PFGE(脈沖場(chǎng)凝膠電泳) 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)

1、PFGE（脈沖場(chǎng)凝膠電泳） 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP關(guān)鍵詞：PFGE，脈沖場(chǎng)凝膠電泳目的：運(yùn)用PFGE方法對(duì)20Kb至數(shù)Mb的DNA進(jìn)行分子分型圖譜分析：采用“PFGE脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子分型識(shí)別系統(tǒng)”（官微：PFGE_CHINA）進(jìn)行圖譜分析。系統(tǒng)主要功能是PFGE圖譜分子分型在線識(shí)別和處理，提供二叉層級(jí)聚樹，MLVA、MLST字符類型的最小生成樹，SEQUENCE基因片段類型的親緣樹計(jì)算和圖形繪制，用于分析菌株之間的相關(guān)性，協(xié)助追蹤感染來源以及有效控制疫情。第一天一、  膠塊的制備1、  在Falcon 2054管上標(biāo)記樣品名稱和空白對(duì)照，分別加入約2ml

2、細(xì)胞懸濁液（CSB）；2、  在1.5ml eppendorf管上標(biāo)記好對(duì)應(yīng)樣品的名稱；3、  在模具上標(biāo)記好對(duì)應(yīng)樣品的名稱； 4、  用CSB濕潤(rùn)接種環(huán)，從培養(yǎng)皿上刮取適量細(xì)菌，均勻懸濁于CSB中，用bioMerieux Vitek colorimeter測(cè)其OD值，并調(diào)整至3.64.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀釋；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其濃度。5、  取400µl細(xì)菌懸濁液于相應(yīng)的1.5ml eppendorf管中，置于37水浴中孵育5分鐘。將剩余的細(xì)菌懸濁液置于冰上直

3、到膠塊制備好放在水浴搖床中。6、  從水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl蛋白酶K（儲(chǔ)存液濃度為20mg/ml）混勻，使其終濃度為0.5mg/ml。7、  制備好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56水浴箱中。8、  在eppendorf管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用槍頭輕輕混勻。9、  將混合物加入模具，避免氣泡產(chǎn)生，在室溫下凝固10-15分鐘。注意事項(xiàng)：（1）  用后的接種環(huán)要放在指定的廢棄物容器中。（2）

4、0; 細(xì)胞懸濁液、蛋白酶K要置于冰上。（3）  在混合細(xì)胞懸濁液和1% Seakem Gold：1%SDS時(shí)要避免氣泡的產(chǎn)生。（4）  混合物加入模具時(shí)不能產(chǎn)生氣泡。（5）  在加1% Seakem Gold：1%SDS的過程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56水浴箱中。二、  細(xì)胞的裂解1、  在50ml的screw-cap tube上做好標(biāo)記。2、  配制細(xì)胞裂解液（CLB）：每5ml細(xì)胞裂解液加入25µl蛋白酶 K（20mg/ml

5、），使其終濃度為0.1mg/ml，然后顛倒混勻。注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的細(xì)胞CLB也要置于冰上。3、  每個(gè)管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、  如果想使膠塊平齊，可以用刀片削去模具表面多余的部分。（1）  可重復(fù)利用的模具：打開模具，用小鏟的寬頭部分將膠塊移入相應(yīng)的screw-cap管中。（2）  一次性模具：撕掉模具下面的膠帶，用小鏟將膠塊捅進(jìn)相應(yīng)的screw-cap管中，將模具、膠帶、小鏟放入廢棄物容器中。5、  保證膠塊在液面下而不在管壁上。6、  

6、將管子放在54水浴搖床中孵育2小時(shí)，轉(zhuǎn)速約170轉(zhuǎn)/分鐘。7、  將純水和TE放在50水浴搖床中預(yù)熱。三、洗膠塊1、  從水浴搖床中拿出screw-cap管，蓋上綠色的screened-cap。輕輕倒掉CLB。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上輕磕管底使膠塊落在管底。注意：把管倒置在吸水紙上，使管內(nèi)液體被盡量排除干凈。隨后的操作中也如此。2、  每管中加入15ml預(yù)熱的純水。3、  確保膠塊在液面下而不在管壁或蓋子上，放回50水浴搖床中，搖10分鐘。4、  倒掉水，用純水再洗一次。、5、  倒掉水，

7、加入15ml預(yù)熱的TE，在50的水浴搖床中搖15分鐘。6、  倒掉TE，用TE重復(fù)洗三次，每次1015分鐘。7、  倒掉TE，加入10ml TE，放在4冰箱保存?zhèn)溆?。注意：要確保膠塊在液面下而不在管壁或蓋子上。四、膠塊內(nèi)DNA的酶切1、  在1.5ml eppendorf管上標(biāo)記好相應(yīng)的樣品及H9812的名稱。2、  按照下面的比例配制緩沖液H的稀釋液，混勻。試劑  µl/膠塊  µl /10膠塊純水  180µl 

8、 1800µlBuffer D  20µl  200µl總體積  200µl  2000µl注意：緩沖液要置于冰上。3、  在每個(gè)1.5ml eppendorf管中加入200µl緩沖液H的稀釋液。4、  小心從TE中取出膠塊放在干凈的培養(yǎng)皿上。5、  用刀片切下2mm寬的膠塊放入1.5ml eppendorf管中。確保膠塊在液面下面。將剩余的膠塊放回原來的TE中。6、 

9、0;用同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)株H9812的膠塊。7、  將管子放在37水浴中孵育10-15分鐘。8、  在用稀釋緩沖液孵育的過程中，按照以下的比例配制酶切緩沖液，混勻。試劑  µl/膠塊  µl /10膠塊純水  175µl  1750µlBuffer D  20µl  200µl酶（10U/µl）  5µl  50

10、81;l總體積  200µl  2000µl注意：（1）  將酶置于冰上，用后立即放在20保存。（2）  用槍頭吸出緩沖液H，避免損傷膠塊。9、  每管加入200µl混合液，輕輕在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上磕管子的底部，確保膠塊在液面的下面。10、  在37水浴中孵育至少2小時(shí)。五、加樣（一）將膠塊直接粘在梳子齒上1、  調(diào)整梳子的高度，使梳子齒與膠槽的底面相接觸。用水平儀調(diào)整膠槽使其水平。2、  從37水浴中取出膠塊，平衡

11、到室溫。3、  用槍頭吸出酶切混合液，避免損傷或吸出膠塊。4、  每管加入200µl 0.5×TBE。5、  把梳子平放在膠槽上，把膠塊加在梳子齒上。如果用的是10個(gè)齒的梳子，把標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812加在第1、5、10個(gè)齒上。6、  用吸水紙的邊緣吸去膠塊附近多余的液體，在室溫下風(fēng)干約3分鐘。7、  把梳子放入膠槽，確保所有的膠塊在一條線上，并且膠塊與膠槽的底面相接觸。從膠槽的下部中央緩慢到入100ml熔化的在5560平衡的1SKG。避免氣泡的生成；如果有，用槍頭消除。在室溫下凝

12、固30分鐘左右。8、  記錄加樣順序。（二）將膠塊直接加在加樣孔內(nèi)1、  調(diào)整梳子的高度，使梳子齒與膠槽的底面有一定間距。用水平儀調(diào)整膠槽使其水平。2、  把梳子放入膠槽，從膠槽的中央緩慢倒入100ml熔化的在5560平 衡的1SKG。避免氣泡的生成；如果有，用槍頭消除。在室溫下凝固30分鐘左右。3、  小心拔出梳子。4、  從37水浴中取出膠塊，平衡到室溫。5、  用槍頭吸出酶切混合液，避免損傷或吸出膠塊。6、  每塊膠加入200µl

13、 0.5×TBE平衡。7、  用小鏟將膠塊加入加樣孔。8、  用溶化的膠封閉加樣孔。注意：a  可以在加樣孔中加入0.5×TBE，利用毛細(xì)作用將膠塊沉在加樣孔底，盡量避免氣泡形成。b  記錄加樣順序。六、電泳1、  確保電泳槽是水平的。如果不水平，調(diào)整槽底部的旋鈕。注意：不要觸碰電極。2、  加入2.2L 0.5×TBE,關(guān)上蓋子。3、  打開主機(jī)和泵的開關(guān)，確保泵設(shè)在70（這時(shí)緩沖液的流速約1L/分鐘）和緩沖液在管道中正常循

14、環(huán)。4、  打開冷凝機(jī)，確保預(yù)設(shè)溫度在14（緩沖液達(dá)到該溫度通常需要20分鐘左右）。5、  打開膠槽的旋鈕，取出凝固好的膠，用吸水紙清除膠四周和底面多余的膠，小心的把膠放入電泳槽，關(guān)上蓋子。6、  設(shè)置電泳參數(shù)。7、  記錄電泳初始電流（通常120145ma）。8、  結(jié)束電泳：關(guān)機(jī)順序?yàn)椋豪淠龣C(jī)泵主機(jī)。第二天七、圖像的獲取1、  取出膠，放在盛放400ml EB溶液的托盤內(nèi)（EB儲(chǔ)存液濃度為10mg/ml，1：10,000稀釋，即在400ml水中加入40µl儲(chǔ)存液

15、）。注意：EB是致畸劑。儲(chǔ)存在棕色瓶中的EB稀釋液可以用3-5次。廢棄的EB溶液應(yīng)妥善處理。2、  將托盤放在搖床上搖25-30分鐘。3、  放掉電泳槽中的TBE，用1-2L純水清洗電泳槽，并倒掉液體。4、  戴上手套將用后的EB溶液小心倒入做有標(biāo)記的棕色瓶中，在托盤中加入400-500ml純水，放在搖床上脫色60-90分鐘，如果可能每20-30分鐘換一次純水。5、  用Gel Doc 2000拍攝圖像。注意：如果背景干擾分析，可進(jìn)一步脫色30-60分鐘。6、  轉(zhuǎn)換成*.1sc文件用于處理分析

16、。八、數(shù)據(jù)的分析圖像的讀取電泳圖像通常用BIO-RAD的GEL DOC 2000或其它成像系統(tǒng)來獲取。其它可以替代的成像設(shè)備，只要具有CCD相機(jī)，可以提供IBM兼容的未壓縮的TIFF圖像，且分辨力768 x 640像素，能夠用BioNumerics software (Applied Maths, Inc.軟件與PulseNet數(shù)據(jù)庫中其它圖像進(jìn)行對(duì)比分析，也可以運(yùn)用。運(yùn)用GEL DOC 2000的簡(jiǎn)單說明：QUANTITY ONE軟件1、  點(diǎn)擊QUANTITY ONE按鈕打開該軟件。2、  點(diǎn)擊菜單FILEGEL DOC。注意：需要1020秒打開窗口

17、。3、  打開抽屜，把膠放在臺(tái)板上。膠已經(jīng)經(jīng)過EB或GEL-STAR染色并經(jīng)過充分脫色。用黑色膠框把膠放在合適的位置。關(guān)上抽屜門。圖像的獲取1、  按下EPI-LIGHT按鈕打開白光。2、  把膠放在調(diào)準(zhǔn)網(wǎng)格線內(nèi)，使膠的加樣孔和調(diào)準(zhǔn)網(wǎng)格線的最上面一條藍(lán)線對(duì)齊。3、  保證調(diào)準(zhǔn)網(wǎng)格線和過飽和按鈕被選中。4、  改變鏡頭的MIDDLE RING以調(diào)整圖像的大（順時(shí)針）?。鏁r(shí)針），使圖像占據(jù)整個(gè)窗口。如果需要，挪動(dòng)膠在臺(tái)板上的位置。膠的加樣孔、下邊界和左右邊界在屏幕上都應(yīng)該可以看到。5、 

18、 如果需要，按BOTTOM RING以調(diào)整相機(jī)的焦距。注意：焦距的調(diào)整只可以偶爾用之，不可用于每一塊膠。可以用尺子幫助調(diào)整焦距。6、  按下EPI-LIGHT關(guān)掉白光，按下UV按鈕打開透射紫外光。7、  點(diǎn)擊AUTO EXPOSE以確定大概的曝光時(shí)間。當(dāng)圖像出現(xiàn)在窗口時(shí)，AUTO EXPOSE自動(dòng)關(guān)閉而MANUAL EXPOSE被激活。8、  點(diǎn)擊MANUAL EXPOSE的按鈕，調(diào)整曝光時(shí)間。而調(diào)整飽和度時(shí)，點(diǎn)擊箭頭或TURN THE TOP RING以降低光量（如果圖像過飽和，圖像顯現(xiàn)紅色）。注意：如果出現(xiàn)對(duì)話框“曝光可

19、以在0.03360秒之間波動(dòng)”，則需通過改變相機(jī)的像素以調(diào)整飽和度。調(diào)整飽和度使樣品條帶沒有紅色很重要，因?yàn)檫@會(huì)影響B(tài)IONUMERICS軟件對(duì)膠圖像的分析。而膠加樣孔的過飽和屬于正?，F(xiàn)象。9、  當(dāng)圖像調(diào)整的比較滿意時(shí)，按下FREEZE按鈕停止曝光過程。按下UV按鈕關(guān)掉紫外光（如果開門時(shí)UV燈打開，它會(huì)自動(dòng)關(guān)閉）。圖像的輸出1、  保存圖像（*.1sc）：FILESAVE。確保選擇正確的路徑。文件默認(rèn)的名字包括日期、時(shí)間和用戶?？梢愿淖兾募?、  打印文件：FILEPRINTVIDEO PRINT，也可以直接點(diǎn)擊屏幕上的PRIN

20、T按鈕。3、  轉(zhuǎn)為*.TIFF格式：FILEEXPORT TO TIFF IMAGEEXPORT，選擇正確的路徑。4、  關(guān)閉QUANTITY ONE程序：FILEEXIT。5、  取出膠放在染色盒內(nèi)。用軟麻布擦掉臺(tái)板表面多余的液體，用水或70的異丙醇洗干凈。試劑儲(chǔ)存液的配制1、1 M Tris HCl, pH 8.0*121.1 g Tris base溶于650-700 ml純水中，加入80 ml 6 N HCl*，在室溫下調(diào)pH至8.0，加水終體積至1000 ml，高壓滅菌?；蛘?57.6 g Tris-HCl溶于800 ml純

21、水中，在室溫下調(diào)pH至8.0，加水終體積至1000 ml，高壓滅菌。2、10 N NaOH*400 g NaOH小心溶于800 ml純水中，冷卻到室溫，加滅菌的純水使終體積至1000 ml。  3、0.5 M EDTA, pH 8.0*18   6.1 g Na2EDTA 2H2O溶于800 ml純水中，加入50ml 10N NaOH調(diào)pH至8.0，加水終體積至1000 ml，分成數(shù)份，高壓滅菌。4、20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS*十二烷基硫酸鈉用于E. coli O157:H7, Salmonella and Shige

22、lla sonnei, PFGE將20克SDS小心加入裝有80 ml滅菌純水的容器中，在35°- 45°C輕輕混勻溶解，定容至100ml。5、20 mg/ml 蛋白酶K儲(chǔ)存液*100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 滅菌純水中，混勻，分裝在1.5 ml離心管中，每管500-600 l，-20°C保存?zhèn)溆谩?、10X Tris-Borate EDTA Buffer (TBE, pH 8.3*0.9 M Tris base (108 g0.9 M Boric Acid (55 g0.02 M EDTA, pH 8.0 (40 ml 0.5 M溶于10

23、00 ml滅菌的純水中，高壓滅菌注意：如果緩沖液有沉淀生成必須丟棄。7、Ethidium Bromide（EB）*10 mg/ml EB的儲(chǔ)存液用純水1:10,000 稀釋(即100 ml水中加入10 l儲(chǔ)存液，（500ml水中加50ul）。稀釋液在丟棄前可以染5-6塊膠。實(shí)驗(yàn)試劑注意：用滅菌的玻璃制品、塑料制品和純水來制備以下試劑。1、Tris:EDTA Buffer (TE, pH 8.0*（10 mM Tris-HCL:1 mM EDTA , pH 8.0）  10 ml 1 M Tris-HCL, pH 8.0  2 ml 0.5 M EDTA,

24、 pH 8.0 用滅菌的純水稀釋到1000 ml在E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, and Campylobacter jejuni PFGE 用TE Buffer 于:. 溶解1% SeaKem Gold:1% SDS agarose. 細(xì)菌裂解后洗膠塊在L. monocytogenes PFGE 用TE Buffer于:.懸浮菌細(xì)胞 . 細(xì)菌裂解后洗膠塊2、Cell Suspension Buffer (CS100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH 8.0用于E. coli O157:

25、H7, Salmonella, and Shigella sonnei PFGE10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.020 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0用滅菌的純水稀釋到100 ml3、Cell Lysis Buffer（CLB）50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH 8.0 + 1% N-Lauroyl-Sarcosine, Sodium salt (Sarcosyl，0.1mg/ml Proteinase K (用前再加入用于裂解E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei,和 Campylobac

26、ter jejuni 25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.050 ml 0.5 M EDTA, pH 8.050 ml 10% Sarcosyl 3用滅菌的純水稀釋到500 ml，每5 ml CLB加入25l蛋白酶K儲(chǔ)存液(20 mg/ml，使其終濃度為0.1 mg/ml.5、0.5X TBE Buffer 200 ml 5X TBE用純水稀釋到2000 ml或100 ml 10X TBE用純水稀釋到2000 ml注意：用來稀釋5X TBE、10X TBE的純水可以不滅菌。6、SeaKem Gold Agarose做膠塊； 電泳膠報(bào)價(jià) seakem gold

27、瓊脂糖 25g 貨號(hào)50111，1567元人民幣?？纱?折。125g 貨號(hào) 50150 ，BMA， 6422元。 北京基因公司 10-66001657；上海廣州020-85524841天津 02223011926；西安成都沈陽南武漢昆明杭州沙重慶南京無菌

28、的超純水8、蛋白酶K粉末或蛋白酶K溶液（20mg/ml） 6、限制性內(nèi)切酶E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei    XbaI,，AvrII (同切限制內(nèi)切酶BlnI，SpeI    (NotI可用于S. sonnei；但不用于E. coli O157:H7   L. monocytogenes，  AscI, ApaI  Campylobacter jejuni, C. coli，S

29、maI, KpnI器 材1、Dade Microscan Turbidity MeterSpectrophotometerbioMérieux Vitek Colorimeter調(diào)整細(xì)胞懸濁液的濃度2、微波爐溶膠3、水浴搖床裂解膠塊中的細(xì)胞(54°C用水和TE(50°C洗膠塊4、56°C水浴箱平衡和保溫熔化的膠5、25°C, 30°C, 37°C水浴箱酶切6、50°C水浴箱加熱用于洗膠塊的水和TE，酶切7、離心機(jī)。8、最少需要兩個(gè)水浴箱一個(gè)平衡到56°C，另一個(gè)到37°C。如果需要，溫度可以上下

30、調(diào)動(dòng)。Listeria PFGE中膠塊的ApaI酶切需30°C水浴。耗 材1、  無菌的Falcon 2054（12-mm x 75-mm）或Falcon 2057（17-mm x 100-mm）用于細(xì)胞懸濁液的制備基因公司代理 ，2、無菌的聚酯纖維或棉簽用于從瓊脂平板上刮取細(xì)菌3、無菌的槍頭或巴斯得吸管4、無菌的1.5 ml離心管用于混合細(xì)胞懸濁液和膠、酶切5、無菌的50 ml screw-cap tubes 或50 ml Oak Ridge tubes 用于裝膠塊， 6、  Green Screened Caps（Bio-Rad

31、1703711）洗膠塊時(shí)用伯樂公司 貨號(hào) 170-3711。7、模具10孔（可重復(fù)利用的，2cm x 1cm x 1.5mm）50孔（一次性的，1.5mm x 10mm x 5mm8、單刃剃須刀、手術(shù)刀、平皿或類似物用于切膠塊9、無菌的一次性皮氏平皿或大的玻璃載物片用于切膠塊10、  一端寬、一端窄的平鏟藥鏟，生工等公司的實(shí)驗(yàn)室耗材部分有。11、標(biāo)準(zhǔn)膠槽（14 x 13cm的框和平板） 12、10孔的梳子（14 cm長(zhǎng)，1.5 mm寬）13、15孔的梳子（21 cm長(zhǎng)，1.5 mm寬）Bio-Rad 170-362714、膠水平臺(tái)15、盛放EB染液的塑料容器16、

32、70異丙醇、5%10%的漂白劑或其它合適的消毒劑17、各種體積的無菌燒瓶或瓶子（50 ml - 2000 ml）18、各種規(guī)格的無菌量筒（100 ml - 2000 ml）19、無菌的吸管（2 ml - 50 ml）20、保護(hù)性手套（無石化粉的乳膠手套、聚乙烯手套或腈類手套）21、防熱性手套22、冰盒名稱：免疫組化 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP關(guān)鍵詞：免疫組化目的：規(guī)范免疫組化操作主要步驟:1、脫蠟和水化 脫蠟前，應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60恒溫箱中烘烤20分鐘。 1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；2）無水乙醇中浸泡5分鐘；3）95%乙醇中浸泡5分鐘； 4）70%乙醇中浸泡5分鐘； 2、抗原修復(fù)用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯