第14章核酸的物化性質(zhì)

1、第第1414章章 核酸的物理化學(xué)性質(zhì)核酸的物理化學(xué)性質(zhì)一、核酸的水解一、核酸的水解二、核酸的酸堿性質(zhì)二、核酸的酸堿性質(zhì)三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收四、核酸的變性、復(fù)性及雜交四、核酸的變性、復(fù)性及雜交一、核酸的水解一、核酸的水解（一）酸水解（一）酸水解對(duì)酸的敏感性：糖苷鍵磷酸酯鍵對(duì)酸的敏感性：糖苷鍵磷酸酯鍵 嘌呤嘌呤糖苷鍵嘧啶糖苷鍵糖苷鍵嘧啶糖苷鍵脫嘌呤：脫嘌呤： pH1.6，37，對(duì)水透析，對(duì)水透析 pH2.8，100，1h脫脫嘧啶：嘧啶： 98-100%甲酸，甲酸，175，2h 三氟乙酸，三氟乙酸，155，60min（DNA）或）或 80min（RNA）利用酸水解可以研究核酸的堿基組

2、成利用酸水解可以研究核酸的堿基組成2（二）堿水解（二）堿水解RNA的磷酸酯鍵對(duì)堿敏感的磷酸酯鍵對(duì)堿敏感室溫，室溫，0.31mol/L KOH，18-24h，可將，可將RNA完全水解，完全水解，得到得到2-或或3-核苷酸的混合物。核苷酸的混合物。DNA抗堿水解抗堿水解生理意義：生理意義：DNA更穩(wěn)定更穩(wěn)定 ，遺傳信息。，遺傳信息。RNA是是DNA的信使，完成任務(wù)后迅速降解。的信使，完成任務(wù)后迅速降解。3（三）酶水解（三）酶水解非特異的磷酸二酯酶：非特異的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得）得5-核苷酸核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得）得

3、3-核苷酸核苷酸特異的磷酸二酯酶特異的磷酸二酯酶：核酸酶：核酸酶N-糖苷酶糖苷酶4核酸酶核酸酶的分類(lèi)的分類(lèi)底物底物專(zhuān)一性：專(zhuān)一性：核糖核酸酶核糖核酸酶 RNase脫氧核糖核酸酶脫氧核糖核酸酶 DNase作用方式作用方式：核酸外切酶（核酸外切酶（exonuclease)、核酸內(nèi)切酶、核酸內(nèi)切酶 (endonuclease)單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶單鏈核酸酶、雙鏈核酸酶、雜鏈核酸酶磷酸磷酸二酯鍵的斷裂方式：二酯鍵的斷裂方式：5-（寡）核苷酸（寡）核苷酸3-（寡）核苷酸（寡）核苷酸 5 核酸酶（核酸酶（nuclease）ATCGTC CCGG TAGA化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)53外

4、切酶外切酶內(nèi)切酶內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶具有序列特異性的核酸酶具有序列特異性的核酸酶稱(chēng)為稱(chēng)為限制性限制性核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶6二二、核酸、核酸的酸堿性質(zhì)的酸堿性質(zhì)磷酸和堿基均能發(fā)生兩性解離。磷酸和堿基均能發(fā)生兩性解離。DNA等電點(diǎn)等電點(diǎn) 44.5RNA等電點(diǎn)等電點(diǎn) 22.5兩性電解質(zhì)：兩性電解質(zhì)：酸性的磷酸基和堿性的堿基酸性的磷酸基和堿性的堿基 電泳電泳和離子交換分離純化核酸和離子交換分離純化核酸7三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收堿基、核苷、核苷酸和核酸在堿基、核苷、核苷酸和核酸在240290nm的紫外波的紫外波段有強(qiáng)烈的段有強(qiáng)烈的光吸收。光吸收。 max=260nm8鑒定鑒

5、定純度純度純純DNA的的A260/A280應(yīng)為應(yīng)為1.8（1.65-1.85）純純RNA的的A260/A280應(yīng)為應(yīng)為2.0。若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則若溶液中含有雜蛋白或苯酚，則A260/A280比值明顯降低。比值明顯降低。含量含量計(jì)算計(jì)算1ABS值相當(dāng)于：值相當(dāng)于：50ug/mL雙螺旋雙螺旋DNA 或或：40ug/mL單鏈單鏈DNA（或（或RNA） 或或：20ug/mL寡核苷酸寡核苷酸判斷判斷DNA是否變性是否變性在在DNA的變性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)增大（的變性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)增大（增色效應(yīng)增色效應(yīng)）在在DNA的復(fù)性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)減?。ǖ膹?fù)性過(guò)程中，摩爾吸光系數(shù)減?。p色效應(yīng)減

6、色效應(yīng)）9四、核酸的變性、復(fù)性及雜交四、核酸的變性、復(fù)性及雜交(一一)變性變性 (denaturation)核酸變性核酸變性指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，不涉及共價(jià)鍵斷裂。不涉及共價(jià)鍵斷裂。102202402602800.10.20.30.4波長(zhǎng)（波長(zhǎng)（nmnm）光光吸吸收收123天然天然DNA變性變性DNA核苷酸總吸收值核苷酸總吸收值123變性變性因素：因素：熱變性熱變性 酸堿變性（酸堿變性（pH小于小于4或大于或大于11）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛）變性劑（尿素、鹽酸胍、甲醛） 變性變性后的理化性質(zhì)：后的理化性質(zhì)：260nm吸收值升高。吸收值升高。

7、粘度降低，浮力密度升高。粘度降低，浮力密度升高。二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，部分失活。11DNA的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度的變性是爆發(fā)式的，變性作用發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)。范圍內(nèi)。DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度稱(chēng)為的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)對(duì)應(yīng)的溫度稱(chēng)為解鏈溫度解鏈溫度（melting temperature, Tm）。）。12影響影響DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一均一性性均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析均一性高，變性的溫度范圍越窄，據(jù)此可分析DNA的均一性的均一性 。G-C含量含量與與Tm值值成正比成正比測(cè)定測(cè)定Tm，可推知，可推知G-

8、C含量含量。G-C%=（Tm-69.3）2.4413介質(zhì)中離子強(qiáng)度介質(zhì)中離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度高，高，Tm高。高。14（二）復(fù)性（二）復(fù)性 (renaturation) 變性變性的的DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的DNA單單鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。15（三）核酸（三）核酸分子雜交分子雜交 (Hybridization)16不同來(lái)源的不同來(lái)源的DNA單鏈間或單鏈單鏈間或單鏈DNA與與RNA之間之間只要有堿基配對(duì)的區(qū)域，在復(fù)性時(shí)可形成局部雙只要有堿基配對(duì)的區(qū)域，在復(fù)性時(shí)可形成局部雙螺旋區(qū)，稱(chēng)螺旋區(qū)，稱(chēng)核酸分子雜交核酸分子

9、雜交（hybridization）。）。制備特定的制備特定的探針探針（probe）通過(guò)雜交技術(shù)可進(jìn)行）通過(guò)雜交技術(shù)可進(jìn)行基因的檢測(cè)和定位研究基因的檢測(cè)和定位研究。1753535353提取提取DNA限制性?xún)?nèi)切酶消化限制性?xún)?nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳、堿變性瓊脂糖凝膠電泳、堿變性轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤膜，高溫烘烤與與DNA雜交雜交放射自顯影放射自顯影Southern blotting可用于可用于DNA之間之間同源性分析，確同源性分析，確定特異性定特異性DNA序序列的大小和定位。列的大小和定位。Southern印跡法印跡法 19Northern Blotting研究對(duì)象是研究對(duì)象是mRNA，探針一般是，探針一般是DNA?？偪俁NA或或mRNA需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛需在變性條件下電泳（乙二醛、甲醛）。）。Western Blotting抗原抗原與抗體的雜交與抗體的雜交研究對(duì)象是蛋白質(zhì)，研究對(duì)象是蛋白質(zhì)，“探針探針”是抗體。是抗體。2021小結(jié)小結(jié) 核酸的分子組成以及核苷酸之間的連接方式。核酸的分子組成以及核苷酸