huán)以及不溶于水、稀酸、乙醇及堿的有機藥物。 500600熾灼后的殘渣，經處理后，依一法檢查。 1. 原理 對照法2. 操作方法 含鈉及氟的有機藥物應用鉑坩堝、石英坩堝或硬質玻璃蒸發(fā)皿（因可腐蝕瓷坩堝，帶入大量重金屬）。 （三）第三法硫化鈉法 適用于溶于堿而不溶于稀酸或在稀酸中生成沉淀的藥物。如磺胺類、巴比妥類。 1. 原理：對照法 2. 測定條件 （1）NaOH堿性條件下（2）顯色劑：硫化鈉 （四）第四法微孔濾膜法 適用于含25g重金屬雜質及有色供試液的檢查。 依一法檢查，結

13、果微孔濾膜過濾后比較色斑。 例5. 中國藥典(2005年版)重金屬檢查法中，所使用的顯色劑是（ ） A. 硫化氫試液 B. 硫代乙酰胺試液 C. 硫化鈉試液 D. 氰化鉀試液 E. 硫氰酸銨試液五、砷鹽檢查法 （一）古蔡法 ChP(2005)、BP(2004)1. 原理：對照法 AsH3遇HgBr2試紙生成黃色棕色的砷斑，與2ml標準砷溶液在相同條件下生成的砷斑比較。2. 操作方法（1）標準砷斑用2ml標準砷溶液制備（2）如供試品需經有機破壞，則標準砷溶液應平行操作3. 測定條件 （1）標準砷溶液臨用新配，1gAs/ml。 （2）酸為反應物，酸量應足夠，所以加濃鹽酸5ml。 （3）酸性氯化亞錫

14、及碘化鉀的作用是：A. 還原As5+為As3+，加快反應速度；B. 碘化鉀被氧化生成的I2又可被氯化亞錫還原為I-，I-與反應中生成的Zn2+能形成穩(wěn)定的配位離子，有利于生成砷化氫的反應不斷進行；C. 氯化亞錫與鋅作用，在鋅表面形成鋅錫齊，使氫氣均勻而連續(xù)地發(fā)生。 （4）醋酸鉛棉花的作用是消除鋅粒及供試品中少量硫化物的干擾，醋酸鉛棉花60mg裝管高度6080mm。 （5）鋅粒應無砷（6）砷斑不穩(wěn)定，應立即觀察4. 干擾及排除（1）供試品若為硫化物、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽時，加HNO3，使氧化成硫酸鹽，以除去干擾，如硫代硫酸鈉中砷鹽的檢查。 （2）供試品若為鐵鹽，需先加酸性氯化亞錫試液，將Fe3+

15、還原為Fe2+。如枸櫞酸鐵銨中砷鹽的檢查。（3）具環(huán)狀結構的有機藥物，要先行有機破壞后再進行檢查。 常用的有機破壞方法： 堿破壞法：石灰法、無水碳酸鈉堿融法； 酸破壞法：如葡萄糖中砷鹽的檢查。（4）本法適用于不含Sb或含Sb量小于100g的供試品。 （二）Ag-DDC法 ChP(2000)、USP（24）1. 原理：對照法 砷化氫與Ag-DDC（二乙基二硫代氨基甲酸銀）溶液作用，還原Ag-DDC為紅色膠態(tài)銀，直接比色或于510nm波長處測定吸收度，進行比較。 用有機堿吸收反應產生的HDDC有利于反應的進行。USP（28）用吡啶，ChP（2005）用三乙胺。 本法適用于含Sb量小于500g的供試

16、品，可用于砷鹽的限量檢查和微量砷鹽的含量測定。例6：古蔡氏法中，SnC12的作用有： A. 使As5+As3+ B. 除去H2SC. 除去I2 D. 組成鋅錫齊E. 除去其它雜質 例7：Ag-DDC法檢查砷鹽的原理為：砷化氫與AgDDC吡啶作用，生成的物質是（ ） A. 斑砷B. 銻斑 C. 膠態(tài)砷 D. 三氧化二砷 E. 膠態(tài)銀六、澄清度檢查法 檢查藥物中的微量不溶性雜質，用作注射劑的原料藥一般應作此項檢查。 1. 檢查方法：對照法 2. 濁度標準液的配制 中國藥典規(guī)定用濁度標準液作為澄清度檢查的標準。 反應原理：烏洛托品在偏酸性條件下水解產生甲醛，甲醛與肼縮合生成甲醛腙，不溶于水，形成白色

17、渾濁。 級 號 0.5 1 2 3 4 濁度標準原液（ml） 2.5 5.0 10.0 30.0 50.0水（ml） 97.5 95.0 90.0 70.0 50.0. 100硫酸肼溶液與10烏洛托品溶液等量混合配制濁度標準貯備液 濁度標準原液 濁度標準液（5個級號）3. 判斷：藥典中規(guī)定的“澄清”，系指供試品溶液的澄清度相同于所用溶劑，或未超過0.5號濁度標準液。4. 溶劑：水、酸、堿、有機溶劑有機酸的堿金屬鹽類藥物強調用“新沸過的冷水”七、溶液顏色檢查法 控制藥物中有色雜質限量的方法。 ChP(2005)采用三種方法檢查：目視比色法、分光光度法、色差計法。1. 目視比色法 即與標準比色液比

18、較的方法，全波長范圍定性觀察。觀察方法： 標準比色液的配制 2. 分光光度法 單一波長定量3. 色差計法 本法是通過色差計直接測定供試溶液和標準比色液與水之間的色差值，對其顏色進行定量表述和分析的方法。 測色儀器一般為光電積分型色差計。 八、干燥失重法測定 干燥失重是指藥物在規(guī)定條件下經干燥后所減失的重量，主要是水分，也包括其它揮發(fā)性物質。測定方法有：常溫干燥失重法、干燥劑干燥法、減壓干燥法等。 （一）常壓恒溫干燥法 適用于受熱較穩(wěn)定的藥物。干燥溫度一般為105。 干燥操作：一般在干燥溫度2干燥24hr再稱至恒重。第二次及以后各次稱重均應在規(guī)定條件下繼續(xù)干燥1h后進行。 熾灼殘渣：第二次及以后

19、各次稱重均應在規(guī)定條件下繼續(xù)熾灼.5h后進行。 （二）干燥劑干燥法適用于受熱易分解或揮發(fā)的供試品。干燥劑：硅膠、濃硫酸、P2O5 。（三）減壓干燥法 適用于熔點低，受熱不穩(wěn)定或水分難趕除的藥物。 除另有規(guī)定外，壓力應在2.67kPa（20mmHg）以下。 例. 干燥失重測定的方法有（ ）A熾灼（500600）法B常壓恒溫干澡法C減壓干燥法D干燥劑干燥法E減壓干燥劑干燥法九、易炭化物檢查法 檢查藥物中遇H2SO4易炭化或易被氧化呈色的微量有機雜質。 方法：H2SO4炭化后與對照液比較。 對照液：（1）“溶液顏色檢查”項下的標準比色液；（2）由比色用氯化鈷液，比色用重鉻酸鉀液，比色用硫酸銅液按規(guī)定

20、方法配成的對照液；（3）高錳酸鉀液 檢查不含金屬的有機藥物或揮發(fā)性無機藥物中混入的無機雜質(金屬氧化物或無機鹽類)。1. 原理 樣品炭化后+ H2SO4濕潤700800熾灼至恒重熾灼殘渣（硫酸灰分） 限量一般為0.1%0.2% 十、熾灼殘渣檢查法 3. 注意事項 （1）供試品的取樣量應根據(jù)熾灼殘渣限量和稱量誤差決定。 （3）若殘渣需留作重金屬檢查，則500600熾灼至恒重。 （2）含氟的藥物對瓷坩堝有腐蝕，應采用鉑坩堝。（4）加硫酸處理是使雜質轉化為穩(wěn)定的硫酸鹽，并幫助有機物炭化例. 熾灼殘渣檢查法一般加熱恒重的溫度為（ ） A. 500600 B. 600700 C. 700800 D. 8

21、001000 E. 10001200例. 熾灼殘渣的限量一般為（ ）A. 1B. 0.51C. 0.40.5D. 0.20.3E. 0.10.2第三節(jié) 特殊雜質的檢查方法 一、利用藥物和雜質在物理性質上的差異（一）臭味及揮發(fā)性質的差異 例如：黃凡士林中異性有機物檢查：本品2.0g,直火加熱無辛味。濃過氧化氫中不揮發(fā)性雜質檢查：10ml水浴蒸干殘渣15mg （二）顏色差異 例如：磺胺嘧啶中有色偶氮苯化合物的檢查：取本品2.0g，加NaOH試液10ml，加水25ml，與黃色3號比色液比，不得更深。 （三）溶解行為的差異 例如：吡哌酸中堿中不溶物吡哌酸甲酯（I）和（II）檢查 （四）旋光性質的差異

22、例如：硫酸阿托品中莨菪堿的檢查：本品溶液(50mg/ml)-0.4 （五）對光吸收性質的差異 1. 紫外分光光度法： 例如: 地蒽酚中二羥基蒽醌的檢查 再如：苯丙醇中苯丙酮的檢查：可利用供試液的吸收度比來控制雜質;純品苯丙醇A247nm/A258nm= 0.59; 99.5% 時A247nm/A258nm= 0.79;因此規(guī)定供試品A247nm/A258nm 0.79; 即所含苯丙酮 0.5%.2. 原子吸收分光光度法： 是通過測定藥物中所含待測元素原子蒸氣，吸收發(fā)自光源的該元素特定波長的程度，以求出藥物中待測元素的 含量。 3.紅外分光光度法： 主要用于藥物中無效或低效晶型檢查，如甲苯咪唑中

23、A晶型檢查。4.熒光分析法 例如：利血平中氧化產物檢查利血平(無熒光)3,4-二去氫利血平(I)(黃綠色熒光)3,4,5,6-四去氫利血平(II)(藍色熒光) (六)吸附或分配性的差異 1.薄層色譜法(TLC) (1)雜質對照品法 例如:鹽酸左旋咪唑中檢查2,3-二氫-6-苯基咪唑2,1-b噻唑鹽 硅膠G 苯:甲醇:冰HAC 樣品 對照品。（2）主成分自身對照法2.紙層析法(PC) 常用于極性大的藥物的分離、分析，如地高辛中的有關雜質的檢查。3.高效液相色譜法(HPLC)（1）峰面積歸一化法：L% = Ai /(Ai + A主）100%（2）不加校正因子主成分對照法 對照品液為供試品的稀釋液，

24、進樣測得A主；供試品液進樣測得Ai。其Ai A主即為合格。（3）內標法加校正因子測定供試品中雜質的含量 對照品+內標 進樣求校正因子（f)=(As/Cs)/(AR/CR) 供試品+內標 進樣求AX.AS,則雜質濃度CX = f AX/(AS/CS)4.氣相色譜法(GC) 主要用于藥物中揮發(fā)性的雜質檢查，其檢查方法與HPLC法相同。二、利用藥物和雜質在化學性上的差異（一）酸堿性的差異 1.規(guī)定消耗滴定液體積 例如己酸羥孕酮中正己酐、對甲苯磺酸檢查：(NaOH 0.02mol/L) 取本品0.20g + 中性乙醇 + 溴麝香草酚藍，微藍色0.50ml 2.pH法 例如乙琥胺中2-甲基-2-乙基丁二

25、酸檢查：0.01g/ml pH3.04.5. 3.指示劑法 例如苯巴比妥中苯基丙二酰脲檢查：其水溶液不得使甲基橙顯紅色。（二）氧化還原性的差異 例如：鹽酸嗎啡中阿樸嗎啡的檢查：后者可被碘氧化生成水溶性綠色化 合物。因此ChP規(guī)定：本品50mg +4mlH2O+1dI2 + 5ml乙醚，乙醚層不得顯紅色；水層不得顯綠色。（三）雜質與一定試劑反應產生沉淀 例一、間苯二酚中鄰苯二酚檢查：后者+Pb(Ac)2 白色 ChP規(guī)定：本品0.5g+10mlH2O+2d稀醋酸+0.5ml Pb(Ac)2 ，不得發(fā)生混濁，即為合格。（四）雜質與一定試劑反應產生顏色 例一、鹽酸普萘洛爾中游離-萘酚檢查：利用后者可

26、與重氮鹽發(fā)生重氮化-偶合反應，生成偶氮染料。 ChP規(guī)定：供試品20mg+乙醇與10%NaOH液各2ml+重氮苯 磺酸試液1ml,放置3min；如顯色，與0.3ml -萘酚對照液（20g/ml)比較不得更深。（五）雜質與一定試劑反應產生氣體 ChP附錄中收載氰化物的兩種檢查方法：第一法：改進普魯士藍法 原理：CN- + 酒石酸 HCN Fe(CN)64- Fe4Fe(CN)6第二法：氣體擴散-三硝基苯酚鋰法 原理：HCN擴散進入三硝基苯酚鋰試液，生成異紅紫酸鹽，在 500nm波長處測定吸收度。Fe2+Fe3+ 第四節(jié) 熱源檢查法細菌內毒素檢查細菌內毒素檢查法是判斷供試品中細菌內毒素是否符合規(guī)定

27、。 內毒素(Endotoxin)即革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖，其毒性成分為類脂A。菌體死亡崩解后釋放出來。細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結果為準。無菌檢查 毒性試驗法 急性毒性一、 基本概念二、 實驗設計一、基本概念定義及試驗意義 藥物一次或24小時內一次劑量分兩次給予試驗動物，觀察動物2-10天產生的毒性反應和死亡情況。 短時間內， 快速而劇烈的毒性反應 試驗意義了解新藥急性毒性的強弱 通過多種動物之間毒性反應的對比，為預測對人的毒性反應提供參考。為長期毒性試驗及特殊毒性試驗選擇劑量提供依據(jù)。 結合測定藥物在胃腸的吸收情況。 提示急性中毒死亡機制和其它藥理活性信息。其它，新藥在研制過程中，特別是早期階段多由實驗室小量合成提供。一、基本概念LD50定義50動物死亡統(tǒng)計學劑量相關參數(shù):劑量反應（死亡）曲線的斜率致死所需要的時間毒效應癥狀一、基本概念 表1-1 某些化學物的半數(shù)致死量（LD50）化學物物 種LD50（mg/kg)乙醇小 鼠10,000 氯化鈉小 鼠 4,000硫酸亞鐵大 鼠 1,500硫酸嗎啡大 鼠 900苯巴