Promocell原代細(xì)胞培養(yǎng)

1、經(jīng)驗(yàn)分享經(jīng)驗(yàn)分享原代細(xì)胞和干細(xì)胞原代細(xì)胞和干細(xì)胞培養(yǎng)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題培養(yǎng)中可能出現(xiàn)的問(wèn)題PromoCell Academy 6/27/2022CytokinesAntibodiesELISAsCell AssaysTransfection Reagents Human CellsOptimized MediaClassical MediaSeraCell Culture ReagentsCell CultureCell BiologyTraining CoursesThree PromoCell BrandsCell CultureMolecular BiologyQuality Manage

2、mentPromoCell Academy 6/27/20221990年開(kāi)始科學(xué)家指年開(kāi)始科學(xué)家指導(dǎo)導(dǎo)科學(xué)家科學(xué)家用用“ “技技術(shù)術(shù)” ”取代取代“ “經(jīng)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)” ”用用“ “經(jīng)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)” ”取代取代“ “運(yùn)氣運(yùn)氣” ”P(pán)romoCell Academy 6/27/2022細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生問(wèn)題的可能原因細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生問(wèn)題的可能原因PromoCell Academy 6/27/2022微生物污染微生物污染 (I)(I)細(xì)菌污染細(xì)菌污染 培養(yǎng)基渾濁 培養(yǎng)基變黃（pH值改變） 顯微鏡下：移動(dòng)的黑點(diǎn)或桿狀物 大?。?-5m 來(lái)源：操作人員/水浴不能再進(jìn)一步培養(yǎng)不能再進(jìn)一步培養(yǎng) 丟棄丟棄! !PromoCe

3、ll Academy 6/27/2022真菌污染真菌污染 培養(yǎng)基變黃（pH值改變） 生長(zhǎng)相對(duì)緩慢 來(lái)源：氣流 顯微鏡下：u 菌絲體主要是植物式的生長(zhǎng)模式u分枝菌絲菌絲體，孢子生產(chǎn)能力強(qiáng)不要打開(kāi)培養(yǎng)容器，不要打開(kāi)培養(yǎng)容器，直接丟棄直接丟棄！微生物污染微生物污染 (II)(II)PromoCell Academy 6/27/2022酵母菌污染酵母菌污染 培養(yǎng)基呈云霧狀 橢圓形，酵母細(xì)胞芽接，成鏈 大約3-5m 來(lái)源：氣流 可以用抗真菌藥劑清除（如兩性霉素可以用抗真菌藥劑清除（如兩性霉素B B和制霉菌素）和制霉菌素）微生物污染微生物污染 (III)(III)PromoCell Academy 6/2

4、7/2022支原體污染支原體污染 首次發(fā)現(xiàn)于首次發(fā)現(xiàn)于18981898年，被定義為病毒年，被定義為病毒 是已知的能自我復(fù)制的最小原核生物是已知的能自我復(fù)制的最小原核生物 直徑為0.2-0.8m能夠通過(guò)孔徑為0.45m的纖維素和聚乙烯醇過(guò)濾器（由于其變形的能力，甚至能夠穿過(guò)0.22m寬的孔徑！） 缺乏細(xì)胞壁肽聚糖耐青霉素 一般在培養(yǎng)中無(wú)明顯的表象（肉眼不可見(jiàn)，顯微鏡下也不可見(jiàn) 一般發(fā)生在胞外，只有極少數(shù)幾率發(fā)生在胞內(nèi)一般發(fā)生在胞外，只有極少數(shù)幾率發(fā)生在胞內(nèi)微生物污染微生物污染 (IV)(IV)PromoCell Academy 6/27/2022微生物污染微生物污染 (IV)(IV) HK-2細(xì)

5、胞 (人腎近曲小管上皮細(xì)胞) 復(fù)蘇后細(xì)胞第一天貼壁，但細(xì)胞中可見(jiàn)空泡樣改變 然后傳代后出現(xiàn)明顯生長(zhǎng)遲緩 空泡增加，繼而細(xì)胞崩解 培養(yǎng)基是DMEM/F12：10%FBS 凍存液是90%FBS+10%DMSOPromoCell Academy 6/27/2022支原體污染后的表現(xiàn)和支原體污染后的表現(xiàn)和肉眼可見(jiàn)肉眼可見(jiàn)特征特征 即使細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體的濃度達(dá)到非常高的水平（大于108個(gè)支原體/ml），仍然沒(méi)有任何明顯可見(jiàn)的污染征兆 培養(yǎng)基的顏色提前變化（pH值轉(zhuǎn)變） 倍增時(shí)間延長(zhǎng) 細(xì)胞形態(tài)改變 細(xì)胞表層穿孔 細(xì)胞周邊不均勻 空泡形成 細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解PromoCell Academy 6/27/202

6、2 對(duì)生長(zhǎng)速度的不利影響 支原體能夠與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并分泌有害的代謝產(chǎn)物，從而對(duì)細(xì)胞增殖能有50%的抑制作用（有這篇文獻(xiàn)為證McGarrity et al., 1984） 葡萄糖快速降低，形成酸pH值轉(zhuǎn)變 精氨酸耗盡抑制蛋白質(zhì)的生物合成，細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng) 引起染色體畸變和多種易位（McGarrity et al., 1978） 基因芯片和基因表達(dá)譜產(chǎn)生顯著的變化 支原體能夠占總蛋白的50%和純化總DNA的15-30%他們甚至能夠基本上控制宿主細(xì)胞所有的代謝功能在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)支原體污染以后的后果在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)支原體污染以后的后果PromoCell Academy 6/27/2022 對(duì)

7、生長(zhǎng)速度的不利影響 支原體能夠與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并分泌有害的代謝產(chǎn)物，從而對(duì)細(xì)胞增殖能有50%的抑制作用（有這篇文獻(xiàn)為證McGarrity et al., 1984） 葡萄糖快速降低，形成酸pH值轉(zhuǎn)變 精氨酸耗盡抑制蛋白質(zhì)的生物合成，細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長(zhǎng) 引起染色體畸變和多種易位（McGarrity et al., 1978） 基因芯片和基因表達(dá)譜產(chǎn)生顯著的變化 支原體能夠占總蛋白的50%和純化總DNA的15-30%他們甚至能夠基本上控制宿主細(xì)胞所有的代謝功能因此要因此要進(jìn)進(jìn)行支原體行支原體檢測(cè)檢測(cè)以便以便驗(yàn)證驗(yàn)證支原體的存在支原體的存在在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)支原體污染以后的后果在細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)支原

8、體污染以后的后果PromoCell Academy 6/27/2022支原體的檢測(cè)支原體的檢測(cè) DNA熒光染色（Bisbenzimid, DAPI）（圖例） PCR技術(shù)（圖例） 一般以下情況需要進(jìn)行支原體檢測(cè)：一般以下情況需要進(jìn)行支原體檢測(cè)： 新型的細(xì)胞和病毒培養(yǎng)物 持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系每月進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染的情況下每周進(jìn)行檢測(cè) 在每次液氮再次凍存之前 對(duì)細(xì)胞特征進(jìn)行改造修飾之后 在無(wú)法得到重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況下 實(shí)驗(yàn)員察覺(jué)到了顯著的支原體污染時(shí)！PromoCell Academy 6/27/2022支原體的檢測(cè)支原體的檢測(cè) DNA熒光染色（Bisbenzimid, DAPI）（圖例） PCR

9、技術(shù)（圖例）（特異的引物設(shè)計(jì)來(lái)自高度保守的核糖體 RNAs/16S-rRNA的DNA編碼序列。 在支原體中，保守的rRNA基因序列非常類(lèi)似。 這些引物不會(huì)檢測(cè)到細(xì)菌或者動(dòng)物的DNA序列） 一般以下情況需要進(jìn)行支原體檢測(cè)：一般以下情況需要進(jìn)行支原體檢測(cè)： 新型的細(xì)胞和病毒培養(yǎng)物 持續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系每月進(jìn)行檢測(cè)；對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染的情況下每周進(jìn)行檢測(cè) 在每次液氮再次凍存之前 對(duì)細(xì)胞特征進(jìn)行改造修飾之后 在無(wú)法得到重復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況下 實(shí)驗(yàn)員察覺(jué)到了顯著的支原體污染時(shí)！PromoCell Academy 6/27/2022被污染的細(xì)胞培養(yǎng)物或者病毒儲(chǔ)液的處理被污染的細(xì)胞培養(yǎng)物或者病毒儲(chǔ)液的處理 立即隔離培

10、養(yǎng)物（培養(yǎng)箱），并檢測(cè)相應(yīng)的凍存細(xì)胞樣品 通知所有相關(guān)人員 對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)消毒 對(duì)無(wú)法替代的，珍貴的細(xì)胞立即實(shí)施搶救 高壓滅菌/丟棄那些可以替代的細(xì)胞PromoCell Academy 6/27/2022支原體清除的方法支原體清除的方法 抗生素抗生素氟喹諾酮類(lèi)衍生物環(huán)丙沙星 (例如PromoKine的產(chǎn)品BIOMYC-3)支原體去除試劑（MRA）四環(huán)素類(lèi)BIOMYC-1 和2 (PromoKine) (Tiamutin and Minocyclin) 一些能夠有效消除支原體的特殊特殊試劑試劑 Mycoplasma-EX (PromoKine) (抗生素/非抗生素聯(lián)合使用)PromoCell

11、Academy 6/27/2022污染污染來(lái)來(lái)源源 新鮮分離的原代細(xì)胞（人類(lèi)或者動(dòng)物組織） 與已受污染培養(yǎng)物的交叉污染 來(lái)自未知源頭的新培養(yǎng)物，甚至有些來(lái)自細(xì)胞銀行（例如ATCC） 病毒懸浮液，抗體溶液或者其他已污染培養(yǎng)基中加過(guò)的添加劑 直接污染 血清（只使用檢測(cè)過(guò)的血清，例如無(wú)微生物和支原體的） 被污染培養(yǎng)物接觸涉及的實(shí)驗(yàn)室儀器，培養(yǎng)基和試劑（CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞培養(yǎng)工程師，細(xì)胞，培養(yǎng)瓶/皿，通風(fēng)櫥，塑料器皿，培養(yǎng)基，試劑等） 系統(tǒng)地復(fù)核污染源的來(lái)源！系統(tǒng)地復(fù)核污染源的來(lái)源！PromoCell Academy 6/27/2022細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)污染的其他原因細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)污染的其他原因Promo

12、Cell Academy 6/27/2022良好的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范良好的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范 (GCCP)(GCCP)開(kāi)始開(kāi)始實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)之前之前： 消毒超凈工作臺(tái)表面消毒手/手套，尤其是大拇指及指縫（容易被忽視）在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，將所有材料和儀器（培養(yǎng)基瓶子，移液管盒，移液輔助用品）放進(jìn)超凈工作臺(tái)里面，在使用之前對(duì)所有物品進(jìn)行消毒。用70%的酒精消毒儀器表面不需立即擦干或吹干，否則沒(méi)有足夠的作用時(shí)間起到消毒效果。檢查以確保細(xì)胞沒(méi)有被污染。被污染的細(xì)胞需立即丟棄，不能再打開(kāi)培養(yǎng)瓶，防止對(duì)其他實(shí)驗(yàn)者造成交叉污染。PromoCell Academy 6/27/2022實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)中： 不要在敞開(kāi)的瓶子或者培養(yǎng)皿上方操作

13、在超凈工作區(qū)域里面或者靠近超凈工作區(qū)域的動(dòng)作不要太快否則將會(huì)阻礙超凈工作區(qū)域內(nèi)的正常氣流循環(huán)在實(shí)驗(yàn)中不要觸摸超凈工作區(qū)域外的任何東西（特別是自己的臉和頭發(fā)）以免污染乳膠手套如果乳膠手套被污染了，那么在繼續(xù)操作之前需要重新對(duì)其進(jìn)行消毒不要把沒(méi)有用的儀器堆在通風(fēng)罩里面從而阻斷氣流將所有溢出或?yàn)R出的液體擦去講話，打噴嚏或者咳嗽請(qǐng)遠(yuǎn)離超凈工作區(qū)域，以免干擾氣流/引入污染良好的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范良好的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范 (GCCP)(GCCP)PromoCell Academy 6/27/2022實(shí)驗(yàn)結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后束以后： 從超凈工作臺(tái)中取出儀器和材料之前，都需要進(jìn)行消毒 消毒超凈工作臺(tái)的臺(tái)面 根據(jù)生產(chǎn)廠商的說(shuō)明書(shū)

14、定期選用合適的消毒劑對(duì)超凈工作臺(tái)表面進(jìn)行消毒 定期使用生產(chǎn)廠商的超凈工作臺(tái)的層流罩維護(hù)服務(wù) （并記錄紫外燈的“失效”情況），這一點(diǎn)非常重要良好的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范良好的細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范 (GCCP)(GCCP)PromoCell Academy 6/27/2022消極影響消極影響： 有毒性，抑制增殖 對(duì)幾種細(xì)胞的分化有負(fù)面的影響（例如血液祖細(xì)胞） 會(huì)導(dǎo)致原代細(xì)胞的增值速率降低（抑制率高達(dá)40%）（參考文獻(xiàn)：The prophylactic use of antibiotics in cell culture, Ingrid Kuhlmann 1996） 會(huì)影響基因/蛋白的表達(dá) 會(huì)導(dǎo)致耐藥性抗生素的使用與

15、否？抗生素的使用與否？PromoCell Academy 6/27/2022 預(yù)防性地使用抗生素會(huì)使得操作人員忽視細(xì)胞培養(yǎng)中的無(wú)菌操作規(guī)范從而導(dǎo)致無(wú)菌條件的破壞 抗生素在37oC時(shí)只能維持短暫的穩(wěn)定（耐熱性能；Pen/Strep: 3天) 只有在完全確定需要時(shí)才使用抗生素： 從組織中分離原代細(xì)胞 非常珍貴和無(wú)法替代的細(xì)胞系 在誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子系統(tǒng)中 可能的話：盡量在沒(méi)有抗生素的情況下可能的話：盡量在沒(méi)有抗生素的情況下進(jìn)行進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)操作標(biāo)準(zhǔn)操作抗生素的使用與否？抗生素的使用與否？PromoCell Academy 6/27/2022細(xì)胞培養(yǎng)中的常規(guī)步驟細(xì)胞培養(yǎng)中的常規(guī)步驟 細(xì)胞的解凍 培養(yǎng)基更換 傳

16、代（細(xì)胞的“分裂”/細(xì)胞的“傳代”）PromoCell Academy 6/27/2022目標(biāo)目標(biāo)：保留盡可能多的健康有增殖能力的細(xì)胞能存活然而：然而：解凍的操作過(guò)程對(duì)細(xì)胞壓力很大 凍存液中包含DMSO作為抗凍保護(hù)劑 液體的DMSO（在解凍過(guò)程中）對(duì)細(xì)胞是有毒的：DMSO的最終濃度不能超過(guò)1%（細(xì)胞在該種情況下能耐受16-24h）因此必須因此必須： 在37oC的環(huán)境下盡快解凍細(xì)胞 在把細(xì)胞取出液氮罐之前，盡量準(zhǔn)備好所有的東西 解凍后盡快稀釋DMSO凍存細(xì)胞的解凍凍存細(xì)胞的解凍要點(diǎn)要點(diǎn)PromoCell Academy 6/27/2022解凍細(xì)胞解凍細(xì)胞步驟步驟 準(zhǔn)備好裝有培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶Pr

17、omoCell Academy 6/27/2022解凍細(xì)胞解凍細(xì)胞步驟步驟 準(zhǔn)備好裝有培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶 在CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱約30分鐘PromoCell Academy 6/27/2022解凍細(xì)胞解凍細(xì)胞步驟步驟 準(zhǔn)備好裝有培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶 在CO2培養(yǎng)基中預(yù)熱約30分鐘 將凍存管從液氮罐中取出（總在干冰或者液氮中運(yùn)輸），開(kāi)/關(guān)蓋子PromoCell Academy 6/27/2022解凍細(xì)胞解凍細(xì)胞步驟步驟 準(zhǔn)備好裝有培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶 在CO2培養(yǎng)基中預(yù)熱約30分鐘 將凍存管從液氮罐中取出（總在干冰或者液氮中運(yùn)輸），開(kāi)/關(guān)蓋子 在37C水浴中放置約90秒，解凍細(xì)胞PromoCell A

18、cademy 6/27/2022解凍細(xì)胞解凍細(xì)胞步驟步驟 準(zhǔn)備好裝有培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶 在CO2培養(yǎng)基中預(yù)熱約30分鐘 將凍存管從液氮罐中取出（總在干冰或者液氮中運(yùn)輸），開(kāi)/關(guān)蓋子 在37C水浴中放置約90秒，解凍細(xì)胞 消毒凍存管，將其中的細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的培養(yǎng)基中PromoCell Academy 6/27/2022解凍細(xì)胞解凍細(xì)胞步驟步驟 準(zhǔn)備好裝有培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶 在CO2培養(yǎng)基中預(yù)熱約30分鐘 將凍存管從液氮罐中取出（總在干冰或者液氮中運(yùn)輸），開(kāi)/關(guān)蓋子 在37C水浴中放置約90秒，解凍細(xì)胞 消毒凍存管，將其中的細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的培養(yǎng)基中 在CO2培養(yǎng)箱（37C, 5% CO2）

19、中放置大約16-24 hPromoCell Academy 6/27/2022細(xì)胞培養(yǎng)中故障的其他原因細(xì)胞培養(yǎng)中故障的其他原因PromoCell Academy 6/27/2022CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱參數(shù)參數(shù)：* 溫度* CO2 濃度* 相對(duì)濕度 能維持細(xì)胞的生理?xiàng)l件能維持細(xì)胞的生理?xiàng)l件然而：然而： * 這也是酵母菌，真菌和細(xì)菌的最佳生長(zhǎng)環(huán)境！ * 頻繁的開(kāi)門(mén)會(huì)導(dǎo)致溫度、CO2濃度和濕度的偏差PromoCell Academy 6/27/2022細(xì)胞培養(yǎng)中故障的其他原因細(xì)胞培養(yǎng)中故障的其他原因PromoCell Academy 6/27/2022更換培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基培養(yǎng)基更換的頻率和傳代的間隔

20、取決于特定細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)速率一般來(lái)說(shuō)，原代細(xì)胞培養(yǎng)中的培養(yǎng)基需每2-4天更換一次： 周一周一 周三周三 周五周五 (快生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)) 周一周一 周四周四 周一周一 (慢生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng))培養(yǎng)基更換太勤或太少都有消極的影響： 生長(zhǎng)停滯 細(xì)胞死亡PromoCell Academy 6/27/2022用用Melanocyte Growth Medium M2 培養(yǎng)的培養(yǎng)的NHEM M2 (10 x)2 2天不換培養(yǎng)基天不換培養(yǎng)基培養(yǎng)基更換太少時(shí)的細(xì)胞形態(tài)培養(yǎng)基更換太少時(shí)的細(xì)胞形態(tài)1 1周不換培養(yǎng)基周不換培養(yǎng)基 2 2周不換培養(yǎng)基周不換培養(yǎng)基PromoCell Academy 6/27/2022培養(yǎng)基

21、中的血清培養(yǎng)基中的血清血清是傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中最不確定的成分！批次間差異極大（生長(zhǎng)因子，激素，蛋白質(zhì)）建議建議： 對(duì)不同的批次進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，購(gòu)買(mǎi)并預(yù)留能在您的實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮良好功能的批次（1-3年） 如果可能的話，使用血清含量較低或者無(wú)血清的培養(yǎng)基 如果沒(méi)有必要，不要使用“熱滅活”的血清對(duì)血清加熱 (30 min, 56C) 的目的是為了滅活補(bǔ)體保存和解凍保存和解凍： 保存：在4 C可以放置6-8周；-20 C 可保存3-5年 解凍：在室溫或4oC冰箱中最理想，隨放在37C (水浴)。頻繁地晃動(dòng)以便分散釋放出來(lái)的無(wú)機(jī)鹽和蛋白質(zhì)（避免局部鹽濃度過(guò)高，避免血清溫度過(guò)高） 避免血清的反復(fù)凍/融，以免產(chǎn)生沉淀

22、PromoCell Academy 6/27/2022血清的使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)不可逆的改變血清的使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)不可逆的改變氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基 ( (無(wú)血清無(wú)血清) )Bronchial Epithelial Cells (HBEpC, 10 x)在在DMEM + 10%DMEM + 10%血清中培養(yǎng)血清中培養(yǎng)2 2天天PromoCell Academy 6/27/2022人類(lèi)成骨細(xì)胞人類(lèi)成骨細(xì)胞 貼壁的原代細(xì)胞必須在密度達(dá)到70-90%的時(shí)候傳代如果細(xì)胞長(zhǎng)得太密會(huì)導(dǎo)致接觸抑制、生長(zhǎng)停滯貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一般原則貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)一般原則PromoCell Acad

23、emy 6/27/2022預(yù)熱脫壁試劑貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022預(yù)熱脫壁試劑吸走貼壁細(xì)胞表面的生長(zhǎng)培養(yǎng)基貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022預(yù)熱脫壁試劑吸走貼壁細(xì)胞表面的生長(zhǎng)培養(yǎng)基在室溫下，用PBS（不含Ca+/Mg+）和Hanks BBS清洗細(xì)胞單層貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022預(yù)熱脫壁試劑吸走貼壁細(xì)胞表面的生長(zhǎng)培養(yǎng)基在室溫下，用PBS（不含Ca+/Mg+）和Hanks BBS清洗細(xì)胞單層吸走清洗溶液貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)

24、程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022預(yù)熱脫壁試劑吸走貼壁細(xì)胞表面的生長(zhǎng)培養(yǎng)基在室溫下，用PBS（不含Ca+/Mg+）和Hanks BBS清洗細(xì)胞單層吸走清洗溶液加入胰酶/EDTA（0.04% / 0.03%）貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022預(yù)熱脫壁試劑吸走貼壁細(xì)胞表面的生長(zhǎng)培養(yǎng)基在室溫下，用PBS（不含Ca+/Mg+）和Hanks BBS清洗細(xì)胞單層吸走清洗溶液加入胰酶/EDTA（0.04% / 0.03%）在顯微鏡下觀察脫壁過(guò)程（細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓） 胰酶的濃度和的孵育作用時(shí)間取決于細(xì)胞的類(lèi)型和細(xì)胞

25、的生長(zhǎng)密度貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培養(yǎng)基中止胰酶的脫壁作用貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培養(yǎng)基中止胰酶的脫壁作用上下吹吸以重懸細(xì)胞，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培養(yǎng)基中止胰酶的脫壁作用上下吹吸以重懸細(xì)胞，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中在220g的重力加速度下離心3-5分鐘貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)

26、程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培養(yǎng)基中止胰酶的脫壁作用上下吹吸以重懸細(xì)胞，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中在220g的重力加速度下離心3-5分鐘去除澄清的上清液，將沉淀下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)用新鮮的培養(yǎng)基重懸貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培養(yǎng)基中止胰酶的脫壁作用上下吹吸以重懸細(xì)胞，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中在220g的重力加速度下離心3-5分鐘去除澄清的上清液，將沉淀下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)用新鮮的培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞以合適的接種密度接種到一個(gè)新

27、的培養(yǎng)瓶中貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022用胰酶中止溶液或者含10%FCS的培養(yǎng)基中止胰酶的脫壁作用上下吹吸以重懸細(xì)胞，將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)離心管中在220g的重力加速度下離心3-5分鐘去除澄清的上清液，將沉淀下來(lái)的細(xì)胞團(tuán)用新鮮的培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞以合適的接種密度接種到一個(gè)新的培養(yǎng)瓶中在37C的CO2培養(yǎng)箱中孵育貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程貼壁細(xì)胞的傳代過(guò)程PromoCell Academy 6/27/2022代數(shù)代數(shù) PromoCell不用代數(shù)來(lái)計(jì)算細(xì)胞的年齡而使用倍增數(shù)（PD） passage 一詞只是描述了脫壁和重新接種的過(guò)程而不能體現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中真正的繁衍衰老過(guò)程，因?yàn)閭鞔僮鞯臅r(shí)間點(diǎn)是有彈性的： 分裂比率可能不同 傳代可能在不同的細(xì)胞密度階段 如果你實(shí)在想用Passage 這一術(shù)語(yǔ)盡量使您的操作過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化以保持相似性 在一周中的同一天分離細(xì)胞 每一個(gè)培養(yǎng)瓶中接種相同量的細(xì)胞 在每一周的相同時(shí)間更換培養(yǎng)基PromoCell Academy 6/27/2022細(xì)胞在培養(yǎng)中的衰老細(xì)胞在培養(yǎng)中的衰老人類(lèi)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞人類(lèi)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 (HPASMC) (HPASMC)培養(yǎng)后培養(yǎng)后3 3天天培養(yǎng)后培養(yǎng)后2424天天10 x10 xPromoCell Academy 6/27/2022其他補(bǔ)充和總結(jié)其他補(bǔ)充和