基因功能分析的基本策略

1、第七章第七章 基因功能分析的基本策略基因功能分析的基本策略 基因功能是在細(xì)胞組成的多層次的復(fù)雜生命體中實現(xiàn)的，因此對基因功能的研究將極大程度上依賴于對模式生物的研究。 基因敲除技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物模型、基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型、RNA干涉技術(shù)的發(fā)展，成為基因功能分析的有力工具。第一節(jié)第一節(jié) 利用轉(zhuǎn)基因模型研究基因的功能利用轉(zhuǎn)基因模型研究基因的功能 利用動物模型研究未知基因的功能，就是將某一基因從動物基因組中剔除或?qū)⑼庠椿蛞雱游锘蚪M，產(chǎn)生在遺傳上經(jīng)過基因工程修飾（改造）的動物，實現(xiàn)在整體動物、細(xì)胞或分子水平上認(rèn)識基因的功能或人類疾病發(fā)生的分子機制。轉(zhuǎn)基因技術(shù)概念轉(zhuǎn)基因技術(shù)概念 轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指

2、將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞或胚胎干細(xì)胞中，通過外源基因與細(xì)胞染色體DNA之間隨機重組的發(fā)生而將外源基因插入到受體細(xì)胞染色體DNA上的過程。 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以制備轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因生物或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞胞。通常所指的轉(zhuǎn)基因生物是指將外源基因?qū)胧芫鸭?xì)胞或胚胎干細(xì)胞中，使外源基因通過隨機重組插入到受體細(xì)胞的染色體上，并隨細(xì)胞的分裂而將外源基因遺傳給后代。一、轉(zhuǎn)基因動物一、轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因動物是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因的動物。 轉(zhuǎn)基因過程：轉(zhuǎn)基因過程：1、轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建；2、將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞；3、將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮內(nèi)；4、對轉(zhuǎn)基因動

3、物進行鑒定。轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)基因報告基因增強子啟動子受精全能性細(xì)胞注射 植入假孕小鼠后代Southern blotRT-PCRWestern blot轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用：1、通過轉(zhuǎn)基因動物來研究特定基因在組織中特異表達或表達的時相；2、在活體內(nèi)研究或發(fā)現(xiàn)基因的新功能；3、可用于只在胚胎期才表達的基因結(jié)構(gòu)和功能研究；4、建立研究外源基因表達、調(diào)控的動物模型；5、遺傳性疾病的研究；6、建立人類疾病的動物模型，為人類的基因治療提供依據(jù)；7、動物新品種的培育；8、基因工程產(chǎn)品的制備；1、不能將外源基因定向地插入受精卵細(xì)胞染色體的特定部位；2、外源基因隨機整合可能引起插入突變

4、，破壞宿主基因組功能；3、外源基因隨機整合在宿主染色體上的拷貝數(shù)不同，可能出現(xiàn)不同表現(xiàn)型；4、整合的外源基因遺傳丟失而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動物癥狀的不穩(wěn)定遺傳。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的問題轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的問題二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞二、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞是一種最常用的細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)基因模型，外源基因通過轉(zhuǎn)基因過程插入到細(xì)胞染色體中，使外源基因可以作為細(xì)胞染色體的一部分得以在細(xì)胞中穩(wěn)定表達。 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞基本過程：1、真核重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建：將外源基因和真核表達質(zhì)粒連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒；2、在原核細(xì)胞中復(fù)制擴增和克隆化真核重組表達質(zhì)粒；3、將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞；4、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆化篩選、保存；5、

5、轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達目的蛋白、提取、鑒定。第二節(jié)第二節(jié) 基因敲除技術(shù)基因敲除技術(shù) 基因敲除技術(shù)是指通過DNA同源重組定向?qū)⑼庠椿虿迦胨拗骷?xì)胞染色體DNA，從而使特定基因在細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)失活的過程。 如果通過同源重組定向地在活體內(nèi)剔除特定基因的動物稱為基因敲除動物。目前基因敲除小鼠是應(yīng)用最廣泛的動物模型之一。基因敲除技術(shù)的基本過程：1、打靶載體的構(gòu)建：、打靶載體的構(gòu)建：一般包括三次DNA體外重組、將待剔除基因作為目的基因克隆到特定克隆載體上；、將帶有目的基因的重組載體作為克隆載體，利用合適的內(nèi)切酶將目的基因片段的大部分切除，使目的基因活性足以喪失，然后以此線性載體作為克隆載體，將一個陽性篩選標(biāo)志基因

6、插入連接到目的基因的中段；例如；Neor基因：使細(xì)胞具有抵抗新霉素（G418）能力。、在目的基因外側(cè)線性化重組載體，并將一個陰性篩選標(biāo)志基因克隆到此。例如：單純庖疹病毒（HSV）的胸苷激酶的編碼基因為HSV-tk。當(dāng)它在細(xì)胞內(nèi)合成出胸苷激酶時，可以分解細(xì)胞培養(yǎng)液中加入的單核苷酸類似物而產(chǎn)生有毒的分解物使細(xì)胞死亡。 這樣打靶載體包含了部分待剔除的基因片段、陽性篩選標(biāo)志基因、陰性篩選標(biāo)志基因。 在特定基因剔除時，利用打靶載體上留下的部分待剔除的基因片段作為基因組上相同基因的同源臂，當(dāng)打靶載體與細(xì)胞基因組的同源基因發(fā)生同源重組時，打靶載體上的失活基因替代基因組上的基因，同時利用插入在基因同源臂之間的

7、陽性、陰性標(biāo)志基因進行鑒定。2、將打靶載體導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞中；胚胎干細(xì)胞通常取自小鼠胚胎早期的內(nèi)細(xì)胞團，該細(xì)胞能在體外培養(yǎng)，并保留發(fā)育的全能性。3、用陽性篩選標(biāo)志和陰性篩選標(biāo)志對轉(zhuǎn)染的胚胎干細(xì)胞進行篩選。4、將發(fā)生同源重組的胚胎干細(xì)胞導(dǎo)入小鼠胚泡中，然后將胚泡植入假孕小鼠子宮中；5、篩選嵌合體小鼠。通常同源重組一般只發(fā)在一條染色體上，可以用Neor基因作探針，通過Southern blot鑒定。6、雜交育種，獲得基因剔除的純合體小鼠待剔除基因克隆克隆載體重組載體切割基因使待剔除基因失去活性陽性標(biāo)記基因Neor連接HSV-tk打靶載體打靶載體打靶載體內(nèi)切酶消化線性化打靶載體轉(zhuǎn)染基因組同源重組同

8、源重組的胚胎干細(xì)胞胚泡植入假孕小鼠雜合子小鼠正常小鼠雜合子小鼠交配雜合子小鼠兄妹交配純合子小鼠（基因剔除）第三節(jié)第三節(jié) 利用基因沉默技術(shù)對基因功能進行分析利用基因沉默技術(shù)對基因功能進行分析 結(jié)構(gòu)基因功能最終是通過其表達的蛋白質(zhì)來體現(xiàn)，因此結(jié)構(gòu)基因功能的研究可以在RNA水平上進行，通過干預(yù)蛋白質(zhì)的翻譯過程或減少蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來分析基因的功能。目前在RNA水平上分析基因功能的方法主要有兩類：一類是反義一類是反義RNARNA技術(shù)封閉技術(shù)封閉mRNAmRNA的功的功能；另一類是能；另一類是RNARNA干涉技術(shù)使基因處于沉默狀態(tài)。干涉技術(shù)使基因處于沉默狀態(tài)。一、反義一、反義RNA技術(shù)技術(shù)反義RNA技術(shù)是根

9、據(jù)RNA序列人工合成的互補RNA。根據(jù)反義RNA的作用機制可將其分為三類：1、反義RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白體結(jié)合位點或與靶mRNA直接結(jié)合形成雙鏈RNA，從而直接抑制mRNA的翻譯或被RNA酶識別降解。2、反義RNA是與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象的變化，從而抑制其翻譯。3、反義RNA是作用于基因的啟動子，直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。二、RNA干涉技術(shù) 最早是由Andrew Fire 和Craig Mellocai 兩人在1998年2月一次實驗中，將雙鏈RNA注射給線蟲，發(fā)現(xiàn)其可以引起一種高效、特異的基因抑制效應(yīng)，他們將這種由雙鏈RNA引起的特異性基因抑制現(xiàn)象稱為RNA干

10、涉。 RNA干涉技術(shù)是指由短的雙鏈?zhǔn)侵赣啥痰碾p鏈RNA誘導(dǎo)的同源誘導(dǎo)的同源RNA降解的過程，可使基因的表達受到抑制。降解的過程，可使基因的表達受到抑制。它是在基因的轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達的一種研究基因功能的方法。 RNA干涉的機制：干涉的機制：在植物、動物和人的細(xì)胞內(nèi)存在著無活性或低活性的被稱為Dicer的由核酸內(nèi)切酶和解旋酶核酸內(nèi)切酶和解旋酶等組成的酶復(fù)合體酶復(fù)合體。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)異常雙鏈RNA時，如病毒RNA，可以激活Dicer，被激活的Dicer識別并將其切割成短的雙鏈RNA，同時生成的短的雙鏈RNA又可以進一步激活Dicer，并與之結(jié)合，形成的復(fù)合物稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物。該復(fù)合物通過Dicer中的解旋酶將短的雙鏈RNA變成互補單鏈RNA，此單鏈RNA即可識別并結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)與其互補的靶RNA分子上，并通過Dicer中的核酸內(nèi)切酶將靶RNA切割，使其失去功能。RNA干涉可以被認(rèn)為是機體的一種防御機制。dsRNADicer形成復(fù)合物靶RNARNA干涉技術(shù)的基本過程干涉技術(shù)的基本過程1、確定干涉靶點 選擇目標(biāo)基因是進行RNA干涉的第一步，根據(jù)靶基因序列，確定干涉的具體靶點。 一般作為干涉的靶點序列應(yīng)具備：、目標(biāo)RNA上被干涉的靶點應(yīng)盡量避開蛋白結(jié)合位點被干涉的靶序列一般應(yīng)具有AA（N19）TT或AA