分子生物學研究方法

1、第六章第六章 分子生物學研究法（下）分子生物學研究法（下）基因功能研究技術基因功能研究技術第六章第六章 分子生物學研究法（下）分子生物學研究法（下）內(nèi)容：內(nèi)容：1. 基因表達研究技術基因表達研究技術2. 基因敲除技術基因敲除技術3. 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術相互作用技術4. 基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析5. 其他分子生物學技術其他分子生物學技術第一節(jié)第一節(jié) 基因表達研究技術基因表達研究技術原位雜交（原位雜交（ISH）是）是 用標記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影用標記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體

2、上對核酸進行對核酸進行定位和相對定量定位和相對定量研究的一種手段，分為研究的一種手段，分為RNA和染色體原位雜交和染色體原位雜交兩大類。兩大類。RNA原位雜交原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應，若細胞中存在與探針互補的細胞中存在與探針互補的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈雙鏈RNA，可通過放射性標記或經(jīng)酶促免疫顯色，對，可通過放射性標記或經(jīng)酶促免疫顯色，對該基該基 因的表達產(chǎn)物做出因的表達產(chǎn)物做出定性定量分析定性定量分析。3. 原位雜交技術原位雜

3、交技術mRNA的互補鏈，的互補鏈， 雜交信號集中于纖雜交信號集中于纖維細胞中。維細胞中。負對照負對照，mRNA的的 同義同義鏈鏈, 無雜交信號無雜交信號正對照正對照，UBQ10雜交信雜交信號遍布于號遍布于 整個整個胚珠胚珠舉例舉例首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記，首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記， 然后然后用原位雜交法與靶染色體或用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，上特定的序列結(jié)合，再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的 單克隆抗體來確定該單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。序列在染色體上的位置。熒光熒光原位雜交（原位雜交（FISH）通過改變基因特定

4、位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個（些）氨酸序列，用于研究某個（些）氨 基酸殘基對蛋白質(zhì)的基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構、催化活性以及結(jié)結(jié)構、催化活性以及結(jié) 合配體能力的影響，也可用于合配體能力的影響，也可用于改造改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達載體、引入新調(diào)控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。的酶切位點等。目前，主要采用兩種目前，主要采用兩種PCR方法，方法，重疊延伸技術重疊延伸技術和和大引大引物誘變法物誘變法，在基因序列中進行定點突變。，在基因序列中進行定點突變。4. 基因定點突變技術基因定點突變技術重疊延伸介導的

5、定點誘變重疊延伸介導的定點誘變大引物誘變法大引物誘變法第三節(jié)第三節(jié) 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術相互作用技術1. 酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)是上世紀酵母單雜交系統(tǒng)是上世紀90年代中發(fā)展起來的研究年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術，可識別穩(wěn)定結(jié)合于相互作用的新技術，可識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細胞內(nèi)研究上的蛋白質(zhì)，在酵母細胞內(nèi)研究真核生物真核生物中中DNA-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過篩選之間的相互作用，并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的相互作用蛋白的編碼基因編碼基因。酵母單雜交原理酵母單雜交原

6、理 將已知順式作用元件構建到最基本啟動子（將已知順式作用元件構建到最基本啟動子（Pmin）的上游，）的上游，把報告基因連接到把報告基因連接到Pmin下游。將編碼下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已與已知酵母知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域（轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域（AD）融合表達載體導入酵母細胞，融合表達載體導入酵母細胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活 Pmin啟動子，使報告基因得到表達。啟動子，使報告基因得到表達。從擬南芥從擬南芥cDNA文庫中文庫中 篩選與順式元件篩選與順式元件DRE結(jié)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。真核生物

7、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構組件式結(jié)構 （modular）特）特征，這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構域，征，這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構域，其中其中DNA結(jié)合結(jié)構域結(jié)合結(jié)構域 （binding domain，BD）和）和轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構域激活結(jié)構域 （activation domain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。子發(fā)揮功能所必須的。BD能與特定基因啟動區(qū)結(jié)合，但能與特定基因啟動區(qū)結(jié)合，但不能不能激活基因轉(zhuǎn)錄，由激活基因轉(zhuǎn)錄，由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和和AD所形成的雜合蛋白卻能行使所形成的雜合蛋白卻能行使激

8、活轉(zhuǎn)錄的功能。激活轉(zhuǎn)錄的功能。2. 酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng) 酵母雙雜交的基本原理示意圖酵母雙雜交的基本原理示意圖視已知蛋白的視已知蛋白的cDNA序列為誘餌序列為誘餌(bait)，將其與，將其與DNA結(jié)合域融合，構建成結(jié)合域融合，構建成誘餌質(zhì)粒誘餌質(zhì)粒。將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化的酵母；株中，選擇被轉(zhuǎn)化的酵母；再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中；再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中；通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白。通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白。酵母雙雜交步驟酵母雙雜交步驟Bait and Hunter PlasmidsYea

9、st two-hybrid transcriptionTransfection舉例舉例研究研究體外體外蛋白質(zhì)相蛋白質(zhì)相互作用技術互作用技術利用利用GST對谷胱甘對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋化得到相互作用蛋白。白。3. GST融合蛋白沉降技術融合蛋白沉降技術其基本原理是將靶蛋白其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上，作谷胱甘肽親和樹脂上，作為與目的蛋白親和的支撐為與目的蛋白親和的支撐物，充當一種物，充當一種“誘餌蛋誘餌蛋白白”，目的蛋白溶液過柱，目的蛋白溶液過柱

10、，可從中捕獲與之相互作用可從中捕獲與之相互作用的的“捕獲蛋白捕獲蛋白”(目的蛋白目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白。篩選相應的目的蛋白。GST pull-down4.免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-IP） 細胞內(nèi)細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用研究 是以是以抗體和抗原抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在質(zhì)在完整細胞內(nèi)完整細胞內(nèi)生理性

11、相互作用的有效方法。生理性相互作用的有效方法。 在細胞裂解液中加入在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白抗興趣蛋白的抗體的抗體，孵育后再加入與抗體特，孵育后再加入與抗體特異結(jié)合的結(jié)合于異結(jié)合的結(jié)合于Agarose珠上的珠上的Protein A或或G，若細胞中有與興，若細胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：形成這樣一種復合物：“目的蛋目的蛋白白興趣蛋白興趣蛋白抗興趣蛋白抗抗興趣蛋白抗體體Protein A或或G”，經(jīng)變性聚，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被丙烯酰胺凝膠電泳，復合物又被分開。然后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢分開。然后經(jīng)免疫印跡或質(zhì)譜檢測目的蛋白。測

12、目的蛋白。Co-IP 原理原理（1）轉(zhuǎn)染后）轉(zhuǎn)染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解蛋白酶抑制劑），冰上裂解30min, 細胞裂解液于細胞裂解液于4C， 最大轉(zhuǎn)最大轉(zhuǎn)速離心速離心30 min后取上清；后取上清；（2）取少量裂解液以備）取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加分析，剩余裂解液加1g相應的相應的抗體抗體加入到細胞裂解液，加入到細胞裂解液，4C緩慢搖晃孵育過夜；緩慢搖晃孵育過夜；（3）?。┤?0l protein A 瓊脂糖珠瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次

13、，每次次3,000 rpm離心離心3 min；（4）將預處理過的）將預處理過的10l protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中過夜的細胞裂解液中4C緩慢搖晃孵育緩慢搖晃孵育2-4h，使抗體與使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；瓊脂糖珠偶連；（5）免疫沉淀反應后，在）免疫沉淀反應后，在4C 以以3,000 rpm 速度離心速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1ml裂解裂解緩沖液緩沖液洗洗34次；最后加入次；最后加入15l的的2SDS 上樣緩沖液，沸水煮上樣緩沖液，沸水

14、煮5分鐘；分鐘；（6）SDS-PAGE, Western blotting或質(zhì)譜儀分析或質(zhì)譜儀分析操作步驟操作步驟（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復合物。優(yōu)點優(yōu)點（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不

15、是直接結(jié)合不是直接結(jié)合，而可能，而可能有第三者在中間起橋梁作用；有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。結(jié)果，方法本身具有冒險性。（4）靈敏度沒有親和色譜高。）靈敏度沒有親和色譜高。缺點缺點TR3 interacts with p53. 舉例舉例5. RNAi（RNA干涉）技術干涉）技術RNAi技術利用雙鏈小技術利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內(nèi)同源高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA從從而阻斷靶基因表

16、達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。而阻斷靶基因表達，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的命名的命名來源于安德魯來源于安德魯法爾法爾1998年在年在自然自然雜志上的論文。雜志上的論文。研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補的單鏈的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補的單鏈RNA（ssRNA, single- stranded RNA）的降解。）的降解。經(jīng)過經(jīng)過Dicer（一種具有（一種具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，細胞中活性的核酸酶）的加工，細胞中較長的雙鏈較長的雙鏈RNA（30個核苷酸以上）首先被降解形成個核苷酸以上）首先被降解形成2125個核個核苷酸的苷酸的小分

17、子干擾核糖核酸小分子干擾核糖核酸（siRNA，short interfering RNA ），），并有效定位目標并有效定位目標 mRNA。其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將將dsRNA切割成多個具有特切割成多個具有特定長度和結(jié)構的小片段定長度和結(jié)構的小片段RNA（大約（大約2123 bp），即），即siRNAsiRNAsiRNA在細胞內(nèi)在細胞內(nèi)RNARNA解旋酶解旋酶的作用下的作用下解鏈解鏈成正義鏈和反義鏈，成正義鏈和反義鏈，繼之由繼之由反義反義siRNAsiRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成解旋酶等）結(jié)合形成RN

18、ARNA誘導的沉默復合物誘導的沉默復合物（RISC)RISC)。 RISCRISC與外源性基因表達的與外源性基因表達的mRNAmRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，RISCRISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNAmRNA，切割位點，切割位點即是與即是與siRNAsiRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。中反義鏈互補結(jié)合的兩端。 被切割后的斷裂被切割后的斷裂mRNAmRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些這些mRNAmRNA的降解反應。的降解反應。 RNAi原理原理RNAiRNAi是是轉(zhuǎn)錄后水平轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默

19、機制；的基因沉默機制；RNAiRNAi具有很高的具有很高的特異性特異性，只降解與之序列相應的單個內(nèi)源，只降解與之序列相應的單個內(nèi)源基因的基因的mRNAmRNA；RNAiRNAi抑制基因表達具有抑制基因表達具有很高的效率很高的效率，表型可以達到缺失突，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNAdsRNA分子（數(shù)量遠遠少分子（數(shù)量遠遠少于內(nèi)源于內(nèi)源mRNAmRNA的數(shù)量）就能的數(shù)量）就能完全抑制完全抑制相應基因的表達，是以相應基因的表達，是以催催化放大化放大的方式進行的；的方式進行的；RNAiRNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞抑

20、制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點；等特點；RNAi具有的特征具有的特征舉例舉例第四節(jié)第四節(jié) 基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片這一技術方法在基因芯片這一技術方法在1991年的年的Science雜志上雜志上被首次提出，其高被首次提出，其高通量、并行檢測通量、并行檢測的特點適應了分的特點適應了分析人類基因組計劃所提供的析人類基因組計劃所提供的海量海量的基因序列信息的的基因序列信息的需要，可以說，人類基因組計劃是基因芯片技術發(fā)需要，可以說，人類基因組計劃是基因芯片技術發(fā)

21、展的原因，而對展的原因，而對深人研究基因突變和基因表達深人研究基因突變和基因表達的有的有效方法的需求又是促進基因芯片技術發(fā)展的動力。效方法的需求又是促進基因芯片技術發(fā)展的動力?；蛐酒恼Q生基因芯片的誕生基因芯片基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又稱，又稱DNA微陣列微陣列(DNA Micorarray)，是指按照預定位置固定在固相載體，是指按照預定位置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列。在上很小面積內(nèi)的千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣 品的序列品的序列互補的核酸片段雜

22、交。如果把樣品中的核酸片段進行標記，互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。 基因芯片的定義基因芯片的定義基因芯片技術是建立在基因探針和雜交測序技術上的一基因芯片技術是建立在基因探針和雜交測序技術上的一種高效、快速的核酸序列分析手段。它將大量探針分子種高效、快速的核酸序列分析手段。它將大量探針分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布來進行分析。在一塊測雜交信號的強度及分布來進行分析。在一塊1 1cmcm2 2大小大小的

23、基因芯片上，根據(jù)需要可固定數(shù)以千計甚至萬計的基的基因芯片上，根據(jù)需要可固定數(shù)以千計甚至萬計的基因，以此形成一個密集的基因方陣，實現(xiàn)對千萬個基因因，以此形成一個密集的基因方陣，實現(xiàn)對千萬個基因的同步檢測。的同步檢測。簡易基因芯片的制作：簡易基因芯片的制作：使用機械臂把使用機械臂把DNA片段點在玻璃片或尼片段點在玻璃片或尼龍膜龍膜 上，經(jīng)過物理吸附作用達到固定化。也可以上，經(jīng)過物理吸附作用達到固定化。也可以 直接在玻璃板表直接在玻璃板表面進行化學合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的面進行化學合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA 或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處理，

24、便可以觀或其它樣品雜交，經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理條件下的表達模式。生理條件下的表達模式。應用：應用：基因芯片可用于進行基因診斷。先建立正常人特定組織、基因芯片可用于進行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖，用可疑病人的器官的基因芯片，給出標準雜交信號圖，用可疑病人的cDNA做做探針與之雜交，確定哪些基因的表達受抑制或激活。探針與之雜交，確定哪些基因的表達受抑制或激活?；蛐酒夹g主要包括四個主要步驟：基因芯片技術主要包括四個主要步驟：芯片制

25、備、樣品制備、雜交反應和信號檢測和結(jié)果分析。芯片制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測和結(jié)果分析。 應用之一 基因表達譜（gene expression pattern)紅色紅色 上調(diào)上調(diào)黃色黃色 不變不變綠色綠色 下調(diào)下調(diào)基因表達譜芯片的應用最為廣泛，技術上也最成熟。這種芯片可以檢測整個基因組范圍的眾多基因在mRNA表達水平的變化。它能對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發(fā)育階段、不同分化階段、不同生理病理、不同刺激條件下的組織細胞內(nèi)基因表達情況進行對比分析。從而對基因群在個體特異性、組織特異性、發(fā)育特異性、分化特異性、疾病特異性、刺激特異性的變化特征和規(guī)律進行描述，進一步闡明基因的相

26、互協(xié)同、抑制、互為因果等關系。有助于理解基因及其編碼的蛋白質(zhì)的生物學功能，并從已知生物學功能的基因推論未報道基因的生物學意義。同時，還可在基因水平上解釋疾病的發(fā)病機理，為疾病診斷、藥效跟蹤、用藥選擇等提供有效手段。急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表達譜芯片的研究?；蛐酒膬?yōu)點：1.高通量2.大規(guī)模3.高度平行性4.快速高效5.高靈敏度6.高度自動化第五節(jié)第五節(jié) 其他分子生物學技術其他分子生物學技術凝膠滯緩試驗（凝膠滯緩試驗（gel retardation assay），）， 又叫作又叫作DNA遷移率變動試驗（遷移率變動試驗（DNA mobility shift assa

27、y），是用于），是用于體外研究體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳的一種特殊的凝膠電泳技術。技術。在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA 朝正電極朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作膠中的遷移作 用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電正電 極移動的距離也就相應縮短了。極移動的距離也就相應縮短了。1. 凝膠滯緩實驗

28、凝膠滯緩實驗擬南芥轉(zhuǎn)擬南芥轉(zhuǎn)錄錄 因子與因子與不同不同 DNA元件元件有不同的有不同的結(jié)合能力。結(jié)合能力。噬菌體可被分為噬菌體可被分為溶菌周期溶菌周期和和溶源周期溶源周期兩種不同的類型。在溶菌周期，噬菌兩種不同的類型。在溶菌周期，噬菌體將其感染的宿主細胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體將其感染的宿主細胞轉(zhuǎn)變成為噬菌體的體的“制造廠制造廠”，產(chǎn)生出大量的子代，產(chǎn)生出大量的子代噬菌體顆粒。實驗室常將只具有溶菌噬菌體顆粒。實驗室常將只具有溶菌生長周期的噬菌體叫作生長周期的噬菌體叫作烈性噬菌體烈性噬菌體。溶源生長周期溶源生長周期是指噬菌體是指噬菌體DNA被整合被整合到宿主細胞染色體到宿主細胞染色體DNA上，成為它的上，

29、成為它的一個組成部分，感染過程中不產(chǎn)生子一個組成部分，感染過程中不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒。具有這種溶源周期的代噬菌體顆粒。具有這種溶源周期的噬菌體被稱為噬菌體被稱為溫和噬菌體溫和噬菌體。2. 噬菌體展示技術噬菌體展示技術噬菌體展示技術的基本噬菌體展示技術的基本原理是將編碼原理是將編碼“誘餌誘餌”蛋蛋 白的白的DNA片段片段插入插入噬菌體基因組，并使之噬菌體基因組，并使之與噬與噬 菌體菌體外殼蛋白編外殼蛋白編碼基因相融合碼基因相融合。重組噬。重組噬菌體侵染宿主細菌后，菌體侵染宿主細菌后，復制形成大量帶有雜合復制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，外殼蛋白的噬菌體顆粒，直接用于直接用于捕獲捕獲靶蛋白

30、庫靶蛋白庫中與中與 “誘餌誘餌”相互作相互作用的蛋白質(zhì)。用的蛋白質(zhì)。噬菌體展示技術噬菌體展示技術利用靶分子，采用適當?shù)睦冒蟹肿樱捎眠m當?shù)奶韵捶椒ㄌ韵捶椒ǎㄓH和（親和洗脫洗脫擴增擴增親和的循環(huán)步親和的循環(huán)步驟），洗去非特異結(jié)合的噬菌體，驟），洗去非特異結(jié)合的噬菌體，最最終從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合靶分終從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合靶分子的目的噬菌體子的目的噬菌體；外源多肽或蛋白質(zhì)；外源多肽或蛋白質(zhì)表達在噬菌體的表面，而其編碼基因表達在噬菌體的表面，而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過噬作為病毒基因組中的一部分可通過噬菌體菌體DNADNA序列測序出來，使得序列測序出來，使得表達蛋白表達蛋白（表現(xiàn)型）和編碼基因（基因型）（表現(xiàn)型）和編碼基因（基因型）之之間完美地結(jié)合起來，為生物科學提供間完美地結(jié)合起來，為生物科學提供高效而實用的研究手段。高效而實用的研究手段。噬菌體展示技術噬菌體展示技術利用體