實(shí)驗(yàn)六-紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用--實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實(shí)驗(yàn)六 紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用【實(shí)驗(yàn)名稱】：紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用09救援一班 第三大組 李嵐宇 室溫：28（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1、學(xué)習(xí)氨基酸紙層析的基本原理。 2、掌握氨基酸紙層析的操作原理。（二）實(shí)驗(yàn)原理：轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸代謝過(guò)程中的一個(gè)重要反應(yīng)，在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的-酮酸與-酮基的互換反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨基作用。轉(zhuǎn)氨基作用廣泛地存在于機(jī)體各組織器官中，是體內(nèi)氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反應(yīng)時(shí)均由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，此酶催化氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移到另一酮基酸上。各種轉(zhuǎn)氨酶的活性不同，其中肝臟的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）催化如下反應(yīng)： 酮戊二酸 + 丙氨酸 谷氨酸 + 丙酮酸

2、本實(shí)驗(yàn)以丙氨酸和-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的出現(xiàn)，以證明轉(zhuǎn)氨基作用。紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強(qiáng)，水被吸附在濾紙的纖維素的纖維之間形成固定相。有機(jī)溶劑與水不相溶，把預(yù)分離物質(zhì)加到濾紙的一端，使流動(dòng)溶劑經(jīng)此向另一端移動(dòng)，這樣物質(zhì)隨著流動(dòng)相的移動(dòng)進(jìn)行連續(xù)、動(dòng)態(tài)的不斷分配。由于物質(zhì)分配系數(shù)的差異，而使移動(dòng)速度就不一樣，在固定相中，分配趨勢(shì)較大的組分，隨流動(dòng)相移動(dòng)的速度就慢，反之，在流動(dòng)相分配趨勢(shì)較大的成分，移動(dòng)速度快，最終不同的組分彼此分離，物質(zhì)在紙上移動(dòng)的速率可以用比值Rf表示： 物質(zhì)在一定的溶液中的分配系數(shù)是一定的，故比值Rf也相對(duì)穩(wěn)定，因

3、此在同一層析體系中可用Rf值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。（三）實(shí)驗(yàn)材料與儀器： 試劑： 1、0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。 2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml與0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混勻,用蒸餾水稀釋20倍。 3、0.1mol/L丙氨酸溶液稱取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中,以1.0 N NaOH仔 細(xì)調(diào)至pH7.4后, 加磷酸鹽緩沖液至100ml。 4 、0.1mol/L酮戊二酸稱取酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 N NaOH仔細(xì)調(diào)至pH 7.4

4、 后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。 5、0.1mol/L 谷氨酸溶液稱取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 N NaOH仔細(xì)調(diào)至pH 7.4 后, 加磷酸鹽緩沖液至50 ml。 6、0.5%茚三酮溶液稱取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。 7、層析溶劑：將重蒸過(guò)的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震蕩，靜置24小時(shí)后分層，將下部酚層轉(zhuǎn)移到瓶中備用。 儀器：玻璃勻漿器、10ml試管、培養(yǎng)皿、表面皿、沸水浴鍋、37恒溫水浴箱、9cm圓濾紙、烘箱、手術(shù)剪刀、分液漏斗。 （四）實(shí)驗(yàn)步驟: 1、肝勻漿制備：取新鮮動(dòng)物肝0.5克,剪碎后放入

5、勻漿器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液1.0 ml,迅速研成勻漿， 用上述緩沖液4.5ml混勻備用。 2、 酶促反應(yīng)過(guò)程（1）取離心管兩支，編號(hào)：1（測(cè)定管）、2（對(duì)照管），各加肝勻漿0. 5ml。把對(duì)照管放沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/L-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液1.5 ml,搖勻。（3）37保溫，30分鐘后取出，保溫完畢。（4） 把測(cè)定管放沸水浴中煮10分鐘，取出后冷卻，過(guò)濾。 3、層析（1） 取圓形濾紙一張（直徑9cm）放潔白紙上，以圓點(diǎn)為中心，約1 cm為半徑,用

6、鉛筆劃一圓線作為基線,在線上四等份處標(biāo)清四點(diǎn)編號(hào)作為點(diǎn)樣原點(diǎn)。（2）點(diǎn)樣：用四根毛細(xì)玻璃管分別進(jìn)行點(diǎn)樣。把丙氨酸液、谷氨酸液分別點(diǎn)在原點(diǎn)2、4處。把測(cè)定液、對(duì)照液分別點(diǎn)在原點(diǎn)1、3處。注意斑點(diǎn)不宜過(guò)大（應(yīng)在直徑0.5cm以下）。在第一次點(diǎn)樣點(diǎn)干后，再在原處同樣點(diǎn)第2次。（3）層析：先在濾紙圓心處打一小孔（鉛筆芯粗細(xì)），再取濾紙一條卷成捻如燈芯狀,上端插入濾紙中心孔中，下端剪成須狀。（4）把濾紙平放在上述培養(yǎng)皿上，使紙芯下浸入層析液中，蓋上培養(yǎng)皿蓋?？梢?jiàn)層析液沿紙芯上升到濾紙中心，漸向四周擴(kuò)散。當(dāng)層析液前緣到離濾紙邊緣約1cm時(shí)，約25分鐘，取出濾紙，用鑷子小心取下紙芯，放入烘箱中烘干。（5）

7、顯色：將上述濾紙平放在培養(yǎng)皿上，滴0.5茚三酮的丙酮溶液，使濾紙全部濕潤(rùn)，再放入烘箱干燥，此時(shí)可見(jiàn)紫色斑出現(xiàn)，比較色斑的位置，及色澤深淺，計(jì)算Rf值，分析是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。（五）實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：圖（1）點(diǎn)樣溶液色斑個(gè)數(shù)溶質(zhì)中心到原點(diǎn)中心的距離溶質(zhì)前緣到原點(diǎn)中心的距離Rf值測(cè)定管上清液2未知溶質(zhì)a 1.50cm2.50cm0.6未知溶質(zhì)b 0.40cm2.50cm0.16丙氨酸11.30cm2.20cm0.6對(duì)照管上清液11.50cm2.50cm0.6谷氨酸10.40cm2.20cm0.16表格（1）（6） 實(shí)驗(yàn)討論： 1、從表格（1）中可以看出，測(cè)定管上清液點(diǎn)樣出現(xiàn)了兩個(gè)色斑，根據(jù)Rf值的計(jì)算也可以看出，測(cè)定管中氨基酸發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基作用，生成的未知物質(zhì)b為谷氨酸，則未知溶質(zhì)a為丙氨酸；對(duì)照管中因?yàn)槊傅氖Щ疃鴽](méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，只有丙氨酸