二、從自然界或現(xiàn)

1、二、從自然界或現(xiàn)有菌種中分離篩選菌種二、從自然界或現(xiàn)有菌種中分離篩選菌種（一）采樣（二）增殖培養(yǎng)（三）純種分離及純培養(yǎng)（四）生產(chǎn)性能測定（一）采樣1選擇采樣地點2確定采樣時間3采樣1選擇采樣地點 以采集土壤為主。一般在有機質(zhì)較多的肥沃土壤中，微生物的數(shù)量最多，中性偏堿的土壤以細菌和放線菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中霉菌較多，果園、菜園和野果生長區(qū)等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多。2確定采樣時間 采樣應充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，以溫度適中，雨量不多的秋初為好。如在夏季或冬季土壤中微生物存活數(shù)量較少，暴雨后土壤中微生物也會顯著減少。3采樣 在合適的時間選好適當?shù)攸c，用無菌刮鏟

2、、土樣采集器等，采集有代表性的樣品。具體采集土樣時，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤自下向上層順序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不損土層結構的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面50150mm處的土。將采集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮紙袋或玻璃瓶中。采好的樣品必須完整地標明樣品的種類、采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等。采好的樣品應及時處理，暫不能處理的應在4條件下貯存，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長。（二）增殖培養(yǎng)1控制培養(yǎng)基中碳源的種類在選擇

3、碳源時根據(jù)微生物利用碳源的特點，可選定糖、淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有能利用這種碳源的微生物才能大量正常生長，而其他微生物就可能死亡或被淘汰。2添加某些抑制或促進因子在分離細菌時，培養(yǎng)基中添加濃度一般為50gmL的抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生長。在分離放線菌時，通常于培養(yǎng)基中加入15mL天然浸出汁(植物、巖石、有機混合腐質(zhì)等的浸出汁)作為最初分離的促進因子，由此可以分離出更多不同類型的放線菌。3控制培養(yǎng)條件在分離梭狀芽孢桿菌時，可利用該菌的厭氧特性，控制為厭氧培養(yǎng)環(huán)境，這樣好氧菌就不易生長而受到抑制，只有厭氧菌可以優(yōu)勢生長。（三）純種分離及純培

4、養(yǎng)1稀釋分離法將樣品進行適當稀釋，然后將稀釋液涂布接種于培養(yǎng)基平板上進行培養(yǎng)，待長出獨立的單個菌落，進行挑選分離。2劃線分離法要首先鋪制培養(yǎng)基平板，然后用接種針（接種環(huán)）挑取樣品，在平板上劃線。劃線方法可用分步劃線法或一次劃線法，無論用哪種方法，基本原則是確保培養(yǎng)出單個菌落。3組織分離法主要用于食用菌菌種或某些植物病原菌的分離。分離時，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液對植物或器官組織進行表面消毒，用無菌水洗滌數(shù)次后，將一小塊組織移植到固體培養(yǎng)基表面，于適宜溫度培養(yǎng)數(shù)天后，可見微生物向組織塊周圍擴展生長。經(jīng)菌落特征和細胞特征觀察確認后，即可由菌落邊緣挑取部分菌種進行純培養(yǎng)。對于有些微生物如毛霉

5、、根霉等在分離時，由于其菌絲的蔓延性，極易生長成片，很難挑取單菌落。常在培養(yǎng)基中添加0.1%的去氧膽酸鈉或在察氏培養(yǎng)基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，這些做法均利于單菌落的形成。（四）生產(chǎn)性能測定 這種從自然界中分離得到的純種稱為野生型菌株，它只是篩選的第一步，所得菌種是否具有生產(chǎn)上的實用價值，能否作為生產(chǎn)菌株，還必須采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶進行小型發(fā)酵試驗，以求得到適合于工業(yè)生產(chǎn)用的菌種。如果所得到的野生型菌株產(chǎn)量偏低，達不到工業(yè)生產(chǎn)的要求，仍可以保留作為菌種選育的出發(fā)菌株。三、微生物菌種的自然選育三、微生物菌種的自然選育在應用微生物加工制造和發(fā)酵生產(chǎn)各種產(chǎn)品的

6、過程中，要想有效地大幅度提高產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量和增加品種，往往需要通過選育優(yōu)良的生產(chǎn)菌種才能達到目的。而經(jīng)過分離篩選獲得的菌種，一般不能立即適應實際生產(chǎn)需要，還要通過選育，才能提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量、改進產(chǎn)品質(zhì)量、簡化工藝、提高產(chǎn)品附加值。優(yōu)良菌種的選育是在微生物遺傳變異的基礎上進行的。遺傳和變異是相互關聯(lián)，同時又相互矛盾對立的兩個方面，在一定條件下，二者是相互轉(zhuǎn)化的。認識和掌握微生物遺傳變異的規(guī)律是搞好菌種選育的關鍵。根據(jù)微生物遺傳變異的特點，人們在生產(chǎn)實踐中已經(jīng)試驗出一套行之有效的微生物育種方法。育種的手段很多，主要包括自然選育、誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合、基因工程等。四、微生物菌種的誘變

7、選育四、微生物菌種的誘變選育（一）誘變育種的一般步驟（二）營養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選（一）誘變育種的一般步驟1選擇出發(fā)菌種2同步培養(yǎng)3制備單細胞或單孢子菌懸液4誘變處理5篩選變異菌株1選擇出發(fā)菌種 出發(fā)菌種是指用于誘變的原始菌種。出發(fā)菌種可以是從自然界的土樣或水樣中分離出來的野生型菌種；也可以是生產(chǎn)中正在使用的菌種；還可以從菌種保藏機構中購買。選擇的原則是菌種要對誘變劑的敏感性強、變異幅度大、產(chǎn)量高。2同步培養(yǎng) 在誘變育種前，最好選用生理狀態(tài)一致的單細胞或單孢子，并盡量使菌懸液中細胞達到同步生長，即處于同一生長周期。具體做法有兩類，一類是通過環(huán)境條件來誘導同步性，例如變換溫度、光線，或向處于穩(wěn)定

8、期的菌懸液中添加新鮮培養(yǎng)基；另一類是用物理方法將同步生長中的細胞挑選出來，例如將非同步的細菌培養(yǎng)液通過大小不同的微孔過濾器，從而將大小不同的細胞分開，分別取濾液培養(yǎng)，就可獲得同步生長的細胞。3制備單細胞或單孢子菌懸液 為了使每個細胞都能均勻接觸誘變劑，通常要將出發(fā)菌種先制成單細胞(或單孢子)懸浮液，再進行誘變處理。菌懸液一般用無菌生理鹽水或緩沖溶液配制，特別是用化學誘變劑進行誘變處理時，使用緩沖溶液可以克服處理過程中pH值變化帶來的干擾。菌懸液的細胞或孢子濃度一般可以控制在106108個/mL之間，處理酵母菌或霉菌時控制在106107個/mL，處理細菌或放線菌時控制在108個/mL。另外為保證

9、誘變效果，還要注意菌懸液的分散度?？刹捎孟扔貌Ａе檎袷幏稚?，再用脫脂棉或濾紙過濾，經(jīng)過這樣的處理分散度可以達到90%以上。4誘變處理（1）誘變劑種類（2）劑量（1）誘變劑種類 誘變劑包括物理誘變劑和化學誘變劑。物理誘變劑有紫外線、X射線、射線、快中子等?；瘜W誘變劑有N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、甲基亞硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)和環(huán)氧乙烷等。目前常用的誘變劑主要有紫外線(UV)、硫酸二乙酯、N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝基甲基脲(NMU)等。后兩種的誘變效果比較突出，被譽為“超誘變劑”。（2）劑量劑量一般指作用強度與作用時間的乘

10、積。劑量的選擇受處理條件、菌種情況、誘變劑種類等多種因素的影響。在育種實踐中，常采用殺菌率作為各種誘變劑的相對劑量。要確定一個合適的劑量，通常要進行多次試驗。在實際工作中，突變率往往隨劑量的增高而提高，但達到一定程度后，再提高劑量反而會使突變率下降。根據(jù)對紫外線、X射線和乙烯亞胺等誘變效應的研究結果，發(fā)現(xiàn)正向突變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負向突變則較多地出現(xiàn)于偏高的劑量中，還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負變。因此，在誘變育種工作中，目前比較傾向于采用較低的劑量。例如，過去在用紫外線作誘變劑時，常采用殺菌率為99的劑量，而近年來則傾向于采用殺菌率為30%75%的劑量。5篩

11、選變異菌株（1）初篩（2）復篩（3）菌種篩選實例（4）平皿快速檢測法（1）初篩 初篩的目的是快速對單個菌落進行定性。一般通過平板稀釋法獲得單個菌落，再確定單個菌落是否為正突變型菌株。初篩的方法有兩類，一類是快速定性法，即對平板稀釋法獲得的各個菌落進行有關性狀的初步測定，從中選出具有優(yōu)良性狀的菌落。例如，對抗生素產(chǎn)生菌來說，選出抑菌圈大的菌落；對于蛋白酶產(chǎn)生菌來說，選出透明圈大的菌落。此法快速、簡便，結果直觀性強。缺點是培養(yǎng)皿的培養(yǎng)條件與三角瓶、發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件相差大，兩者結果常不一致。另一類則是與復篩相似的較為精準的定量法。（2）復篩 復篩的目的是對初篩選后獲得的菌株進行有關性狀的精確定量。一

12、般要在搖瓶或臺式發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，經(jīng)過精細的分析測定，得出準確的數(shù)據(jù)。（3）菌種篩選實例 現(xiàn)以青霉素產(chǎn)生菌高產(chǎn)突變菌種的篩選為例加以說明。將經(jīng)誘變處理的菌液按一定濃度稀釋后，涂布在平板培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后，將長出的單個菌落接種到斜面培養(yǎng)基上。經(jīng)培養(yǎng)后，再將每一支斜面上的培養(yǎng)物分別接種搖瓶，經(jīng)振蕩培養(yǎng)后測它們的抗生素效價。這就是初篩。當初篩中所得到的突變株對照效價超過10%時，再進行復篩。復篩的過程與初篩基本相同，只是復篩時一般將每支斜面上的培養(yǎng)物分別接種到三個搖瓶中，得出平均效價。復篩可進行13次。（4）平皿快速檢測法紙片培養(yǎng)顯色法透明圈法瓊脂塊培養(yǎng)法圖2-1平皿快速檢測法紙片培養(yǎng)顯色法此法是將指

13、示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，由于菌種的生長繁殖而改變了指示劑所處的環(huán)境，因而在菌落周圍形成了變色圈。這種方法適合于多種生理指標的測定，如淀粉酶變色圈（用碘液使淀粉顯色）大小的測定，氨基酸顯色圈（轉(zhuǎn)印到濾紙上再用茚三酮顯色）大小的測定，檸檬酸變色圈（用溴甲酚藍做指示劑）大小的測定等。根據(jù)這些生理效應的大小來估計相應代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。下面以篩選檸檬酸產(chǎn)生菌為例加以說明：將與培養(yǎng)皿大小一致的濾紙片浸入含有0.02%溴甲酚藍指示劑的培養(yǎng)基中，再將濾紙片放在培養(yǎng)皿中，用4只牛津小杯擱起，中間放一小塊浸有3%甘油的脫脂棉以保濕，用接種環(huán)將適當濃度的菌懸液接種到濾紙上，保溫培養(yǎng)，培養(yǎng)后可在菌落周圍見到因產(chǎn)酸

14、而出現(xiàn)的變色圈。最后，根據(jù)變色圈與菌落直徑的比值計算出該菌的產(chǎn)酸能力。透明圈法 此法是將固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景，菌種生長繁殖并形成菌落的同時由于利用了此物質(zhì)而形成了透明圈。 有人將產(chǎn)蛋白酶的醬油曲霉突變體用紫外線處理，使之再變異，然后在含酪素的瓊脂培養(yǎng)基上使其長出菌落，利用菌落周圍透明圈的大小，選出了優(yōu)良高產(chǎn)菌株U34，該菌的產(chǎn)酶活力約為出發(fā)菌株的6倍。瓊脂塊培養(yǎng)法此法是篩選抗生素產(chǎn)生菌較為理想的一種方法，具體做法是：將誘變后的孢子懸液涂布在瓊脂平板上，29培養(yǎng)2天，待長出稀疏的小菌落后，用打孔器取出長有單菌落的瓊脂小塊，并把它整齊地放入滅過

15、菌的空培養(yǎng)皿中，保持一定溫濕度，在29繼續(xù)培養(yǎng)45天，使其產(chǎn)生抗菌素并分泌在瓊脂塊內(nèi)，然后將這些瓊脂塊移置于鋪有實驗菌的大方盤內(nèi)，在29培養(yǎng)1718小時，觀察抑菌圈大小，選取抑菌圈大的轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基。這種方法的特點是當菌種剛長出小菌落時便用打孔器將它們分別取出培養(yǎng)，在這種條件下，各瓊脂塊所含的養(yǎng)料和接觸空氣面積基本相同，而且產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也無處擴散，所以用這種方法獲得的數(shù)據(jù)與搖瓶培養(yǎng)十分相似，然而工作效率卻大大提高了。（二）營養(yǎng)缺陷型突變菌株的篩選1常用的幾個術語2篩選過程1常用的幾個術語（1）營養(yǎng)缺陷型是指某一野生型菌株由于發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子的能力，因而無法在基本培養(yǎng)

16、基上正常生長繁殖的變異類型。（2）野生型從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營養(yǎng)缺陷型突變前的原始菌株。（3）原養(yǎng)型一般指營養(yǎng)缺陷型突變株經(jīng)回變或重組后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。（4）基本培養(yǎng)基(MM)指僅能滿足某種微生物的野生型菌株生長最低限度需要的合成培養(yǎng)基。（5）補充培養(yǎng)基(SM)指在基本培養(yǎng)基中添加某種營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足該種營養(yǎng)缺陷型菌株生長需要的合成或半合成培養(yǎng)基。例如在MM中加入蛋白胨（其中含多種氨基酸)便可以用來培養(yǎng)各種氨基酸的缺陷型菌株；加入酵母浸膏(含多種B族維生素和核苷酸)便可以培養(yǎng)不同的維生素、嘌呤和嘧啶缺陷型菌株。（6）完全培養(yǎng)基(CM)指可以滿足某種微生

17、物所有營養(yǎng)缺陷型生長需要的天然或半合成培養(yǎng)基。2篩選過程（1）淘汰野生型菌株（2）營養(yǎng)缺陷型的檢出（3）營養(yǎng)缺陷型的鑒定（1）淘汰野生型菌株經(jīng)誘變處理培養(yǎng)后的細胞中除包含營養(yǎng)缺陷型菌株外，仍含有大量野生型菌株。為便于篩選，必須將野生型細胞大量淘汰以濃縮營養(yǎng)缺陷型細胞。常用淘汰野生型細胞的方法有抗生素法和過濾法，這兩種方法主要依據(jù)了野生型細胞和營養(yǎng)缺陷型細胞在MM培養(yǎng)基上的生長特性而設計的?？股胤股胤ǖ幕驹硎且吧图毎茉诨九囵B(yǎng)基上生長繁殖，可選用某種抗生素將這些處于生長狀態(tài)的細胞殺死，而留下不能生長的缺陷型細胞。過濾法過濾法是使能在基本培養(yǎng)基上生長形成菌絲體的野生型留在濾膜上，不能

18、生長的營養(yǎng)缺陷型孢子則能透過濾膜。（2）營養(yǎng)缺陷型的檢出逐個檢出法把濃縮的菌液(細胞或孢子)在CM培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，然后將平板上出現(xiàn)的菌落逐個、同時點種到MM培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)基上，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后，凡是在MM培養(yǎng)基上不能生長，而在CM培養(yǎng)基上能生長的菌落，經(jīng)重新復證后仍然如此，則這樣的菌落便是營養(yǎng)缺陷型。（圖2-2）夾層檢出法在培養(yǎng)皿底層先倒入一層MM培養(yǎng)基，待凝固后，在其上面倒入一層稀釋菌液與MM培養(yǎng)基的混合物（凝固后可再倒人一層MM培養(yǎng)基），培養(yǎng)后長出的菌落為野生型，在其上面再加上一層CM培養(yǎng)基，經(jīng)過培養(yǎng)后新出現(xiàn)的小菌落則多數(shù)是營養(yǎng)缺陷型。這種方法一般適用于細菌。（圖2-3）（2）營

19、養(yǎng)缺陷型的檢出限量補充培養(yǎng)基檢出法將經(jīng)過濃縮的菌液接種在含有微量(0.6或更少)蛋白胨的MM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，野生型菌株能夠迅速生長成較大的菌落，而營養(yǎng)缺陷型菌株生長較慢，故長成小菌落從而得以檢出。影印檢出法將已滅菌的絲絨布包在直徑小于培養(yǎng)皿的小圓柱體上，這樣便制成了一個類似印章的工具，它可使菌落位置不變地從一個培養(yǎng)皿移至另一個培養(yǎng)皿。具體操作方法是：把印章放在已長出菌落的平皿(完全培養(yǎng)基)上輕輕壓一下(注意不要沾上培養(yǎng)基)，然后輕輕地分別印在基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上。經(jīng)過培養(yǎng)后，在完全培養(yǎng)基上生長，而在基本培養(yǎng)基上不生長的菌落便是營養(yǎng)缺陷型。影印法是在細菌抗藥性變異研究中發(fā)展起來的技術，目前已在

20、放線菌、酵母菌等形成小菌落的微生物育種中廣泛應用。因霉菌孢子容易飛散，故常引起誤差。（圖2-4）圖2-3營養(yǎng)缺陷型菌株夾層檢出法圖2-4營養(yǎng)缺陷型菌株影印檢出法（3）營養(yǎng)缺陷型的鑒定缺陷營養(yǎng)類別的確定常用于確定營養(yǎng)缺陷型類別的天然混合物有：不含維生素的酪素水解物、氨基酸混合物或蛋白胨；水溶性維生素混合物；O.1堿水解酵母核酸液等。檢測方法可用濾紙法。取直徑5mm的濾紙片分別沾取以上混合物溶液，放在已接菌的平皿上培養(yǎng)，只要在濾片周圍長出菌，即可判斷出此營養(yǎng)缺陷型的類別。缺陷營養(yǎng)因子的確定缺陷營養(yǎng)因子可能是一種，也可能是二、三種或更多。檢測時可用上述濾紙法，也可用營養(yǎng)組分分組法，例如，在分析l5種

21、可能的營養(yǎng)因子時，可按表的組合配成5種溶液。將分別沾有5組營養(yǎng)因子溶液的紙片放置于MM培養(yǎng)基上，觀察生長情況，根據(jù)表2-2營養(yǎng)因子的組合及其缺陷示意表中營養(yǎng)因子缺陷示意欄查出其營養(yǎng)缺陷因子，然后再通過單一因子復證以最終確定。表表2-2 營養(yǎng)因子的組合及其缺陷示意表營養(yǎng)因子的組合及其缺陷示意表營養(yǎng)因子的組合營養(yǎng)因子缺陷示意溶液組合編號組合的營養(yǎng)因子生長組合營養(yǎng)因子缺陷生長組合營養(yǎng)因子缺陷A1 2 3 4 5A1AE5B2 6 7 8 9B6BC7C3 7 10 11 12C10BD8D4 8 11 13 14D13BE9E5 9 12 14 15E15CD11AB2CE12AC3DE14AD4第

22、三節(jié)工業(yè)微生物菌種的保藏一、菌種保藏的原理一、菌種保藏的原理二、菌種保藏的方法二、菌種保藏的方法三、保藏菌種的質(zhì)量控制三、保藏菌種的質(zhì)量控制四、菌種的退化與復壯四、菌種的退化與復壯一、菌種保藏的原理一、菌種保藏的原理 菌種保藏的目的在于提高菌種的存活率，減少變異，盡量保持菌種原來的優(yōu)良性能，便于研究和使用。 在菌種保藏工作中，首先要挑選優(yōu)良的純種，最好是休眠體（例如孢子和芽孢等），其次要創(chuàng)造最有利于菌種休眠的環(huán)境條件（例如低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑等），使微生物處于代謝不活潑、生長受抑制的休眠狀態(tài)，在一定時間內(nèi)得到保存。當需要使用所保藏的菌種時，可通過提供適宜的生長條件使保藏物恢復

23、活力。二、菌種保藏的方法二、菌種保藏的方法（一）斜面低溫保藏法（定期移植保藏法）（二）液體石蠟覆蓋保藏法（三）液氮超低溫保藏法（四）砂土管保藏法（五）冷凍干燥保藏法（一）斜面低溫保藏法（定期移植保藏法）1保藏方法將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至菌種生長完全后，置于4左右的冰箱中進行保藏。每隔一定時間再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，待生長完全后繼續(xù)保藏。一般來說，不產(chǎn)芽孢的細菌每月需移植1次，產(chǎn)芽孢的細菌3個月移植1次；放線菌、霉菌、酵母菌每36個月移植1次。2保藏原理斜面低溫保藏法主要是通過較低的溫度，減緩微生物菌種的代謝繁殖速率，降低突變概率。3適用范圍細菌、放線菌、霉菌、酵母菌的菌種都可以

24、采用這種方法進行保藏。4保藏期限不同種類的微生物保藏期不同，一般為16個月。5優(yōu)缺點方法簡單，便于操作，不需要特殊設備，并方便隨時觀察菌種的變異、退化、污染及死亡現(xiàn)象。但如果長期保藏則會由于頻繁移植傳代而增加菌種變異、退化及污染的概率，操作工作量也比較大。（二）液體石蠟覆蓋保藏法1保藏方法在已經(jīng)培養(yǎng)好的菌種斜面上，倒入經(jīng)12130分鐘滅菌處理后的化學純石蠟油，倒入的量以液面高出斜面末端10mm為宜。將斜面試管蓋好棉塞或膠塞，外面用薄膜密封后直立于4左右的冰箱中進行保藏。使用時，開封后倒去石蠟油，用無菌水洗滌斜面菌種12次即可。2保藏原理此法除了給保藏菌種提供了低溫條件之外，還創(chuàng)造了缺氧、防止培

25、養(yǎng)基中水分蒸發(fā)的環(huán)境，與單純低溫保藏相比保藏期大有提高。3適用范圍此法適用于酵母菌、霉菌、放線菌和好氧性細菌的保藏。4保藏期限不同種類的微生物保藏期不同，一般為110年。5優(yōu)缺點方法簡單，不需要特殊的設備，保藏期相對較長。但厭氧菌以及可以分解利用烴類的菌種，不適宜采用此種方法保藏。（三）液氮超低溫保藏法1保藏方法2保藏原理3適用范圍4保藏期限5優(yōu)缺點1保藏方法（1）準備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能在溫度突然變化時不致破裂。因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常選擇7510mm的，或能容1.2mL液體的。（2）制備菌懸液用滅過菌的冷凍保護劑（可選用10的甘油蒸餾水溶液或5

26、二甲亞砜蒸餾水溶液作為冷凍保護劑）洗下斜面試管中培養(yǎng)好的菌種細胞或孢子，制成菌種懸液。而對于不產(chǎn)孢子的真菌菌種而言，則可用無菌解剖刀或打孔器將培養(yǎng)好的平板培養(yǎng)物切成直徑510mm的小塊，連同瓊脂一起移入含有無菌保護劑的安瓿管中，制成菌種懸液。（3）分裝和熔封安瓿管用無菌吸管吸取0.5mL菌種懸液裝入無菌安瓿管中，封熔安瓿管口。（4）凍結將已封口的安瓿管以每分鐘下降1的慢速凍結至-35，使樣品完全凍結。（5）保藏將凍結至-35的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)保藏，溫度為-130至-196。（6）復活方法將安瓿管取出，立即放入3840的水浴中振蒎23分鐘進行

27、急劇解凍，直到全部融化為止。開啟安瓿管，將菌種移入適宜的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。2保藏原理 此法主要是將添加保護劑后的菌種控制在超低的溫度條件下，使微生物菌種的代謝繁殖處于完全停止的狀態(tài)，達到長期保藏的目的。3適用范圍 除了少數(shù)對低溫損傷敏感的微生物外，該法適用于各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。4保藏期限 保藏期因菌種異，一般可達到415年之久。5優(yōu)缺點 此法適用面廣，幾乎適合所有微生物的保藏。保藏期長，性狀比較穩(wěn)定，是目前所使用的各種保藏方法中較為理想的一種。但此法需要特殊設備，液氮消耗較多，操作費用較高。（四）砂土管保藏法1保藏方法2保藏原理3適用范圍

28、4保藏期限5優(yōu)缺點1保藏方法（1）制備砂土管將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質(zhì)，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質(zhì)，放入容器中用10%20%鹽酸浸泡。24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數(shù)次至中性，將沙子烘干或曬干。另取地面下400600mm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩,水洗至中性，烘干。將處理后的沙、土按質(zhì)量比2 1混合?；靹虻纳巴练盅b入保藏管中，高度為10mm左右，旋松管蓋，121濕熱滅菌30min。隨機抽取滅菌后的砂土管若干支，做無菌檢查。（2）制備斜面培養(yǎng)物將待保藏菌種接種于斜面培養(yǎng)基并培養(yǎng)。（3）制備菌懸液向培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)物中注入35mL無菌水，洗下細胞或孢子制

29、成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入砂土管中，每管0.20.5mL。放線菌和霉菌也可直接挑取孢子拌入砂土管中。（4）干燥真空抽去砂土管中水分。（5）保藏將砂土管用火焰熔封后，存放于低溫(46)干燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及純度?；?qū)⑸巴凉苤苯佑门Ｆぜ埢蛩芰霞埌?，置干燥器?nèi)保存。（6）復活方法無菌條件下打開砂土管，取部分砂土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，待長出菌落后再轉(zhuǎn)接一次。或取砂土粒于適宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接斜面。2保藏原理 此法主要為菌種創(chuàng)造了干燥、缺營養(yǎng)和低溫的環(huán)境，使菌種在相當長的時間內(nèi)維持其休眠狀態(tài)。3適用范圍 適宜耐干燥的菌種，像細菌的芽孢、放線菌和真菌的孢子

30、等。4保藏期限 保藏期因菌種而異，數(shù)年至數(shù)十年不等。5優(yōu)缺點 方法比較簡單，保藏時間長，恢復培養(yǎng)方便。但對干燥敏感的細菌不適宜選擇此法保藏。（五）冷凍干燥保藏法1保藏方法2保藏原理3適用范圍4保藏期限5優(yōu)缺點1保藏方法（1）選擇和準備保護劑可以選擇10%脫脂乳或10%蔗糖做保護劑，經(jīng)滅菌后備用。（2）準備菌種將所保藏菌種細胞在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至對數(shù)末期。（3）準備菌液用斜面培養(yǎng)物制備菌液時，取12mL保護劑，加到試管斜面培養(yǎng)物上，用較長的滴管輕輕涂擦斜面，制備均勻的細胞懸液，然后盡快分裝到安瓿管中。注意在制備懸液時，不宜泡沫過多或刺破瓊脂。用液體培養(yǎng)物制備菌液時，離心收集液體培養(yǎng)物中的菌體，

31、棄去上清液，加入保護劑（每毫升培養(yǎng)物加12ml保護劑）。將培養(yǎng)物與保護劑混勻，分裝安瓿管。（4）預凍將菌種放入70冰箱預凍。預凍速度控制在每分鐘下降1，使樣品凍結到3540。（5）冷凍干燥采用冷凍干燥機進行冷凍干燥。將預凍后的樣品迅速置于已充分預冷的冷凍干燥機樣品艙內(nèi)，關閉放氣閥，打開真空泵開始冷凍干燥，接近干燥完成時，適當升溫（按冷凍干燥機的具體要求進行操作），確認冷凍干燥完畢后，緩慢打開放氣閥，取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi)，冷凍干燥時間一般為820h。（6）保藏將凍干后的安瓿管真空熔封后，低溫避光保藏。（7）復活方法開啟安瓿管后，注入0.30.5ml無菌生理鹽水或1%的麥芽汁。搖勻后即成孢子

32、懸浮液，可接種于適宜該菌生長的斜面上適溫培養(yǎng)。需要特別注意的是開啟安瓿管時切忌猛烈割斷，以免空氣驟然沖入，導致污染。2保藏原理 此法為菌種提供了低溫、干燥、缺氧、添加保護劑等多種控制條件，使菌種得以長期保藏。3適用范圍 除了某些不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜采用些法保藏外，其他各類微生物均可采用此法。4保藏期限 保藏期一般可達十年以上。5優(yōu)缺點 此法在干燥時采用了冷凍升華的方式除去水分，手段比較溫和，細胞受損傷的程度相對較小，存活率及保藏效果均較好。此外，經(jīng)抽真空封閉的安瓿管保藏方式對于菌種的存放、郵寄、使用等均很方便，已被大多數(shù)專業(yè)的菌種保藏機構所采用。但采用此種方法保藏菌種需要一些專用設備，操作過

33、程相對較復雜。三、保藏菌種的質(zhì)量控制三、保藏菌種的質(zhì)量控制 凡是工業(yè)上使用的菌株，不論采用哪種保藏技術，都必須確保所保藏的菌株是合格的菌株。因此在進行保藏前，需要按照常規(guī)核對每一批新制備的欲保藏培養(yǎng)物的質(zhì)量并進行菌株純度的鑒定。以冷凍干燥法為例其具體的作法是將對欲保藏的菌種先取單個菌落接種于搖瓶中，觀察其生長狀況是否具有親代的特征與活力。再將培養(yǎng)成熟的搖瓶培養(yǎng)液制備成大量的冷凍安瓿管。然后從新制備的這一批冷凍干燥管中，至少抽出3%的樣品重新接種，測定其純度、活力和生產(chǎn)能力。只要測出其中任何一支安瓿管有變異，則這一批冷凍干燥管全部予以銷毀。只有通過這樣的質(zhì)量檢測，才能保證每一批保藏的菌株是可信并

34、可以保藏以備使用的。四、菌種的退化與復壯四、菌種的退化與復壯（一）菌種的退化現(xiàn)象（二）菌種退化的原因（三）防止退化的措施（四）退化菌種的復壯（一）菌種的退化現(xiàn)象 隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良遺傳性狀可能得到延續(xù)，也可能發(fā)生變異。變異有正突變和負突變兩種，其中負突變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失均稱為菌種的退化。 但是在生產(chǎn)實踐中，必須將由于培養(yǎng)條件的改變導致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。前者只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。（二）菌種退化的原因菌種退化的主要原因是有關基因的負突變。當

35、控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變，就會引起產(chǎn)量下降；當控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則會造成菌種產(chǎn)孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時，在群體中只有個別細胞發(fā)生負突變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采取有效措施而繼續(xù)移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，最后負突變個體占優(yōu)勢，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重的退化現(xiàn)象。因此，突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代次數(shù)，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的，

36、但對于一個經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞而言，發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細胞大得多。因此，細胞的代謝水平與基因突變關系密切。在菌種保藏過程中，應設法控制細胞保藏的環(huán)境，使細胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化。（三）防止退化的措施1控制傳代次數(shù)2選擇合適的培養(yǎng)條件3利用不同類型的細胞進行移種傳代4采用有效的菌種保藏方法1控制傳代次數(shù) 由于微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過程中發(fā)生而表現(xiàn)出來的。所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的概率。菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生突變的概率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產(chǎn)實踐上，必須嚴格控

37、制菌種的移種傳代次數(shù)，并根據(jù)菌種保藏方法的不同，確立恰當?shù)囊品N傳代的時間間隔。如采用斜面保藏的同時配合其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管保藏、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。2選擇合適的培養(yǎng)條件 例如用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌細黃鏈霉菌，可以防止它的退化。在赤霉菌產(chǎn)生菌藤倉赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天門冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質(zhì)時，也有防止菌種退化的效果。也有利用改變棲土曲霉的培養(yǎng)溫度（從2030提高到3034）來防止該菌產(chǎn)孢子能力的退化。3利用不同類型的細胞進行移種傳代 在有些微生物中，如放線菌和霉菌，由于其菌絲細胞常含有幾個核或異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)

38、不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實踐中發(fā)現(xiàn)構巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。4采用有效的菌種保藏方法 用于工業(yè)生產(chǎn)的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類性狀恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。（四）退化菌種的復壯1純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細胞分離出來，經(jīng)擴大培養(yǎng)恢復原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進行性能測定

39、則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經(jīng)培養(yǎng)恢復原菌株性狀。2通過寄主進行復壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應寄主體內(nèi)以提高菌株的活力。3聯(lián)合復壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的亞硝基胍聯(lián)合處理進行復壯。第四節(jié)微生物菌種的接種、分離與培養(yǎng)一、接種一、接種二、分離純化二、分離純化三、培養(yǎng)三、培養(yǎng)一、接種一、接種（一）接種工具（二）接種方法（一）接種工具 在實際工作中用得最多的接種工具是接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有針形、環(huán)形、刀形、耙形等。針形接種針常用于穿刺接種；刀形接種針多用于點植接種；環(huán)形的接種針則可適合其它的

40、大部分接種方法。但在日常工作中，人們往往習慣將接種針、接種鉤、接種環(huán)統(tǒng)稱為“接種針”。此外，滴管、吸管有時也可作為液體接種時的接種工具。在固體培養(yǎng)基表面將菌液均勻涂布時，還需要用到涂布棒。各種接種工具的形狀見圖2-5。圖2-5接種和分離工具（二）接種方法1斜面接種2液體接種3穿刺接種4點植接種5平板劃線接種6平板傾注接種7平板涂布接種8注射接種9活體接種1斜面接種（1）固液接種（2）液液接種（3）液固接種（1）固液接種貼標簽、點燃酒精燈、手持菌種及空白液體試管、旋松試管帽或棉塞、接種針滅菌、拔出試管帽或棉塞、取菌這幾步操作均與斜面接種操作相同，但液體試管傾斜時要注意角度，以免液體培養(yǎng)基流出。將

41、取有菌種的接種針送入液體試管中，將菌種涂抹在管壁內(nèi)側，搖勻即可。蓋試管帽或棉塞、接種結束工作均與斜面接種相同。（2）液液接種 這里指從液體培養(yǎng)物向液體試管或三角瓶中接種，接種工具一般用無菌移液管或滴管。用時先將移液管的包裹紙稍做松動，在其2/3長度處截開，加橡皮頭，拔出移液管，在火焰旁伸入菌種管（瓶）內(nèi)，吸取菌液，轉(zhuǎn)接到待接種的培養(yǎng)基內(nèi)。沾有菌的移液管插入原包裝紙?zhí)變?nèi)，經(jīng)高壓鍋滅菌后再行沖洗。（3）液固接種 這里指從液體培養(yǎng)物向斜面或平板培養(yǎng)基中接種。基本操作與前面介紹的接種方法大致相同，只是向斜面接種時取菌要用環(huán)狀接種針，向平板培養(yǎng)基中接種時可用環(huán)狀接種針，也可用移液管。3穿刺接種 此法常用

42、來保藏厭氧菌種或研究微生物運動性的接種。穿刺接種使用的接種工具是接種針。采用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。具體做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向試管底部作直線穿刺，然后將接種針原路退出。如某菌種具有鞭毛而能運動，經(jīng)穿刺接種培養(yǎng)后除了會沿穿刺線生長外，還會向穿刺線周圍漫延生長。因此穿刺接種法可以用來判斷微生物是否具有鞭毛。4點植接種 在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法是用刀狀接種針將少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點（也可采用一點或多點），以便使接入的細胞經(jīng)過生長繁殖后能各自獨立形成菌落，以便觀察、研究它們的形態(tài)。5平板劃線接種 在無菌條件下，取固體或液體培養(yǎng)物少許接種

43、在已經(jīng)鋪制的平板邊緩處，將多余的菌燒去，再用環(huán)狀接種針從接有菌種的部位在平板培養(yǎng)基表面做z字形劃線（或分區(qū)劃線）（圖2-7（a），經(jīng)培養(yǎng)后，可在沿劃線處長出菌落。（圖2-7（b）（a）（b）圖2-7平板劃線接種操作示意圖（a）平板劃線接種軌跡示意（b）平板劃線接種培養(yǎng)后圖示6平板傾注接種 此法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，達到稀釋接種的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)。如稀釋度選擇恰當，就可長出單個菌落。7平板涂布接種 與傾注接種略有不同，此法是先鋪好平板，讓其凝固，然后再將一定濃度及數(shù)量的菌液倒在平板上面，迅速用涂布棒在表面涂抹，使菌液均勻分布。經(jīng)培養(yǎng)后，如稀釋度合適就可長出單個菌落。8注射接種 此法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，就是采用注射接種。9活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物，也可以是某個離體活組織，例如猴腎等，也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。二、分離純化二、分離純化1.平板劃線法2.傾注平板法3.涂布平板法4.富集培養(yǎng)法5.厭氧法1.平板劃線法 平板劃線法是最簡單、最常用的微生物分離方法。用無菌的接種環(huán)取培