[醫(yī)學]第三章 DNA多態(tài)性分析基礎

1、第 三 章 DNA多態(tài)性分析基礎學習目的掌握DNA分子結構掌握DNA的理化性質(zhì)掌握人類基因組的基本特點掌握突變類型及產(chǎn)生機理掌握長度多態(tài)性和序列多態(tài)性的基本概念人類DNA遺傳標記-法醫(yī)物證學應用研究的熱點 由常量檢材到微量檢材 -微量檢材的檢驗 由蛋白質(zhì)水平到DNA水平 -陳舊檢材的檢驗、取材的廣泛性 實現(xiàn)了僅能否定到高概率肯定 -提高了法庭證據(jù)的可靠性人類DNA遺傳標記-特定的座位上出現(xiàn)等位基因 出現(xiàn)在編碼區(qū)或非編碼區(qū) 表現(xiàn)為序列多態(tài)性或長度多態(tài)性 第一節(jié) DNA分子結構與功能一、DNA的分子結構 DNA是由4種核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成的線性多聚體1.DNA的基本結構單位堿 基 A G C

2、 T核 苷核苷酸 脫氧核苷酸=堿基+脫氧核糖+磷酸dNTPdNDPdNMP2.DNA的分子結構一級結構-DNA分子中核苷酸的排列順序 鏈接方式 3,5磷酸二酯鍵連接 戊糖和磷酸構成多聚核苷酸對骨架 含氮堿基突出于骨架上 不對稱末端 5-自由的磷酸，3-游離的羥基 生物學意義 1. 遺傳信息的載體 2. 構成DNA遺傳標記的結構基礎二級結構-兩條DNA單鏈形成的雙螺旋結構 雙螺旋結構的特征 1. 兩條單鏈逆向平行排列， 繞同一中心軸形成雙螺旋 2. 兩條單鏈間以氫鍵連接 堿基互補原則：A=T,C=G * 穩(wěn)定性與G+C含量呈正比 * 嘌呤和嘧啶相等: A+G=C+T 配對原則的意義 1.復制的分

3、子學基礎 遺傳信息傳給子代 2.轉(zhuǎn)錄的分子學基礎 RNA合成的模板 蛋白質(zhì) 3.DNA多態(tài)性分析的分子學基礎 DNA遺傳多態(tài)性 三級結構-超級螺旋結構 結構特征 真核生物DNA三級結構-核小體 140bpDNA雙鏈纏繞組蛋白8聚體 60bp的連接鏈（結合有組蛋白H1） 生物學意義 壓縮DNA分子體積，有利于在細胞 中包裝組蛋白對DNA分子完整性的 保護作用 統(tǒng)計數(shù)據(jù) 人類基因組DNA直線長2m 細胞核直徑5um DNA分子被壓縮了近一萬倍二、DNA的理化性質(zhì) DNA是生物大分子，因此具有高分子物質(zhì)的一般性質(zhì)粘 性 較大 溶液的粘性與溶質(zhì)分子的不對稱性有關兩性電解質(zhì) DNA含有磷酸基團（-）和含

4、氮堿基（+） 等電點低-中性或弱堿性溶液-帶負電 電泳技術進行分離的分子基礎 可以與金屬離子（Na,K,Mg.Mn）結合成鹽 DNA+鹽（乙醇或異丙醇）DNA沉淀析出 可以和堿性蛋白組氨酸結合 使DNA分子更具有穩(wěn)定性吸收紫外線 堿基含有共軛雙鏈 ( 最大吸收波長260nm ) 對DNA樣品進行定量分析 1.DNA的變性概念：在加熱、溶液堿性、有機溶劑、二甲基亞砜、甲酰胺等條件 下，DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA分子的過程。變化：溶液粘度降低,沉降速率增加,浮力密度上升,紫外線吸收增強 增色效應隨溫度上升，DNA溶液的紫外線吸收增強，A260值 DNA對紫外線吸收強度與變性程度成正

5、比 OD260值：雙鏈DNA 單鏈DNA 單核苷酸 融鏈溫度隨溫度上升，一半DNA分子變性時的溫度 (Tm值) Tm值與DNA分子中G/C含量呈線性關系 估計DNA的GC含量 ( G+C)% = (Tm69.3) 2.44 估算引物的Tm 值 Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) Tm值受介質(zhì)中離子強度的影響（ Tm值與退火溫度有關） 在高離子強度溶液中相對穩(wěn)定（1mol/L NaCl）某些因素影響下DNA分子共價鍵斷裂小片段DNA的過程：DNA降解2.DNA的復性概念：當撤除變性因素后，原變性的兩條互補DNA單鏈通過堿基配對又重新締合成為雙鏈結構的過程叫復性。 * 加

6、熱后變性的DNA在溫度降低過程中的復性又稱為退火影響：溫度影響：最適為Tm以下25，過高不易復性；過低堿基錯配 離子強度：足夠鹽濃度中和DNA分子攜帶負電荷利于復性 分子結構：簡單序列的、小分子DNA-易發(fā)現(xiàn)互補序列-復性快 溶液濃度：高濃度DNA溶液比低濃度DNA溶液易復性 * 影響復性過程的主要因素：復性溫度與溶液的離子強度 雜交：在復性的條件下，來源不同、但具有堿基互補的DNA單鏈按堿基 配對原則形成雙鏈DNA分子的過程稱作雜交。 * 局部堿基序列具有同源性的DNA分子也能形成局部雜交產(chǎn)物 雜交技術：在復性條件下，探針與靶DNA單鏈形成雜交雙鏈 用以分析兩核酸分子間的堿基互補程度 探 針

7、：標記有示蹤物的寡核苷酸片段 第二節(jié) 人 類 基 因 組基因組概念 廣義概念：一個生物體的所有基因或遺傳物質(zhì) 狹義概念：一大組基因、一個染色體或幾個染色體的基因 * 基因組包含基因序列(20-30%) + 非基因序列(70-80%)基因組構成 核 基 因 組：單倍體細胞內(nèi)的全部DNA分子，3109 bp 體細胞22對常染色體和1對性染色體 性細胞22條常染色體和1條型染色體 * 每個細胞含相同的基因組拷貝（特殊除外） * 平均每個細胞含有610pg的DNA 線粒體基因組：線粒體內(nèi)包含的全部DNA分子，16569bp * 每個細胞平均有800個線粒體 * 每個線粒體含有10個DNA拷貝 一、人類

8、核基因組DNA1.基因與基因有關序列基因組成：包括合成有功能的多肽鏈或RNA所必需的全部序列真核生物-斷裂基因基因中編碼序列被若干個插入序列分隔的不連續(xù)的鑲嵌結構 編碼序列-外顯子( n ) 10%50% 插入序列-內(nèi)含子(n-1) 50%90% 決定基因長度 編 碼 率-編碼序列長度占整個基因序列的比例 外顯子 內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄：模板DNA 初級RNA 成熟RNA 剪接方式：特定外顯子+不同外顯子-表達多種產(chǎn)物 表現(xiàn)為外顯子/或 內(nèi)含子-表現(xiàn)多種功能 由同一DNA序列可以得到不同的mRNA，從而編碼多種 具有部分重疊序列的蛋白質(zhì)的基因稱為重疊基因GT AG GT AG基因分類 結構基因：合成結構蛋

9、白、催化生化反應的酶 調(diào)節(jié)基因：阻遏蛋白或激活蛋白，控制基因活性 既可以轉(zhuǎn)錄成RNA，又可以翻譯成蛋白質(zhì) rRNA基因：產(chǎn)物是核糖體的核糖體RNA tRNA基因：產(chǎn)物是轉(zhuǎn)移RNA 只轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應RNA，而不翻譯成蛋白質(zhì)相關序列 前導序列和尾隨序列-能被轉(zhuǎn)錄，但不被翻譯 啟 動 子：RNA聚合酶與DNA結合起始部位 位置：基因轉(zhuǎn)錄起點上游（5-1kb) 作用：能與RNA酶結合，調(diào)控基因表達 增 強 子：調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物與DNA結合的部位 位置：在基因的任何位置。 作用：促進轉(zhuǎn)錄活性，增強啟動子 2.基因外DNA 功能不清，多拷貝或低拷貝形式；30%串聯(lián)重復3.重復序列概念：在基因組中反復出現(xiàn)，在基因

10、組中含有一個以上序列相 同的拷貝稱為重復序列-基因外的重復序列較少受選擇壓力的限制，在個體間具有變異性，是形成DNA多態(tài)性基礎分類：反向重復序列-兩個序列相同的拷貝在DNA上呈反向排列 重復序列間有間隔 位于基因調(diào)控區(qū)內(nèi) 重復序列間無間隔 與基因的轉(zhuǎn)錄、復制有關 串聯(lián)重復序列-相對恒定的序列為重復單位，首尾相接 大衛(wèi)星DNA（macrosatellite DNA） 主要在在非編碼區(qū) 小衛(wèi)星DNA ( minisatellite DNA ) 與染色體折疊壓縮 微衛(wèi)星DNA (microsatellite DNA） 和染色體配對有關 散在重復序列-相同序列的重復單位散在分布 短散布元件 500bp

11、 Alu序列 序列長平均250bp，含有Alu I酶切位點（AGCT） 同源性高達80%，但具有種屬特異性 人類Alu序列長300bp（130bp+31bp+130bp） 長散布元件 6-7kb Kpn序列 約6500bp 衛(wèi)星DNA 發(fā)現(xiàn)：DNA主帶以外有多個小的衛(wèi)星帶分類：大衛(wèi)星-根據(jù)浮力密度不同 1.687 衛(wèi)星DNA（25-48bp） 1.693 衛(wèi)星DNA（5bp-ATTCC-） 1.697 衛(wèi)星DNA（5bp-ATTCC-） 1.700 衛(wèi)星DNA（隱蔽的衛(wèi)星DNA) 衛(wèi)星DNA 重復單位171bp 靈長類特有 衛(wèi)星DNA 重復單位68bp 富含GC 位于多個染色體的著絲粒與異染色

12、質(zhì)成分：GC含量少于主帶中的DNA特征：DNA呈串聯(lián)重復形式 各類型家族成員序列G/C含量近似 具有相同的浮力密度 但是重復序列特征有明顯差異 所有串聯(lián)重復DNA序列都稱為-衛(wèi)星DNA 根據(jù)重復序列長度和序列特征分類 小衛(wèi)星DNA 微衛(wèi)星DNA ( minisatellite DNA ) (microsatellite DNA） 重復單位 15bp-30bp 2bp-6bp 重復次數(shù) 數(shù)次至數(shù)百次 10bp-60次 序列總長 100bp-20kd 300bp 序列特征 核心序列 單拷貝 多態(tài)原因 VNTR STR 形成機制 不等交換，重組 復制滑動 主要分布 近端粒處，著絲點 內(nèi)含子、間隔DN

13、A 有特定的基因座定位 有特定的基因座定位 核心序列-富含G/C或A/T的保守序列 不同小衛(wèi)星高度同源性-DNA指紋技術4.假 基 因：與正常功能基因在核苷酸序列上相似，但不能轉(zhuǎn)錄或 轉(zhuǎn)錄后生成無功能基因產(chǎn)物的DNA序列。 突變：復制-失去調(diào)控；轉(zhuǎn)錄-拼接信號；翻譯-終止信號 其他：丟失5或3端部分而失去活性基因片段5.多基因家族：一組具有功能相似、來源相同、堿基序列相同或部分相 同的基因 產(chǎn)物：編碼 R N A snRNA, tRNA, rRNA 編碼蛋白質(zhì) 組蛋白、珠蛋白、生長激素 位置：同一個染色體上或不同染色體上 分類：多 基 因 家 族（rRNA基因家族） 散在基因家族（珠蛋白基因家

14、族） 超基因家族：是一組由多基因家族和單基因組成的更大的基因家族。 各成員（免疫球蛋白、組織相容性復合體）6.轉(zhuǎn)座子：DNA分子內(nèi)部或分子間可以移動的DNA片段 組成：由座位酶和轉(zhuǎn)座子兩末端的反向重復序列組成 特點：保留原位的序列，新合成復本的插入，可以遺傳 部位：不固定（內(nèi)含子、基因側翼序列、插入編碼區(qū) ）轉(zhuǎn)座子的作用示意圖7.端粒 線性形式基因組DNA的末端都有一個特殊結構，是一段DNA和蛋白質(zhì)形成的復合結構特點：僅存在于真核生物，富含G的寡核苷酸序列 多個串聯(lián)重復序列組成，重復單位為 5bp-8bp（-TTAGGG-） 重復次數(shù)為800-3000次，總長度515kb作用：在端粒酶參與下，

15、封閉染色體末端，維持染色體穩(wěn)定性的作用 DNA復制：由于受DNA聚合酶特性限制，子代DNA鏈的最后 一個片斷去除引物后，無法填補空隙，易造成子代 DNA鏈的縮短。 端 粒 酶：由RNA與蛋白質(zhì)組合成的酶，以自身攜帶的RNA為模板 合成互補鏈，直接從末端起始DNA的合成意義：端粒長度與年齡、細胞分裂次數(shù)有關，存在性別、種族和組織差DNA甲基化DNA甲基化是指在甲基化酶的作用下，將一個甲基添加在DNA分子的堿基上。DNA甲基化修飾決定基因表達的模式，即決定從親代到子代可遺傳的基因表達狀態(tài)。DNA甲基化的部位通常在CpG島的胞嘧啶 胞嘧啶甲基化反應 DNMT1S-腺苷甲硫氨酸SAM胞嘧啶5-甲基胞嘧

16、啶在結構基因的調(diào)控區(qū)段，CpG二聯(lián)核苷常常以成簇串聯(lián)的形式排列。結構基因5端附近富含CpG二聯(lián)核苷的區(qū)域稱為CpG島(CpG islands)。CpG島是CG二核苷酸含量大于50%的區(qū)域。CpG島通常分布在基因的啟動子區(qū)域?；蚪M印跡：人類基因組中一些基因只表達一種親源的基因版本，這種現(xiàn)象稱為基因組印跡兩個親本等位基因的差異性甲基化型造成了一個親本等位基因的沉默，另一個親本等位基因保持等位基因活性(monoallelic activity)。DNA甲基化在法醫(yī)學可能應用 1 親子鑒定：從母血中檢測胎兒的DNA，應用基因組印記 確定親代的必需基因。 2 混合斑分析 3 個人識別：年齡判斷，甲基化

17、標記和SNP標記的復合分析，同卵雙生子的鑒定。 4 組織來源鑒定 第三節(jié) 基 因 突 變 概念：基因堿基組成的改變，又稱為點突變。 野生型-自然界存在的，無DNA分子改變的個體表型 突變型-突變后的表型 方式：堿基的替換 轉(zhuǎn)換-同一類型堿基的替換 顛換-不同類型堿基的替換 插入和缺失 在DNA序列中插入或缺失一個或幾個堿基 后果：編 碼 區(qū)-堿基突變導致相應密碼子的改變 同義突變 - 氨基酸不變 中性突變 - 氨基酸改變，不影響蛋白質(zhì)功能 錯義突變 - 氨基酸改變，影響/不影響功能* 無義突變 - 終止密碼子形成，產(chǎn)物無功能 移碼突變 - 閱讀框改變，肽鏈延長或縮短 非編碼區(qū)-沒有表達產(chǎn)物，多

18、不構成實質(zhì)性影響 人類非編碼區(qū)的序列變異遠比編碼區(qū)多第四節(jié) DNA 多 態(tài) 性DNA 多 態(tài) 性 基因組DNA中,由不同堿基結構的等位基因所形成的多態(tài)性產(chǎn)生機制點 突 變-序列多態(tài)性 插入或缺失-長度多態(tài)性存在部位編 碼 區(qū) 非編碼區(qū)DNA遺傳標記 是特定的堿基序列 遵循孟德爾遺傳規(guī)律 具有終身不變的遺傳特征一、DNA長度多態(tài)性同一基因座上各等位基因之間DNA片段長度差異構成的多態(tài)性1.可變數(shù)目串聯(lián)重復序列廣義指小衛(wèi)星和微衛(wèi)星（ STR ） ，狹義指小衛(wèi)星小衛(wèi)星(variable number of tandem repeats, VNTR）特征：重復單位9bp-24bp、重復數(shù)次至數(shù)百次、

19、總長0.1-2.0kd，有特定的染色體定位多態(tài)性結構基礎-不同個體所含串聯(lián)重復序列拷貝的差異 不同的個體，不同等位基因的串聯(lián)次數(shù)不同， 形成不等長度的等位基因 同一基因座，每個等位基因之間的長度差異 剛好是重復單位的整倍數(shù) 不同基因座，小衛(wèi)星VNTR序列間具有同源性核心序列 可以發(fā)生相互雜交 *多基因座DNA探針RFLP分析的理論基礎 高度多態(tài)性個人識別的重要依據(jù) 某基因座雜合度高100% 例：重復單位 17bp 重復次數(shù) 70-450次 片段長度 1190-7650bp 等位基因數(shù) = 381 基 因 型數(shù) = 72771個 H=0.9974 DP=0.99999992 VNTR等位基因頻率

20、0.1%-10% DNA指紋圖核心序列-DNA指紋技術的理論基礎發(fā)現(xiàn)：1985年Jeffreys報告 人肌紅蛋白基因第一內(nèi)含子 重復單位33個堿基，重復4次 核心序列16個堿基探針：篩選出8個陽性克隆 核心序列-GGAGGTGGGCAGGAXG- 確定探針:33.6 AGGGCTGGAGG 33.15 AGGTGGGCAGGTGG分析：DNA酶切片段（HinfI） 電泳分析 轉(zhuǎn)移印跡 探針雜交 RFLP圖譜（20條左右的片段） *偶合幾率10-11-10-122.短串聯(lián)重復序列（short tandem repeats, STR)特征：重復單位2bp-6bp 不宜用RFLP方法分析 實質(zhì)也是一

21、種VNTR PCR擴增沒有優(yōu)勢擴增 重復次數(shù)5次-60次，總序列長度400bp 微衛(wèi)星DNA 適用于降解DNA的鑒定 最常見是二核苷酸，法醫(yī)常用的是四核苷酸重復 必須用高分辨率的電泳方法分離 分布廣泛，人類基因組的5%，估計20-50萬個 檢出8000多個，遺傳標記數(shù)目多 絕大多數(shù)分布非編碼區(qū)，極少三核苷酸位于編碼區(qū) 微衛(wèi)星大多數(shù)是二核苷酸，但在法醫(yī)物證的鑒定中應用的大多數(shù)是四核苷酸，因為其STR重復PCR擴增結果更穩(wěn)定，產(chǎn)生的附加帶、影子帶少，容易分型，所以在法醫(yī)物證學上應用最為廣泛。 三核苷酸重復長度的變異可導致疾病，脆性X綜合征、X連鎖脊髓和延髓性萎縮和肌強直性營養(yǎng)不良癥等遺傳疾病的發(fā)生

22、是三核苷酸串聯(lián)重復的拷貝數(shù)大大增加所致。 類型：根據(jù)重復單位的堿基組成分為以下三類： 重復單位長度 重復單位組成 簡單重復序列 基本一致 基本一致 復合重復序列 基本一致 組成不同 復雜重復序列 長度不同 組成不同篩選 基本條件： 多態(tài)性程度高 、擴增穩(wěn)定性好 1.等位基因長度0.8，個人識別能力0.9 5.基因頻率分布比較平均 6.PCR擴增穩(wěn)定、突變率低復雜重復序列命名 基 因 座 結構基因內(nèi)含子中STR基因座 -按STR序列的GenBank注冊基因名稱命名 例：HumTH01 酪氨酸羥化酶基因第1內(nèi)含子 非編碼區(qū)/定位不清的STR基因座 -Genome Database原始序號 例：D3

23、S1359 DNA 3號染色體;單拷貝;1359號 等位基因 不同實驗室檢驗結果的可比性和重復性 按照重復單位次數(shù)命名 5-GGTCATCATCATGG-3 “TCA TCA TCA” “CAT CAT CAT” * 從離5端最近的核苷酸開始定義 含有不完全重復的等位基因 （完整重復等位基因數(shù)）（不完全堿基數(shù)） 例:TH01基因座9.3基因 ATG4ATGAATG5 3.長度多態(tài)性形成機制（1）復制滑動類型：正向鏈3-5的滑動錯配 在正向鏈中插入1個重復單位 反向鏈3-5的滑動錯配 正向復制鏈中缺失1個重復單位特點：1.多發(fā)生在相似堿基結構區(qū)域，更傾向較短重復序列 是STR多態(tài)性的主要原因 2

24、.插入比缺失多見，衛(wèi)星序列有自我加速復制、延長 該序列，可以減輕編碼區(qū)承受的選擇壓力 3.滑動錯配是DNA半保留復制的關系 只要出現(xiàn)不對稱環(huán)，多為滑動錯配（2）同源重組概念：發(fā)生在聯(lián)會復合體內(nèi)的，同源染色體的兩條非姊妹染 色單體之間的遺傳物質(zhì)交換 條件 1.交換區(qū)域的核苷酸序列必須相同或相似 2.交換鏈間堿基互補，重組發(fā)生在同一基因座 3.DNA序列的交換在重組酶催化下進行機制：不等交換-交換雙方地位平等，但數(shù)量不一定相等證據(jù)：核心序列G/C含量與堿基序列和大腸桿菌序列類似 序列是原核生物基因組DNA重組的信號 以VNTR的核心序列為探針與減數(shù)分裂中期的人染色體雜交，發(fā)現(xiàn)信號集中在染色體著絲點及附近意義：法醫(yī)學-形成DNA片段長度多態(tài)性 遺傳學-非編碼區(qū)的小衛(wèi)星高度遺傳變異減輕編碼區(qū)選擇壓力，維持物種穩(wěn)定交叉上方染色體位置不變，下方繞交聯(lián)橋轉(zhuǎn)180度Holliday結構（3）基因的結構重排概念：通過基因的轉(zhuǎn)座，DNA的斷裂錯接使正?；蝽樞虬l(fā) 生改變機制：結構重排是一種DNA雙鏈斷裂的修復過程。 DNA斷裂（5端的重復序列內(nèi)）-形成兩個游離末 修復過程中：末端的因擺動或錯位基因轉(zhuǎn)移移動部位：基因內(nèi)重排-單鏈末端的堿基率先復復性 然后合成空缺的堿基，形成插入重復單位 TCC TCC TCC TCC TCC TCC TCC TCC AGG AGG