固相膜免疫分析技術(shù)(2)

1、臨床免疫學檢驗技術(shù)第十一章 固相膜免疫分析技術(shù)徐廣賢目 錄第一節(jié) 概 述第二節(jié) 免疫層析試驗第三節(jié) 免疫滲濾試驗第四節(jié) 斑點酶免疫吸附試驗第五節(jié) 免疫印跡試驗第六節(jié) 影響固相膜免疫試驗的主要因素第七節(jié) 固相膜免疫分析技術(shù)的臨床應用第一節(jié) 概 述重點提示固相膜免疫分析技術(shù)常用的固相膜和標志物固相膜的技術(shù)要求固相膜免疫分析技術(shù)是以微孔膜為固相載體，包被抗原或抗體，參加待測樣本后，經(jīng)微孔膜滲濾作用或毛細管虹吸作用使樣本中的抗體或抗原與膜上包被的抗原或抗體結(jié)合，再通過膠體金標記物或酶標記物與之反響形成肉眼可見的顯色結(jié)果。常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍nylon膜硝酸纖維素nitr

2、ocell-ulose，NC)膜NC膜或尼龍膜是常用的固相膜常用的標志物酶和有色微粒子彩色膠乳熒光素膠體金和膠體硒等其中以膠體金和熒光素最為常用 固相膜的技術(shù)要求孔徑：穿流法的膜一般選擇左右；橫流法的膜可選擇5m10m。流速：孔徑和分布結(jié)構(gòu)影響膜的流動速率，孔徑大，流速快。蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強，以g/cm2表示。均一性：優(yōu)質(zhì)的膜具有良好的均一性。第二節(jié) 免疫層析試驗重點提示原理常用的免疫層析試驗膠體金免疫層析試驗的測定模式熒光免疫層析試驗技術(shù)要點原 理免疫層析試驗是以硝酸纖維素膜為固相載體，樣品溶液借助毛細作用在層析條上泳動，同時樣品中的待測物與層析材料上待測物的受體抗原或抗體發(fā)生高特異性

3、、高親和性的免疫反響，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域檢測帶，通過檢測標記物膠體金顆?；驘晒馑氐?，在短時間內(nèi)20min)聚集而得到直觀的試驗結(jié)果顯色。常用的免疫層析試驗根據(jù)標記物的不同，免疫層析試驗可以分為：膠體金免疫層析試驗：標記物為膠體金，多用于檢測抗原，但亦可用于檢測抗體。熒光免疫層析試驗：標記物為熒光素，標記相應的抗體或抗原，然后利用熒光檢測儀檢測試劑條上富集的反響結(jié)合物激發(fā)產(chǎn)生的熒光強度，從而對標記物濃度進行檢測的一種方法。膠體金免疫層析試驗的測定模式雙抗體夾心法檢測大分子抗原競爭法檢測小分子抗原間接法雙抗體夾心法檢測大分子抗原G處為金標特異性抗體，T處為包被特異

4、性抗體，C處為包被抗免疫球蛋白抗體，B處為吸水紙。測試時A端滴加待測標本，通過層析作用，待測標本向B端移動，流經(jīng)G處時將金標抗體復溶，假設待測標本中含待測抗原，即形成金標抗體-抗原復合物，移至T區(qū)時，形成金標抗體-抗原-抗體復合物，金標抗體被固定下來，在T區(qū)顯示紅色線條，呈陽性反響，多余的金標記抗體移至C區(qū)被抗金標抗體捕獲，呈現(xiàn)紅色質(zhì)控線條。圖11-1 免疫層析試驗雙抗體夾心法原理示意圖 競爭法檢測小分子抗原圖11-2 免疫層析試驗競爭法原理示意圖 G處為金標抗體，T處包被標準抗原，C處包被抗金標抗體，測試時待測標本加于A端，假設待測標本中含有待測抗原，流經(jīng)G處時結(jié)合金標抗體，當混合物移至T處

5、時，因無足夠游離的金標抗體與膜上標準抗原結(jié)合，T處無紅色線條出現(xiàn)，實驗結(jié)果為陽性，游離金標抗體或金標抗體復合物流經(jīng)C處，與該處的抗金標抗體結(jié)合出現(xiàn)紅色的質(zhì)控帶，假設標本中不含待測抗原，金標抗體那么與T處膜上的標準抗原結(jié)合，在T處出現(xiàn)紅色的線條，實驗結(jié)果為陰性。間接法利用間接法檢測抗體時，待測血清標本中大量的非特異性IgG可以與特異性IgG競爭性結(jié)合膠體金標記的抗人IgG，從而影響試驗的敏感性，為了消除其影響，常采用反流免疫層析法排除非特異性抗體對測試的干擾。熒光免疫層析試驗熒光免疫層析試驗是在免疫層析技術(shù)的根底上，采用熒光素標記相應的抗體或抗原，然后利用熒光檢測儀檢測試劑條上富集的反響結(jié)合物激

6、發(fā)產(chǎn)生的熒光強度，從而對標記物濃度進行檢測的一種方法。熒光免疫層析實驗與膠體金免疫層析實驗的根本步驟是一樣的，但所用的標記物不一樣，前者采用的是熒光素，后者采用的是膠體金。常用的方法有夾心法、競爭法等。技術(shù)要點膠體金層析試驗：加樣、結(jié)果判定。熒光層析試驗：不同的熒光標記物具有不同的檢測波長，需根據(jù)試劑盒的熒光標記物的特性，選擇適宜的檢測波長，或使用試劑盒提供的專用熒光檢測儀器。第三節(jié) 免疫滲濾試驗重點提示原理測定模式技術(shù)要點原 理DIGFA是將抗原或抗體點加在固相載體硝酸纖維素薄膜上，制成抗原或抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上，依次在膜上滴加樣品、免疫膠體金及洗滌液等試劑并與硝酸纖維素膜上

7、的相應抗原或抗體發(fā)生反響，起到親和層析的濃縮作用，到達快速檢測的目的?？乖贵w反響后，形成大分子膠體金復合物，從而使陽性結(jié)果在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。測定模式1.雙抗體夾心法測抗原：AB包被抗體的試紙滴加金標抗體滴加待檢樣品于試紙上測定模式2.間接法測特異性抗體：試劑盒組成主要由滲濾裝置、膠體金標記物、洗滌液、抗原參照品或抗體陽性對照品四局部組成。其中滲濾裝置是由塑料小盒、吸水墊料和已點加抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三局部組成。試劑盒一般都設有質(zhì)控點，質(zhì)控點的大小或形狀都不同于檢測點，有的用大小點區(qū)分、有的用點橫線區(qū)分，有的用橫豎線區(qū)分。圖11-3 DIGFA結(jié)構(gòu)示意圖技術(shù)要點加 樣：將滲濾裝置平放于

8、實驗臺面上，于小孔內(nèi)依次滴加含待測樣品及相應的試劑。結(jié)果判定：在膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點者判為陽性反響，反之那么為陰性反響。斑點呈色的深淺相應地表示陽性反響的強弱。第四節(jié) 斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗重點提示原理技術(shù)要點方法學評價原 理Dot-ELISA的實驗原理與常規(guī)的ELISA相同，不同之處在于Dot-ELISA所用載體為NC膜。其原理為樣品中的抗體或抗原與預先包被在NC膜上的抗原或抗體發(fā)生抗原抗體反響，然后再參加相應的酶標二抗進行反響，反響結(jié)束后，通過酶催化底物，形成有色的沉淀物，產(chǎn)生顯色反響，根據(jù)染色條帶或斑點的有無或深淺，對抗體或抗原進行檢測。陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色條帶或斑

9、點。圖11-4 Dot-ELISA示意圖技術(shù)要點抗原包被：優(yōu)化抗原的濃度。抗原抗體反響：滴加樣品血清，待檢抗體與NC膜上抗原結(jié)合。確定酶結(jié)合物最正確稀釋度：一般以陰性樣品不顯色而陽性樣品顯色最強的酶結(jié)合物稀釋度為最正確稀釋度。顯色反響：在鹽酸聯(lián)苯胺和過氧化氫為底物時，溶液pH值應在5.86.0，此時反響最靈敏。方法學評價優(yōu)點：強抗體3.其它：實驗和結(jié)果判斷不需特殊設備條件，結(jié)果可長期保存第五節(jié) 免疫印跡試驗重點提示原理技術(shù)要點方法學評價原 理技術(shù)要點抗原印跡與包被抗原抗體反應檢測抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上放射自顯影法底物化學發(fā)光法底物熒光法和底物顯色

10、法方法學評價特異性強，用于病原體確認13同時檢測多種抗體4膜條可重復檢測應用吸附蛋白能力強 22第六節(jié) 影響固相膜免疫試驗的主要因素重點提示試劑方面標本方面實驗過程影響因素：試劑試劑的選擇：注意試劑的注冊號、批號、有效期和檢驗合格證等；不同批號的試劑不能混用；不能使用過期的試劑。試劑的準備：試劑在開封前應檢查是否漏液、漏氣；使用前要在室溫1825下平衡20min30min。影響因素：標本標本處理：臨床檢測的標本有痰液、尿液、糞便、棉拭子、血清和血漿等。檢測前，需進行相應的前處理，如痰液或糞便，需用緩沖液或生理鹽水稀釋后，低速離心，取上清進行檢測。標本保存：對于采集的標本如不能立即檢測，需要保存

11、在28，不超過24小時，超過24小時以上，需保存在-20以下，忌反復凍融。影響因素：實驗過程溫度及時間結(jié)果判定檢測前要平衡至室溫（1825）后再開袋使用。無特殊說明，檢測的溫度為1825，時間在3Omin以內(nèi)。一些膠體金診斷試劑條只用于初步診斷， 確診需采用免疫印跡實驗進行。試劑條平衡第七節(jié) 固相膜免疫分析技術(shù)的臨床應用臨床應用類別檢驗項目 檢測方法心肌標志物乳酸脫氫酶(LD)同工酶譜肌酸激酶(CK-MB)及其同工酶免疫印跡試驗、熒光免疫層析試驗N-端腦利鈉肽前體、心肌肌鈣蛋白I、心鈉肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)等酶聯(lián)免疫斑點法感染性疾病乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)膠體金免疫層析試驗丙

12、型肝炎抗體(抗-HCV抗體)RIBA人類免疫缺陷病毒抗體（HIV）1/2型抗體膠體金免疫層析試驗、免疫印跡試驗自身免疫疾病抗Sm抗體、抗U1RNP抗體、抗Rib抗體、抗ssA抗體、抗ssB抗體、抗Scl-70抗體、抗Jo-1抗體、抗Ro60抗體等。RIBA、酶聯(lián)免疫斑點法、膠體金免疫層析試驗抗丙酮酸脫氫酶復合物（AMA-M2）、肝腎微粒體（LKM-1）、細胞色素P450、細胞漿肝抗原(LC-1)、可溶性肝抗原-肝胰抗原（SLA/LP）抗體檢測。RIBA抗絲氨酸蛋白酶3（PR3）、髓過氧化物酶（MPO）、腎小球基底膜（GBM）抗體。斑點滲濾法腫瘤標志物抗前列腺特異性抗原(PSA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)對、糖蛋白抗原（CA50、CA125、CA153、CA199）等 膠體金免疫層析試驗生殖相關人絨毛膜促性腺激素(HCG)膠體金免疫層析試驗性相關疾病淋病、尖銳濕疣、生殖器皰疹病毒（HSV)-IgG、梅毒螺旋體抗體。膠體金免疫層析試驗、WB、乳膠免疫層析法過敏原血清總IgE、總IgG、特異性IgE膠體金免疫層析試驗毒品大麻、嗎啡、甲基安非他明、氯胺酮(K粉)、美沙酮等膠體金免疫層析試驗本章小結(jié)固相膜免疫技術(shù)是在酶聯(lián)免疫吸附試驗、