蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)復(fù)習(xí)整理筆記

1、蛋白質(zhì)分子基礎(chǔ)題型：名詞解釋5-6個簡答題4個問答和計算3個問答肯定有一題是實驗設(shè)計有一題是蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定附加題目錄第一章緒論氨基酸1第二章蛋白質(zhì)制備4第三章蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定 10第四章蛋白質(zhì)的化學(xué)修15第五章肽的人工合成17第六章蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象 17第七章蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 19每章需掌握的知識（P.S結(jié)合了老師最后一節(jié)課的內(nèi)容，但最好不要只按照這個來復(fù)習(xí)，有空一定要看PPT看書；否則掛了可不要怪我哦?。┑谝徽戮w論氨基酸常見20種氨基酸及其疏水性、親水性、帶電性、代號、旋光性、等電點疏水性、親水性:親水性（極性R基）不帶電荷絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺帶

2、電何 （強親水性）（堿性）帶正電賴氨酸、精氨酸、組氨酸（酸性）帶負電天冬氨酸、谷氨酸（懷疑PPT的天冬酰胺、谷氨酰胺上打錯）疏水性（非極性R基）丙氨酸（R基的疏水性最?。⒗i氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸甘氨酸：R基為-H，可算作疏水性氨基酸，又可以劃到親水性氨基酸。甘氨酸的a-碳不是手性碳，故沒有旋光性。不帶電荷的極性 R基氨基酸：帶有-OH（Ser、Thr、Tyr ）、-SH（Cys）、酰胺基（Asn、Gin）代號:甘氨酸Gly脯氨酸Pro蘇氨酸Thr天冬氨酸Asp丙氨酸Ala苯丙氨酸 Phe半胱氨酸 Cys谷氨酸Giu纈氨酸Vai酪氨酸Tyr甲硫氨酸 Met

3、賴氨酸Lys亮氨酸Leu色氨酸Trp天冬酰胺 Asn精氨酸Arg異亮氨酸lie絲氨酸Ser谷氨酰胺Gin組氨酸His名詞解釋：必需氨基酸：8種，體內(nèi)不能合成，必須由食物中的蛋白質(zhì)供給。非必需氨基酸：12種，只要有氮元素存在人體就能自己制造，組成人體蛋白質(zhì)的重要成份, 而且保持一定比例。半必需氨基酸：人體合成速度慢，不能滿足人體需求。氨基酸的等電點：氨基酸分子中所含的 一NH3+和一C00 數(shù)目正好相等，凈電荷為0時的 環(huán)境pH值即為氨基酸的 等電點，簡稱pl。氨基酸等電點的計算：側(cè)鏈不帶電荷中性氨基酸，其等電點是它的pKi和pK2的算術(shù)平均值：酸性氨基酸：pl = (pKi+ pK2 )/2(

4、這個是對于含有 3個可解離基團的氨基酸來說的，可以看下面的方法)堿性氨基酸：pl = (pKi + pKR coo-)/2(這個是對于含有 3個可解離基團的氨基酸來說的，可以看下面的方法)pl = (pK2 + pKR- NH2 )/2對于含有3個可解離基團的氨基酸 來說，只要依次寫出它從酸性經(jīng)過中性至堿性溶溶解高過 程中的各種離子形式，然后取兩性離子兩側(cè)的pK值的算術(shù)平均值，即可得其 pl值。步驟：由PK 值判斷解離順序，總是 PK1 PK2 PK3 ，即誰的PK 值小，誰就 先解離。按照解離順序正確寫出解離方程式：簡式，注意解離基團的正確寫法。找出呈電中性的物質(zhì)，其左右PK值的平均值就是氨

5、基酸的等電點：PI =( PK左+PK 右)/2,C00ASPCQOHCOOCOOHC _CHjItCOOHASP1cod二2P0 _ i.88 + 3 65_,_2 2舉例：1半胱氨酸 pK1( a -COO-)=1.96 ,pK2(R-SH)=8.18 , pK3( a -NH3+)=10.28，該氨基酸 pl 值為：A.5.07B.6.12C.6.80D.7.68E.9.232賴氨酸 pK1( a -COO-)=2.18 , pK2( a -NH3+)=8.95 , pK3(R-NH3+)=10.53，該氨基酸 pI 值 為：A. (pK1+ pK2)/2B. (pK2+ pK3)/2

6、C. (pK1+ pK3)/2D. (pK1+ pK2+ pK3)/3E. (pK1+ pK2+ pK3)/23 .天冬氨酸 pK1( a -COO-)=1.96 , pK2( a -COO-)=3.65 , pK3( a -NH3+)=9.60，該氨基酸 pl 值為：A.2.8B.3.65C.5.74D.6.62E.7.51旋光性：從蛋白質(zhì)溫和水解得到的a-氨基酸都是L型的。D-丙氨酸存在于昆蟲的幼蟲和蛹中。D-亮氨酸存在于短桿菌肽中。在細菌中發(fā)現(xiàn)了許多D-型的非蛋白質(zhì)氨基酸D-谷氨酸和D-丙氨酸存在與細菌細胞壁的肽聚糖中。甘氨酸的a-碳不是手性碳，故沒有旋光性。光吸收：220-300nm

7、: Tyr、Phe、Trp苯丙 Phe 的 max = 257nm酪 Tyr 的 max = 275nm色 Trp 的 max = 280nm蛋白質(zhì)的生物學(xué)/行使的功能：新陳代謝的催化劑-酶。有機體的結(jié)構(gòu)成分。儲藏氨基酸 的功能。運輸功能。激素的功能。免疫的功能。接受和傳遞信息作用功能。調(diào)節(jié)或者控制功能。第二章 蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)分離純化的一般程序及其注意事項1. 生物組織的機械破碎 :研磨法、超聲波法、凍融法和酶解法等（細胞外分泌物無需破碎 ）。2. 根據(jù)蛋白質(zhì) 的特性，選擇不同的溶劑進行 抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提， 酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。3. 離心

8、 :去亞細胞顆粒、細胞碎片等4. 粗提: 離心除去固體雜質(zhì)后， 可通過沉淀法、 超濾法、 萃取法等處理， 得到蛋白質(zhì)粗制品。5. 精制 ：可用層析法、電泳法等進行精制。6. 結(jié)晶 ：取得蛋白質(zhì)晶體并測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)。注意事項：動物組織 和器官要盡可能 除去結(jié)締組織 和脂肪 。制備 植物細胞 時，在緩沖液中 加入聚乙烯吡咯啉酮 （PVP） 可以減少褐變 , 它可以吸附多酚化 合物。革蘭氏陽性菌 可用溶菌酶消化 ，37oC 處理 15 分鐘即可溶解細胞壁。革蘭氏陰性菌 較難消化?？上?用非離子去污劑 （如 Triton X-100 ）、 巰基乙醇或甘油處理細 胞。在溶液中還可加入 脫氧核糖核酸酶

9、I （10 ug/mL ），可以使溶液的黏度降低，可以 提高 抽提液的質(zhì)量 。膜蛋白的釋放：外周蛋白通過 靜電力或共價鍵 和外膜脂質(zhì)的極性頭部螯合在一起。 占膜蛋白的 2030%內(nèi)在蛋白（固有蛋白）嵌合 在膜脂雙層結(jié)構(gòu)中。 大部分膜蛋白是固有蛋白外周蛋白的分離：改變離子強度； 金屬螯合劑（ EDTA ）可將其抽提出來內(nèi)在蛋白的提?。?提取的原則 抽提膜蛋白時，首先 削弱膜蛋白和膜脂的疏水結(jié)合 ，同時 保持疏水基暴露在外 的天然狀態(tài)。 此過程叫做 增溶 作用。常用的增溶劑是去污劑 ，它可以使膜蛋白疏水部分與膜分離， 同時保留住膜蛋白表面的疏水 結(jié)構(gòu)。用去污劑增溶之后，膜蛋白要 用透析的方法除掉去

10、污劑 ，再進行其他方法的分離純化。鹽析的概念是一種向蛋白質(zhì)溶液中加入濃的鹽溶液使蛋白質(zhì)變性的方法。鹽溶：一般在低鹽濃度下 隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加。鹽析：當鹽濃度繼續(xù)升高 時，蛋白質(zhì)的 溶解度不同程度 下降并先后析出。原因：將大量鹽加 到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的S04和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的沉淀。課件重點補充：膜蛋白破碎的主要方法：膜蛋白的釋放，上面有。蛋白質(zhì)脫鹽：透析法（注：用前在含 EDTA的溶液中煮-除去核酸酶和蛋白酶）；纖維過濾透析法；中空纖維超濾膜分子篩層析法；Sepha

11、dex G-25蛋白質(zhì)濃縮：沉淀法：用鹽析法或者有機溶劑法將蛋白質(zhì)沉淀，再將沉淀溶于少量溶液中；吸附到離子交換柱上，然后用少量鹽洗脫；干燥吸附法：用固體吸附劑如Sephadex G25等，凍干法，真空干燥法；滲透濃縮法：將干粉 PEG-20000涂在裝有蛋白質(zhì)溶液的透析袋上，可吸干水分； 超濾濃縮法：用超濾膜濾去小分子和水，達到超濾的目的。使蛋白質(zhì)沉淀的主要方法及其原理（重點:鹽析方法）鹽析法（上面有）；有機溶劑法：原理：1增大帶電質(zhì)點之間的靜電力。2破壞蛋白質(zhì)表面的水合層，使蛋白質(zhì)分子脫水而沉淀。有機聚合物沉淀法；（作用原理與有機溶劑類似）選擇性變性沉淀法：適用于提取一些耐極端環(huán)境的蛋白質(zhì)。

12、用一些極端條件，使非目標蛋白質(zhì)變性析出，從而將目的蛋白質(zhì)純化。主要方法有：熱變性；pH變性（包括等電電變性）；有機溶劑變性。非特異性層析的原理、方法（如何平衡、如何吸附、如何洗脫）吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾層析離子交換層析原理:根據(jù)蛋白質(zhì)分子所帶 電荷的不同 來達到分離的目的解離離子帶負電，結(jié)合 陽離子（蛋白質(zhì)分子），稱為陽離子交換柱。解離離子帶正電，結(jié)合 陰離子（蛋白質(zhì)分子），稱為陰離子交換柱。步驟：（處理介質(zhì)-裝柱-上樣-洗滌-洗脫-介質(zhì)再生）方法：平衡：電荷量越大，結(jié)合越牢，在柱中移動速度越慢；電荷不同，親和力不同洗脫：帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合可逆。通常，用鹽梯度和pH梯度可把

13、吸附的蛋白質(zhì)從柱上洗脫下來其他：離子交換的支持物纖維素：具有松散的親水性網(wǎng)絡(luò)，較大的的表面積、吸附容量大，通透性好。葡聚糖凝膠：既有 離子交換劑的性質(zhì)，又有分子篩效應(yīng)。 瓊脂糖凝膠：吸附容量大，能維持較好的 流速和分辨率。習(xí)題1 :三個氨基酸(Leu,Asp,Lys )的混合物，經(jīng)過一個陽離子交換樹脂粒，用pH5的緩沖液洗脫，洗脫液中氨基酸出現(xiàn)的順序是A . Asp,Leu,Lys; B. Leu,Asp,Lys; C . Lys,Leu,Asp;D. Leu,Lys,Asp解：Leu 0,Asp -,Lys +Asp Leu Lys自己做的，不知道對不對習(xí)題2 :有以下4種蛋白質(zhì)的混合物：(

14、1) pI=10 ; ( 2) pI=4 ; ( 3) pl=8.6 ; ( 4) pI=5.若不 考慮其它因素，當它們流過 DEAE-纖維素陰離子交換柱，用線性鹽梯度洗脫時 ，這些蛋白質(zhì) 的洗脫順序如何，并具體說明其原因。答案:在離子交換柱上，帶更多負電的吸附能力更強。四種蛋白質(zhì)PI值的順序為1342。因此，在某種pH值下，所帶電荷由正到負的順序為1342。因此，洗脫出現(xiàn)的先后順序就是 1342。凝膠過濾層析原理：根據(jù)分子量的大小 不同而達到分離的目的。載體是一種多孔的凝膠。分子直徑比凝膠孔徑大的分子，不能進入凝膠顆粒的微孔中，其他分子由大到小先后從凝膠中流出。疏水層析(吸附層析)原理：根據(jù)

15、蛋白質(zhì)分子 疏水性的不同而達到蛋白質(zhì)分離的目的。在不帶電的載體上偶聯(lián)上疏水基團形成疏水吸附劑，將帶有非極性的 生物活性物質(zhì) 吸附在一起，然后改變層析條件， 減弱疏水作用，將吸附物質(zhì)解離下來。洗脫：改用低濃度的鹽；降低離子強度；加乙二醇。在洗脫也中加去污劑；增加洗脫pH。從高到低的NaCI濃度梯度洗脫；或由高到低的鹽濃度加由低到高的乙二醇濃度梯度洗脫。注意： 離子交換：低鹽吸附，高鹽洗脫疏水層析：高鹽吸附，低鹽洗脫親和層析的原理、步驟、作用力、專一性洗脫、非專一性洗脫 原理：根據(jù)特定蛋白質(zhì)對某種的 生物專一性 來進行分離。作用力：專一性親和力，在一定條件下緊密地形成復(fù)合物。步驟：？洗脫：非專一性

16、洗脫改變緩沖液的離子強度 或者pH或者介電系數(shù)。使吸附的大分子的 構(gòu)象發(fā)生改變，以 降低其與配體之間的親和力，將吸附的大分子從層析柱上洗脫下來。專一性洗脫選用與配體結(jié)合能力更大物質(zhì)的洗脫液。eg.底物配體：底物類似物、酶抑制劑等幾種特殊的親和層析：免疫親和層析：根據(jù)生物大分子的 抗原決定部位 與其抗體的結(jié)合部位 之間專一性相互作用進行層析的技術(shù)。共價親和層析： 層析材料進與樣品中的一個成分發(fā)生專一性共價反應(yīng)，使其保留在層析材料上。分離過程是依靠共價鍵的形成和斷裂來實現(xiàn)的。固定化金屬離子親和層析： 利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價金屬離子發(fā) 生螯合作用，結(jié)合在固定相上， 二價金屬離

17、子可以與流動相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪 唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。實驗設(shè)計（如何用親和層析分離純化蛋白酶）1前處理： 去脂肪、結(jié)締 加酸化水搗碎 勻漿，提取 過濾，濾液調(diào)pH 過濾，濾液調(diào)pH，激活 調(diào)至pH，過濾，保存2、配體： 粗提 雞卵類粘蛋白 離子交換層析精分離 透析除鹽 析出，干燥3、親和層析： 抑制劑（雞卵類粘蛋白）偶聯(lián)至載體（凝膠） 裝柱 上樣 洗脫附參考資料：親和層析法純化胰蛋白酶操作步驟（一）載體一SePharose4B的活化1環(huán)氧氯丙烷活化法：取適量的sepharose 4B,于G3玻璃燒結(jié)漏斗（簡稱G3漏斗）上抽去保護液。稱 1

18、0g（濕重）Sepharose 4B,用100mL0.5mol/L 氯化鈉溶液淋洗， 除去56Pha rose 4S凝膠內(nèi)的保護劑， 用蒸餾水洗凈，轉(zhuǎn)移到100mL的錐形瓶內(nèi)。然后加入 6.5mL 2.0moL/ L氫氧比鈉溶液、1.5mL環(huán)氧氯丙烷、15mL 56 % 1 , 4二氧六環(huán)，于45 C的恒溫水浴搖床內(nèi)振蕩活化2小時。然后將活化的凝膠轉(zhuǎn)移到G3漏斗內(nèi)抽干，用蒸餾水洗至 pH8.0左右，再用20mL 0.1mol/L ,pH9.5碳酸鈉緩沖液淋洗。處理完畢后立即偶聯(lián)。2.溴化氰活化法：稱取10g Sepharose 4B（濕重），凝膠處理方法與 1相同，把 SePharose 4B

19、凝膠轉(zhuǎn)移到一個 100mL的燒杯中（以下操作步驟必須在通風櫥內(nèi)進行）。加入15mL 0.2mol/LpH10.0的碳酸鈉緩沖液，然后將燒杯放置冰浴中，用電磁攪拌器慢慢攪拌。戴上膠皮手套，小心稱取3g溴化氰，加入3mL乙腈將溴化氰溶解。取一支滴管向燒杯內(nèi)滴加溴化氰使它與Sepharose 4B反應(yīng)，同時取另一支滴管向燒杯內(nèi)滴加6mol/L的氫氧化鈉.使反應(yīng)體系的pH值保持在pH10.0左右（在酸度計上校正），待溴化氰加完以后繼續(xù)攪拌，反應(yīng)5分鐘。此時反應(yīng)體系的 pH值不再下降，仍維持在pH10.0左右，停止反應(yīng)。迅速轉(zhuǎn)移到G3漏斗內(nèi)抽濾，抽濾瓶內(nèi)應(yīng)預(yù)先加入一定量的固體硫酸亞鐵，以破壞濾液中未反應(yīng)

20、的溴化氰。用200mL預(yù)冷的蒸餾水淋洗，最后浸泡在20mL0.1mol/LpH9.5，碳酸鈉緩沖液中，處理完成后立即偶聯(lián)。3 配基一雞卵類粘蛋白的偶聯(lián)：將已經(jīng)活化處理好的 Sepharose 4B轉(zhuǎn)移到一個50mL的錐形瓶內(nèi)。然后取 IOmL0.1mol/L ， pH 9.5的碳酸鈉緩沖液將約 150mg的雞卵類粘蛋白溶解，取出0.1mL蛋白溶液稀釋30倍，在紫外分光光度儀上測定A280。根據(jù)消光系數(shù) A = 4.13計算出偶聯(lián)前的蛋白含量。再將9.9mL蛋白溶液加入到盛有活化Sepharose 4B的三角瓶內(nèi)，混勻，在 40 45C的恒溫水浴搖床內(nèi)振蕩偶聯(lián)20 24小時左右，終止偶聯(lián)。將凝膠

21、轉(zhuǎn)移到G3漏斗內(nèi)，用100mL 0.5mol/L的氯化鈉溶液抽濁、淋洗，以除去未被偶聯(lián) 的雞卵類粘蛋白。取一個干凈的抽濾瓶收集濾波，測定濾液A280 ,計算出末被偶聯(lián)蛋白的量，然后用100mL的蒸餾水洗，用 50mL 0.1mol/L甲酸0.5mol/L氯化鉀，pH2.5甲酸混 合液洗，最后用蒸餾水洗至約 pH6.5即可。將凝膠轉(zhuǎn)移至50mL小燒杯內(nèi)，用30mL 0.5mol/L 氯化鉀一0.05mol/L氯化鈣0.1mol/L、pH7.8Tris HCL緩沖液浸泡20分鐘。脫氣后裝柱或 置4 C冰箱保存。（二）胰蛋白酶粗操液的制備取50g豬新鮮胰臟（除去脂肪和結(jié)締組織）剪碎置于高速 組織搗碎

22、機內(nèi)，加入200mL預(yù)冷的 pH2.53.0的乙酸酸化水，勻漿。于10C提取4小時以上，4層紗布過濾，收集濾液 并用5mol/L 的氫氧化鈉調(diào)至PH8.0，加入終濃度為0.1mol/L氯化鈣及12mg胰蛋白酶晶種，置 4C激 活1216小時或在室溫（25 C左右）激活24小時。待胰蛋白酪比活達到 10001500 BAEE單 位/ mg以后，用6mol/L硫酸調(diào)至pH3.0停止激活。放置4 C冰箱內(nèi)備用。測定胰蛋白酶活性。（三）親和層析純化胰蛋白酶取一支層析柱（10mm x 100mm），裝入少量親和柱平衡液（0.5mol/L氯化鉀一0.05mol/L氯化鈣0.1mol/L , pH7.8 T

23、ris HCl緩沖液），將親和吸附劑一次裝入柱內(nèi)，待親和吸附劑自然沉 降至約1/2總體積后，調(diào)節(jié)合適的流速。用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質(zhì)檢測儀檢測流 出液.待基線達到穩(wěn)定后即可。取一定體積的蛋白酶粗提液 （30 50mL，視酶液的蛋白濃度及比活而定）調(diào)至pH8.0 .用濾紙過濾，取濾液上柱吸附，然后用親和柱平衡液平衡。用核酸蛋白質(zhì)檢測儀檢測流出液，待基線達到穩(wěn)定后改用親和柱洗脫液 （0.1mol/L甲酸一0.5mol/L氯化鉀，pH2.5混合液）洗脫。收 集洗脫峰2,測定酶蛋白含量及活性，層析圖譜，如圖圖3 9親和層析純化胰蛋白酶洗脫曲線平衡液：0.5mol/L 氯化鉀，0.05mol/L

24、 氯化鈣，0.1mol/L , pH7.8Tris-HCI 緩沖液。洗脫液：0.1mol/L甲酸，0.5mol/L氯化鉀，pH2.5混合液。（四）胰蛋白酶的保存經(jīng)親和層析分離得到的胰蛋白酶，一般是比較純的酶， 但是酶蛋白的濃度往往很低。通?？捎胮H5.0的乙酸透析除去溶液中的無機鹽，然后冰凍干燥成粉末， 長期保存。也可將酶溶液放在20C的冰箱冰凍保存或者在 4C, pH3.0的酸性溶液中保存，可保存兩年左右。蛋白質(zhì)電泳的牽引力（遷移率）與什么有關(guān)系蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)：分子的 電荷、大小和形狀。電場：與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度： 緩沖液離子強度 增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減

25、緩。 支持介質(zhì)：紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。為什么SDS-PAGE電泳只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)系在蛋白質(zhì)中加入摩爾比為 1.4： 1（SDS:蛋白質(zhì)）的SDS（十二烷基硫酸鈉）。使所有蛋白質(zhì)都帶 上負電。SDS是陰離子去污劑，能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，并且把大部分蛋白質(zhì)拆成組成他的亞基形式。在上樣緩沖液中加入 巰基乙醇，可以使二硫鍵還原為巰基。使不同的蛋白質(zhì)分子的短軸一致，長軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白質(zhì)電泳的速度不再取決于蛋白質(zhì)的電荷與形狀，只與蛋白質(zhì)的分子量有 關(guān)。自己補充：PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類 ，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖

26、液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于 緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。注意：電泳結(jié)果顯示的只是亞單位的大小，同時蛋白質(zhì)也會失去原來的活性。有些蛋白質(zhì)不能用 SDS-PAGE測定分子量（某些糖蛋白以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白）3種電泳（等電聚集電泳、雙向電泳、免疫印跡法）的概念等電聚集電泳（精細，適用分析鑒定，抵消擴散使富集，不適用于等電點處沉淀變性蛋白） 書上：利用某些兩性電解質(zhì)支持物在電場中形成pH梯度，使蛋白質(zhì)樣品在與

27、它們等電點相應(yīng)的pH區(qū)域集中，等電點不同的蛋白質(zhì)泳動后形成位置不同的區(qū)帶而得到分離。雙向電泳由第一向等電聚焦（IEF）電泳和第二向SDS-PAGE組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分 離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。免疫印跡法蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上， 然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。蛋白質(zhì)結(jié)晶的原理以及其與鹽析有何區(qū)別原理：蛋白質(zhì)溶液在合適的過飽和狀態(tài)，溶質(zhì)分子通過擴散、旋轉(zhuǎn)、碰撞等運動形式，可以形成晶 核。溶質(zhì)分子以相互碰撞的作用方式有序而反復(fù)地堆砌在晶核上， 直到晶核成長到晶

28、體， 最 后從溶液中析出。與鹽析有何區(qū)別： 蛋白質(zhì)的結(jié)晶無選擇性，要求純度高，對其他條件相對要求多，反復(fù)結(jié)晶目的是純化； 鹽析也是利用蛋白質(zhì)結(jié)晶的原理， 但是其目的主要是用于分離蛋白質(zhì)， 且要求蛋白質(zhì)濃度不 能過高，否則容易出現(xiàn)多種蛋白質(zhì)共沉淀。個人補充：蛋白質(zhì)的定量定氮法測量蛋白質(zhì)含量：蛋白質(zhì)含量（每克）=每克生物樣品中含氮的克數(shù) X 6.25雙縮脲法：雙縮脲反應(yīng)形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，540 nm處進行比色測定。（此反應(yīng)為肽及蛋白質(zhì)特有的，而為氨基酸所沒有的一個顏色反應(yīng)）紫外吸收法（略） 蛋白質(zhì)的純度標準的檢測 電泳、層析、蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)分析等第三章 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定

29、的基本方法和基本策略一級結(jié)構(gòu)（序列）測定的基本方法：將肽段用 不同方法專一性地切斷 ,將得到的肽段分離純化之后 ,分別測出 各自的 序列 。再將不 同方法得到的序列進行 比對 ，就可以得到肽鏈的一級結(jié)構(gòu)。序列測定一般步驟：純度要求 :純度在 97%以上。雙向電泳；凝膠電泳；N-末端測定；純化至恒定酶活；肽譜分析。分子量測定 多肽鏈的組成，二硫鍵的斷裂。蛋白質(zhì)的氨基酸的組成。蛋白質(zhì)的配基蛋白質(zhì)的端基分析 進行正常的序列測定蛋白質(zhì)的水解：酸水解：Trp被沸酸完全破壞；有-OH的Ser或Thr小部分被分解； Asn和Gin側(cè)鏈的酰胺 基t -COOH ;不容易引起水解產(chǎn)物的消旋化。堿水解： 水解產(chǎn)物

30、發(fā)生消旋化， 許多氨基酸都受到不同程度的破壞， Trp 在水解中不受破壞。 磺酸水解：環(huán)境需中性，條件苛刻，水解液碳水化合物較多時，色氨酸易被破壞；中性水解 液可以直接上機，色氨酸穩(wěn)定。酶水解：水解不穩(wěn)定的氨基酸；不容易徹底水解，酶自溶污染產(chǎn)物。序列檢測：生化上的濃縮筆記有的濃縮得我自己也看不懂了除胱氨酸和酪氨酸外，都能溶于水中。脯氨酸還能溶于乙醇或乙醚中。 除甘氨酸外，a -氨基酸都有旋光性，a -碳原子具有手性。蘇氨酸和異亮氨酸有兩個手性碳原子DNFB反應(yīng)N-末端產(chǎn)物黃色紫外吸收:F:257nm, =200（丙）;Y:275nm, =1400（酪）;W:280nm, =5600（色） 氨基

31、酸與茚三酮在微酸溶液加熱，生成藍色物質(zhì)，而脯氨酸生成黃色化合物DNS-Cl反應(yīng)，生成 DNS-氨基酸有強熒光，激發(fā)波長在360nm異硫氰酸苯酯PITC法剩下的肽鏈完整，可重復(fù)測定新生的N末端氨基酸肼解法：無水加熱，斷所有肽鍵，除C端氨酸外，精變鳥/半胱/天冬/谷氨破壞 羧肽酶法：羧肽酶A水解除精/賴/脯外所有肽鍵，羧肽酶B水解精/賴 拆二硫鍵：過量巰基乙醇，再碘乙酸保護生成的半胱氨酸的巰基防再氧化胰蛋白酶：賴-精氨酸的羧基肽鍵，生成肽段C末端是賴或精氨酸。丫丙啶可增加酶切位點（半胱氨酸）；用馬來酸酐（順丁烯二酸酐）保護賴氨酸的側(cè)鏈氨基，或用 1,2-環(huán)己二酮修飾精氨酸的胍基，可減少酶切位點。

32、糜蛋白酶：苯丙/酪/色氨酸等疏水殘基的羧基形成的肽鍵溴化氰：斷裂甲硫氨酸的羧基肽鍵甲硫氨酸殘基變?yōu)?C末端高絲氨酸殘基 胃蛋白酶：疏水殘基之間的肽鍵/嗜熱菌蛋白酶：疏水殘基的氨基形成的肽鍵 金葡菌蛋白酶/谷氨酸蛋白酶/V8蛋白酶：谷氨酸/天冬氨酸的羧基形成的肽鍵， 受緩沖液影響：醋酸緩沖液中只水解谷氨酸，磷酸緩沖液中還可水解天冬氨酸 梭狀芽孢桿菌蛋白酶：精氨酸羧基形成的肽鍵，又稱精氨酸蛋白酶。凝血酶：Arg-Gly肽鍵/羥胺:Asn-Gly,但Asn-Leu和Asn-Ala也能部分裂解 以上方法中，酶不能水解脯氨酸參與形成的肽鍵。引文：以下供額外閱讀理解 三、一級結(jié)構(gòu)的測定（一）一級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)

33、的一級結(jié)構(gòu)是指肽鏈的氨基酸組成及其排列順序。氨基酸序列是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，它決定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)可用氨基酸的三字母符號或單字母符號表示，從N-末端向C-末端書寫。采用三字母符號時，氨基酸之間用連字符（-）隔開。（二）測定步驟測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，要求樣品必須是均一的（純度大于97 %）而且是已知分子量的蛋白質(zhì)。一般的測定步驟是：1. 通過末端分析確定蛋白質(zhì)分子由幾條肽鏈構(gòu)成。2將每條肽鏈分開，并分離提純。3. 肽鏈的一部分樣品進行完全水解，測定其氨基酸組成和比例。4. 肽鏈的另一部分樣品進行 N末端和C末端的鑒定。5. 拆開肽鏈內(nèi)部的二硫鍵。6. 肽鏈用酶促或化學(xué)的部分水解方法降

34、解成一套大小不等的肽段，并將各個肽段分離岀來。7. 測定每個肽段的氨基酸順序。8. 從第二步得到的肽鏈樣品再用另一種部分水解方法水解成另一套肽段，其斷裂點與第五步不同。分離肽 段并測序。比較兩套肽段的氨基酸順序，根據(jù)其重疊部分拼湊岀整個肽鏈的氨基酸順序。9. 測定原來的多肽鏈中二硫鍵和酰胺基的位置。（三）常用方法1. 末端分析（1）N末端蛋白質(zhì)的末端氨基與 2,4-二硝基氟苯（DNFB）在弱堿性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白質(zhì)（ DNP蛋白質(zhì)）。 產(chǎn)物黃色，可經(jīng)受酸性 100C高溫。水解時，肽鏈斷開，但 DNP基并不脫落。DNP氨基酸能溶于有機溶劑（如乙醚）中，這樣可與其他氨基酸和-DNP賴氨酸

35、分開。再經(jīng)雙向濾紙層析或柱層析，可以鑒定黃色的DNP氨基酸。丹磺酰氯法是更靈敏的方法。蛋白質(zhì)的末端氨基與5-（二甲胺基）萘-1-磺酰氯（DNS-CI）反應(yīng)，生成DNS蛋白質(zhì)。DNS氨基酸有強熒光，激發(fā)波長在360nm左右，比DNFB法靈敏100倍。目前應(yīng)用最廣泛的是 異硫氰酸苯酯（PITC）法。末端氨基與PITC在弱堿性條件下形成相應(yīng)的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中與酸作用發(fā)生環(huán)化，生成相應(yīng)的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物而從肽鏈上掉下來。產(chǎn)物可用氣-液色譜法進行鑒定。 這個方法最大的優(yōu)點是剩下的肽鏈仍是完整的，可依照此法重復(fù)測定新生的N末端氨基酸?，F(xiàn)在已經(jīng)有全自動的氨基酸順序分析儀，可測定含20個

36、以上氨基酸的肽段的氨基酸順序。缺點是不如丹磺酰氯靈敏，可與之結(jié)合使用。N末端氨基酸也可用酶學(xué)方法即氨肽酶法測定。（2）C末端a）C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的a氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。有斷裂干擾。b）另一個方法是肼解法。多肽與肼在無水條件下加熱，可以斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼解下來的C末端氨基酸可用紙層析鑒定。精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。c）也可用羧肽酶法鑒定。將蛋白質(zhì)在 pH 8.0, 30 C與羧肽酶一起保溫，按一定時間間隔取樣，用紙層析測定釋放岀來的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時間的關(guān)系，就可以知道

37、C末端氨基酸的排列順序。 羧肽酶A水解除精氨酸、賴氨酸和脯氨酸外所有肽鍵，羧肽酶B水解精氨酸和賴氨酸。2. 二硫鍵的拆開和肽鏈的分離一般情況下，蛋白質(zhì)分子中肽鏈的數(shù)目應(yīng)等于N末端氨基酸殘基的數(shù)目，可根據(jù)末端分析來確定一種蛋白質(zhì)由幾條肽鏈構(gòu)成。必須設(shè)法把這些肽鏈分離開來，然后測定每條肽鏈的氨基酸順序。如果這些肽鏈之間 不是共價交聯(lián)的，可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑處理蛋白質(zhì)，把肽鏈分開。如果肽鏈之間以二硫 鍵交聯(lián)，或肽鏈中含有鏈內(nèi)二硫鍵，則必須用氧化或還原的方法將二硫鍵拆開。最普遍的方法是用過量的巰基乙醇處理，然后用碘乙酸保護生成的半胱氨酸的巰基，防止重新氧化。二硫鍵拆開后形成的個別肽鏈，

38、可用紙層析、離子交換柱層析、電泳等方法進行分離。3. 肽鏈的完全水解和氨基酸組成的測定。在測定氨基酸順序之前，需要知道多肽鏈的氨基酸組成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分 離測定氨基酸。目前用氨基酸自動分析儀，2-4小時即可完成。蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組 成相差很大。4. 肽鏈的部分水解和肽段的分離當肽鏈的氨基酸組成及 N末端和C末端已知后，隨后的步驟是肽鏈的部分水解。這是測序工作的關(guān)鍵步驟。這一步通常用專一性很強的蛋白酶來完成。最常用的是胰蛋白酶（trypsin ），它專門水解賴氨酸和精氨酸的羧基形成的肽鍵，所以生

39、成的肽段之 一的C末端是賴氨酸或精氨酸。用丫丙啶處理，可增加酶切位點（半胱氨酸）；用馬來酸酐（順丁烯二酸酐） 保護賴氨酸的側(cè)鏈氨基，或用1,2-環(huán)己二酮修飾精氨酸的胍基，可減少酶切位點。經(jīng)常使用的還有糜蛋白酶，水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘基的羧基形成的肽鍵。其他疏水 殘基反應(yīng)較慢。用溴化氰處理，可斷裂甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵。水解后甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)镃末端高絲氨酸殘基。以上三種方法經(jīng)常使用。胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶。前者水解疏水殘基之間的肽鍵，后者水解疏水殘基的氨基形成的肽鍵。金葡菌蛋白酶，又稱谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽鍵，但受緩沖液影響。在醋酸緩沖液中

40、只水解谷氨酸，在磷酸緩沖液中還可水解天冬氨酸。梭狀芽抱桿菌蛋白酶， 水解精氨酸羧基形成的肽鍵，又稱精氨酸蛋白酶。耐變性劑，可經(jīng)受6M尿素2小時?？捎糜谒獠灰兹芙獾牡鞍?。凝血酶，水解Arg-Gly肽鍵。羥胺可水解 Asn-Gly，但Asn-Leu和Asn-Ala 也能部分裂解。以上方法中，酶不能水解脯氨酸參與形成的肽鍵。多肽部分水解后，降解成長短不一的小肽段，可用層析或電泳加以分離提純。經(jīng)常用雙向?qū)游龌螂娪痉蛛x， 再用茚三酮顯色，所得的圖譜稱為肽指紋譜。5. 多肽鏈中氨基酸順序的測定從多肽鏈中部分水解得到的肽段可用化學(xué)法或酶法測序，然后比較用不同方法獲得的兩套肽段的氨基酸順 序，根據(jù)它們彼此重

41、疊的部分，確定每個肽段的適當位置，拼湊岀整個多肽鏈的氨基酸順序。6. 二硫鍵位置的確定一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，從部分水解產(chǎn)物中分離岀含二硫鍵的肽段，再拆開二硫鍵，將兩 個肽段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位置。常用胃蛋白酶，因其專一性低，生成的 肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用（pH2）,此時二硫鍵穩(wěn)定。肽段的分離可用對角線電泳，將混合物點到濾紙的中央，在pH6.5進行第一次電泳，然后用過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對含半胱氨磺酸的肽段。將濾紙旋轉(zhuǎn)90度后在相同條件下進行第二次電泳，多數(shù)肽段遷移率不變，處于對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段因

42、負電荷增加而偏離對角線。用茚三酮顯色，分離，測序，與 多肽鏈比較，即可確定二硫鍵位置。以上供額外閱讀理解.幾種酶切分別從哪切排序N-末端的測定： sanger反應(yīng)（DNFB 法） Edman 反應(yīng)（PITC 法）丹磺酰氯（DNS）法氨肽酶法（略）封閉的N端測序：末端為 Gln的蛋白質(zhì)發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，生成焦谷氨酸?；苌?，此衍生 物可用焦谷氨酸特異性地裂解焦谷氨酰N末端，釋放出少一個Gln的肽。釋放的肽可用Edman等方法等正常方法測定。C末端分析：a）肼解法：精氨酸會變成鳥氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。b）還原法：硼氫化鋰還原劑c）羧肽酶法（最有效、常用）：羧肽酶A水解除精氨酸、賴

43、氨酸和脯氨酸 外所有C末端肽鍵; 羧肽酶B水解堿性氨基酸精氨酸和賴氨酸為C末端的肽鍵。（最有效，最常用的測 C端殘基方法 性質(zhì)：肽鏈外切酶，專一地從肽鏈的 C端逐個降解, 釋放出游離氨基酸） 肽鏈的專一性水解及肽片段的分離純化化學(xué)裂解法溴化氰斷裂：可斷裂 甲硫氨酸的羧基 （-COOH）形成的肽鍵。水解后甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)變?yōu)镃末端高絲氨酸殘基。羥胺斷裂：專一性斷裂一 Asn Gly 之間的肽鍵酶解法胰蛋白酶酶切法：專門水解賴氨酸和精氨酸的羧基-COOH形成的肽鍵（用丫丙啶處理，可增加酶切位點（半胱氨酸）；用馬來酸酐（順丁烯二酸酐）保護賴氨酸的側(cè)鏈氨基）糜蛋白酶：水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水殘

44、基的羧基-COOH形成的肽鍵。胃蛋白酶：水解疏水殘基之間的肽鍵（Phe、 Leu、Trp、Tyr）嗜熱菌蛋白酶：水解疏水殘基的氨基形成的肽鍵（Leu、Ile、Phe、Vai、Trp、Tyr、Met）肽段的氨基酸順序測定之 Edman化學(xué)降解法（PITC法）步驟: 第一步：偶聯(lián)反應(yīng)第二步：環(huán)化斷裂反應(yīng) 第三步：轉(zhuǎn)化反應(yīng) 肽段在多肽鏈中次序的決定：肽譜重迭法：從不同方法斷裂所得到的肽段中重疊的部分著手，得到肽的氨基酸序列。 二硫鍵的確定（暫未整理）（還是覺得老師講起來有點簡單， 最重要的還是是如何根據(jù)題意得出蛋白質(zhì)序列。相關(guān)的知識內(nèi)容應(yīng)該在書的 P92 N末端的測定、P96 C末端的測定、P99溴

45、化氫裂解、P104表3-2 , 一定要多做幾道例題）PPT例題:? 有一個十肽,N末端及C末端已事先測定分別為Ala 及 Vai。? 糜蛋白酶水解 胰蛋白酶水解Arg-Trp + His-Val + Trp-His-ValAla-Phe + Gly-Lys-As n-Tyr +Ala-Phe-Gly-Lys + Asa-Tyr-Arg? 答案：得到蛋白質(zhì)的序列為：Ala-Phe-Gly-Lys-As n-Tyr-Arg-Trp-His-ValP.S:書上P118第16題也是同類型的題其答案為 Ala-Lys-Arg-Val-Tyr-Glu-Gly由下列信息求八肽的序列。（a）酸水解得 Ala

46、, Arg , Leu , Met, Phe, Thr, 2Val（b）Sanger 試劑處理得 DNP-Ala。（c）胰蛋白酶處理得 Ala , Arg , Thr和Leu, Met, Phe, 2Val。當以San ger試劑處理時分 別得到 DNP-Ala 和 DNP-Val。（d） 溴化氰處理得Ala , Arg，高絲氨酸內(nèi)酯，Thr, 2Val,和Leu, Phe ,當用Sanger試 劑處理時，分別得 DNP-Ala和DNP-Leu。答： Ala-Thr-Arg-Val-Val-Met-Leu-Phe一個含有 13 個氨基酸殘基的十三肽的氨基酸組成為： Ala, Arg,2 Asp

47、, 2Glu, 3Gly, Leu, 3Val 部分酸水解后得到以下肽段，其序列由 Edman 降解確定，試推斷原始寡肽的序列。（a）Asp - Glu - Val - Gly - Gly - Glu - Ala（b）Val - Asp - Val - Asp - Glu（c）Val - Asp - Val（d）Glu - Ala -Leu - Gly -Arg（e）Val - Gly - Gly - Glu - Ala - Leu（f）Leu - Gly - Arg 答：該肽鏈的序列可以通過將肽片段的相同序列重疊排列起來獲得整個序列Vai - Asp - Vai - Asp - Glu -

48、Vai - Gly - Gly - Glu - Ala- Leu- Gly Arg第四章 蛋白質(zhì)的化學(xué)修蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的原理化學(xué)修飾：凡通過化學(xué)基團的引入或除去，而使蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的現(xiàn)象。 選擇性化學(xué)修飾： 肽鏈側(cè)鏈基團被化學(xué)試劑專一性修飾 蛋白質(zhì)側(cè)鏈上可被修飾的功能基團有：（1）氨基、羧基（2）羥基、巰基（3）精氨酸胍基、組氨酸咪唑基、色氨酸吲哚基、甲硫氨酸甲硫基、（酪氨酸酚基 ）。注： （1）堿性氨基酸 （3 種）和酸性氨基酸 （2 種） 都是強極性 ,可被化學(xué)修飾（2）含羥基（Ser,Thr,Tyr）和巰基的氨基酸（Cys）可被化學(xué)修飾（3）色氨酸和甲硫氨酸可被化學(xué)修飾 影響 蛋

49、白質(zhì)化學(xué)反應(yīng)進程的 因素：1蛋白質(zhì)功能基的反應(yīng)性微區(qū)的極性： 微區(qū)的極性是決定基團解離狀態(tài)的關(guān)鍵因素之一。 局部的極性改 變對色氨酸、甲硫氨酸、 胱氨酸影響較小，對氨基和組氨酸反應(yīng)性影響較大；對含羥基和巰 基的氨基酸反應(yīng)性影響最大。氫鍵效應(yīng)：天然蛋白質(zhì)通過氫鍵維持其穩(wěn)定性。靜電效應(yīng)；位阻效應(yīng)2修飾劑的反應(yīng)性選擇吸附： 化學(xué)修飾前，修飾劑根據(jù)各自的特點，選擇性吸附在低或高極性區(qū) 域，形成蛋白質(zhì) -修飾劑復(fù)合物。靜電相互作用；位阻因素；催化因素：酸堿催化作用局部環(huán)境的極性修飾反應(yīng)的專一性控制修飾試劑的選擇根據(jù)：(1) 修飾的目的：Eg.改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)或溶解性-引入大電荷量的試劑( 2 )便于

50、定量(3)試劑的體積要小反應(yīng)條件的選擇：溫度、 pH 要求：(1 )不造成蛋白質(zhì)的可逆變性( 2)便于專一性修飾蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的作用(化學(xué)修飾的應(yīng)用)1. 用來 測定 蛋白質(zhì)分子中 某一種氨基酸的數(shù)量；2. 在蛋白質(zhì)序列分析中的應(yīng)用：用于測定蛋白質(zhì)及多肽化學(xué)結(jié)構(gòu)的許多方法都是 以蛋白質(zhì)化學(xué)修飾為基礎(chǔ)的 。( 1 )控制酶解程度(2) 化學(xué)裂解：溴化氰專一性裂解Met 羧基所形成的肽鍵；蛋白質(zhì)中二硫鍵的裂解。3. 在雜交實驗 中的應(yīng)用4. 在研究蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu) 中的應(yīng)用( 1 )能與試劑作用的都處于蛋白質(zhì)表面， 不能與試劑作用的基團則處于埋藏狀態(tài)或參與 次級鍵的形成( 2)研究蛋白質(zhì)在溶液

51、中的構(gòu)象。側(cè)鏈基團與修飾劑的反應(yīng)性可反映基團所處的環(huán)境， 引入螢光基團可以了解這些基團的環(huán)境，指示構(gòu)象的變化。(3) 制備重原子的蛋白質(zhì)衍生物。對蛋白質(zhì)晶體分析非常有用。( 4)測定蛋白質(zhì)分子特定基團之間的距離。通過雙功能試劑對多肽鏈交聯(lián)來實現(xiàn)。5. 確定氨基酸殘基 的功能化學(xué)修飾結(jié)合保護實驗可研究底物或其它配位體對修飾速度和程度的影響。eg.磷酸吡哆醛修飾果糖 -6-磷酸激酶，發(fā)現(xiàn) 兩個 Lys 被修飾，酶活力失去 果糖 -2，6-二磷酸存在時，可急劇減弱修飾作用，保護激酶活力 說明 Lys 對酶活力有重要影響。6. 在蛋白質(zhì) 免疫化學(xué)研究 中的應(yīng)用 放射免疫技術(shù)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、多肽的檢測

52、和定量。優(yōu)點：靈敏度非常高名詞解釋親和標記： 利用酶和底物的親和性， 用與酶底物類似的修飾劑， 對酶活性部位上的 AA 殘基 進行共價標記。試劑 A-X 的 A 基團和親和標記：對酶的活性部位、受體的結(jié)合位點進行特異標記的方法。X基團可分別與不同的位點進行結(jié)合，從而將兩種物質(zhì)交聯(lián)在一起。如用親和標記法分離細 胞表面受體時，先將細胞與超量標記的激素 （配體）混合,以飽和所有特異受體的激素結(jié)合位 點；洗去多余的激素，然后加入能夠與受體和配體結(jié)合的共價交聯(lián)劑將激素與受體進行共價 交聯(lián)達到分離的目的。（網(wǎng)上的考研筆記）親和標記：借助親和作用對目的分子進行標記的方法。多用于對蛋白質(zhì)（如酶、抗體等）的標記

53、。先將能與蛋白質(zhì)親和的分子勺蛋白活性部位特異性、非共價鍵、可逆性結(jié)合，再通過具體的化學(xué)反應(yīng)使親和分子上的活性基團共價結(jié)合到活性部位附近的氨 基酸殘基上。（百度百科定義）第五章肽的人工合成液相合成多肽的原理、方法（3個步驟）及其優(yōu)缺點 多肽合成儀是以固相合成技術(shù)發(fā)展來的固相合成多肽的步驟、原理及其優(yōu)缺點注：詳見第六章末。第六章蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象名詞解釋二級結(jié)構(gòu)：是指由多肽鏈組成的主鏈骨架形成的構(gòu)象。它是由氫鍵維持的局部的有規(guī)則的構(gòu)象。主要組成形式有：a -螺旋（右手螺旋）、B -折疊、轉(zhuǎn)角等。球狀構(gòu)反平行式比平行的-折疊更穩(wěn)定。象。四級結(jié)構(gòu)：多亞基蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。實際上是具有三級結(jié)構(gòu)多肽（亞基）

54、以適當方式聚三級結(jié)構(gòu)：是由多肽鏈 通過盤旋、折疊 而形成的緊密的、借助各種次級鍵而維持的合所呈現(xiàn)的三維結(jié)構(gòu)。（考研筆記如是說）；有的蛋白質(zhì)由多條肽鏈組成，每條肽鏈稱為亞基, 亞基之間又有特定的空間關(guān)系，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。（PPT如是說）多個亞基聚集而成的蛋白質(zhì)常常稱為寡聚蛋白。四級結(jié)構(gòu)具有的優(yōu)越性（略：蛋白質(zhì)化學(xué)8-蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象 P64）個人補充：一級結(jié)構(gòu)的立體結(jié)構(gòu)原理1蛋白質(zhì)分子中各多肽鏈的氨基酸殘基序的排列順序2共價鍵：二硫鍵、肽鍵什么叫肽平面（肽單位平面結(jié)構(gòu)）在蛋白質(zhì)或者多肽當中， 連接兩個氨基酸的肽鍵是一個部分雙鍵， 不能自由旋轉(zhuǎn)，因此，肽 單位上的六個原子： 前后兩個a -碳

55、原子、N-H和C=O在C-N位于一個剛性平面上，形成穩(wěn)定的反式構(gòu)性，它造成多肽鏈折疊的空間限制的因素之一。什么叫結(jié)構(gòu)域在一個蛋白質(zhì)分子或亞基中，多肽鏈常折迭成二個或幾個緊實的局部單位，這些彼此分隔的單位多為緊密的球狀構(gòu)象、彼此分開，并由松散的肽鏈相連，這些結(jié)構(gòu)稱為結(jié)構(gòu)域。什么叫球蛋白一類不溶或微溶于水，可溶于稀鹽溶液的單純蛋白質(zhì)維持二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)的主要作用力及其它作用力是什么二級結(jié)構(gòu)：氫鍵穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)的作用力：疏水側(cè)鏈聚集在一起的 疏水作用；帶正電和帶負電的側(cè)鏈會發(fā)生靜電吸引，產(chǎn)生離子鍵；羰基氧和亞氨基氫原子等相互作用產(chǎn)生的氫鍵；兩個半胱氨酸的側(cè)鏈-SH生成的二硫鍵。四級結(jié)構(gòu)：次級鍵（疏水作用、氫鍵、范德華引力）蛋白質(zhì)構(gòu)象研究的方法（主要為固相和液相）簡答題固相合成技術(shù)原理：把