肝癌H22石蠟切片的制作

1、石蠟切片法（一） -取材、固定、洗滌、脫水一、 實(shí)驗(yàn)原理 材料的選擇是制作切片的第一步，用于制片的動(dòng)物、植物材料應(yīng)選擇新鮮的，用陳腐的材料制片，往往不能反映材料的真實(shí)情況。 固定就是將新鮮材料投入某類化學(xué)藥液中，借助化學(xué)藥品的作用使細(xì)胞組織的形態(tài)保存下來(lái)不使其改變形態(tài)和變質(zhì)的過(guò)程。 材料經(jīng)過(guò)固定液作用以后，內(nèi)部滲入很多固定液，一定要把滲入里面的固定液洗去，否則留在材料中的固定液有的會(huì)妨礙染色，有的會(huì)發(fā)生沉淀或結(jié)晶，影響觀察，有的繼續(xù)作用，使材料變壞等。所以材料中的固定液必須徹底洗凈。 材料經(jīng)過(guò)洗滌后含有大量水分，必須用脫水劑脫盡里面的水分，以利于材料的透明和制片的保存，因?yàn)樗诶锩婺苁共牧戏纸?/p>

2、，而且透明劑與水是不相混合的，只有在完全無(wú)水的情況下，透明劑才能完全透入。二、 實(shí)驗(yàn)用品（一） 器材 解剖刀，解剖針，解剖剪，鑷子，解剖盤(pán)，培養(yǎng)皿，吸管。（二） 試劑 福爾馬林-酒精-醋酸混合固定液（簡(jiǎn)稱FAA），10中性福爾馬林，秦克（Zenker）氏液，卡諾（Carnoy）氏液，各級(jí)酒精（30、50、70、80、90、95、100）。（三） 材料 一般動(dòng)物組織。三、 實(shí)驗(yàn)程序（一） 取材1. 取材的方法 取材應(yīng)根據(jù)需要，用鋒利的刀片從所需部位上切取一小塊放在固定液中固定。動(dòng)物組織的切片，厚度不超過(guò)3mm，體積不大于1.5×1.5×0.5cm。材料的選擇和切取部位也很重要

3、。2. 取材的注意事項(xiàng)（1） 取材動(dòng)作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。（2） 切取材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。（3） 切取病理材料時(shí)，應(yīng)特別注意不能將有病的組織損傷，為了和正常無(wú)病組織相區(qū)別，在取材時(shí)除了切取病理材料外，正常的組織也須切取一部分，以便作比較觀察。（二） 固定1. 固定的方法取到新鮮材料，應(yīng)按材料的種類、大小、性質(zhì)和制作要求，立即將材料投入固定液加以固定，使其形態(tài)結(jié)構(gòu)和成分被化學(xué)試劑固定下來(lái)，與生活時(shí)保持相仿。小鼠肝癌組織固定于10甲醛固定液中。固定的時(shí)間，視材料的種類、大小、性質(zhì)、固定液的種類與性質(zhì)、滲透力的強(qiáng)弱等而

4、定，可以從12h到十幾小時(shí)或二十幾小時(shí)，甚至可以長(zhǎng)至幾天。一些小的材料，僅須幾十分鐘。如：兔肝固定于Zenker氏液或Carnoy氏液里，固定時(shí)間為1224h。2. 固定的注意事項(xiàng)（1） 一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用。（2） 有些混合固定液的成分之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合。如果混合太早，固定時(shí)就沒(méi)有作用了。（3） 固定材料時(shí)，固定液必須充足，一般為材料塊的2030倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換12次新液。（4） 材料固定完畢后，保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里，同時(shí)在容器外貼上標(biāo)簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)

5、簽，以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來(lái)源、日期等。標(biāo)簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書(shū)寫(xiě)。（三） 洗滌材料自固定液中取出后，須立即洗滌，所用的沖洗液應(yīng)依固定液的性質(zhì)而定。1. 固定液為酒精或酒精混合液，一般不沖洗。若需洗滌則必須用與固定的酒精相近濃度的酒精沖洗。2. 用含有苦味酸的固定液的材料（苦味酸與福爾馬林混合的固定液除外），需要用70的酒精反復(fù)浸洗。3. 含有鉻酸、重鉻酸接的，必須用流水沖洗。沖洗時(shí)間應(yīng)與固定時(shí)間相同或更長(zhǎng)。4. 用福爾馬林固定的，一般可以不沖洗，但長(zhǎng)期固定于福爾馬林的材料應(yīng)充分水洗。5. 含四氧化餓的固定液用水沖洗。6. 固定液含有氯化汞的，應(yīng)根據(jù)溶劑的性質(zhì)用水

6、或酒精沖洗。一般的洗滌方法，將材料放入指管或廣口瓶，并加半管水，用紗布將管口扎住，然后倒置于水槽內(nèi)，這樣可以使指管半沉半浮于水中。打開(kāi)水龍頭，讓材料按沖洗的時(shí)間在流水中沖洗。注意水流不能太急，以免沖壞材料。流水沖洗的時(shí)間可根據(jù)材料和固定液的情況而定，一般需要1224h。（四） 脫水1. 脫水的方法 脫水一般多使用酒精，為了不使材料急劇收縮，應(yīng)用不同濃度的酒精，自低濃度到高濃度逐級(jí)脫水。一般的材料可以從30的濃度開(kāi)始，經(jīng)50、70、80、90、95直至純酒精。在用純酒精時(shí)，需要換2次（使徹底脫水）。對(duì)于一些薄嫰、柔弱的材料，可依次經(jīng)10、20、30每級(jí)相差10直至純酒精。 在每級(jí)酒精中停留的時(shí)間

7、，依照材料的大小、性質(zhì)以及留在固定液中的時(shí)間長(zhǎng)短和固定液溶解性而定。一般動(dòng)物組織如小白鼠的腎臟24mm厚，每級(jí)停12h。2. 脫水注意事項(xiàng)（1） 脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分。（2） 在更換高一級(jí)的脫水劑時(shí)，最好不要移動(dòng)材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水紙吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于器皿中加入高一級(jí)脫水劑。（3） 在低濃度酒精中，每級(jí)停留不宜太長(zhǎng)，負(fù)責(zé)易使組織變軟，助長(zhǎng)材料的解體。（4） 在高濃度或純酒精中，每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長(zhǎng)，否則會(huì)使組織變脆，影響切片。（5） 如需過(guò)夜，應(yīng)停留在70酒精中。（6） 脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色渾

8、濁現(xiàn)象。 石蠟切片法（二） -透明、透蠟、包埋一、 實(shí)驗(yàn)原理 材料在脫水以后，所用的大多數(shù)脫水劑（酒精、丙酮等）不能和石蠟相混合，而透明劑即可與脫水劑相混合又能和石蠟相混合，因而可通過(guò)透明劑的作用把脫水劑替換出來(lái)，使石蠟?zāi)茼樌剡M(jìn)入材料中。當(dāng)材料中全部為透明劑占有時(shí)，材料可呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)。 蠟是將材料中的透明劑逐步清除，以致完全由石蠟充分滲透。 包埋就是把被石蠟浸透的材料連同熔化的石蠟，一起倒入一定形狀的容器（如紙盒）內(nèi)，并立即投入冷水中，使它立即凝固成含材料的蠟塊，以備切片。二、 實(shí)驗(yàn)用品（一）器材 恒溫箱，溫臺(tái)，熔蠟爐，蠟杯，紙盒，酒精燈，鑷子，解剖針，面盆。（二）試劑無(wú)水酒精，二

9、甲苯，石蠟。（三）材料已脫水的動(dòng)物材料。三、 實(shí)驗(yàn)程序（一） 透明1. 透明的方法 透明過(guò)程也是漸次由低濃度到高濃度。脫水的材料一般先在純酒精和透明劑各半的混合液中浸漬12h，然后再轉(zhuǎn)入純透明劑中透明。透明浸漬的時(shí)間可視材料情況而定，一般30min到2h。在純二甲苯中應(yīng)更換二次，總的停留時(shí)間以不超過(guò)3h為宜。2. 透明注意事項(xiàng)（1） 使用透明劑時(shí)，要隨時(shí)蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進(jìn)入。（2） 更換每級(jí)透明劑，動(dòng)作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。（3） 在透明過(guò)程中，如果材料周?chē)霈F(xiàn)白色霧狀，說(shuō)明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。（二） 透蠟1.

10、透蠟的方法 石蠟透入動(dòng)物組織的方法是：材料自透明劑中取出后先移入透明劑和石蠟等量的混合液（蠟杯）約1530min，然后進(jìn)入純石蠟中（蠟杯），換新鮮石蠟（蠟杯）一次。總的石蠟透入時(shí)間約11.5h；如組織塊小（約2mm×3mm×3mm），通過(guò)3個(gè)杯子的時(shí)間合計(jì)30min已足夠；組織塊大約（3mm×3mm×10mm）的，不僅每次轉(zhuǎn)換的時(shí)間要延長(zhǎng)，還需要多加一只杯子，共需2h左右。2. 透蠟注意事項(xiàng)（1） 盡量保持在較低溫度中進(jìn)行，以石蠟不凝固為度；（2） 透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；（3） 操作要迅速，力求在最短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過(guò)程，以免引起組織變硬、變

11、脆、收縮等。（三） 包埋1. 包埋的工具（1） 溫臺(tái)：為了避免在包埋時(shí)石蠟立即凝固，包埋要在溫臺(tái)中進(jìn)行。（2） 酒精燈：放在溫臺(tái)下加溫用。（3） 恒溫箱：透蠟和包埋都要在恒溫箱中進(jìn)行。（4） 紙盒：作為包埋用的容器。（5） 鑷子：要放在恒溫箱中預(yù)熱，否則當(dāng)移取材料時(shí)，鑷子尖端的石蠟容易凝固。（6） 面盆或水槽：內(nèi)放入冷水作冷卻石蠟之用。2. 包埋的操作過(guò)程包埋時(shí)，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺(tái)上，從恒溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速輕輕地用溫鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動(dòng)材料，使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢地平

12、放在面盆或水槽中的水面上，待紙盒內(nèi)石蠟的表面凝固，即可將紙盒向一側(cè)傾斜，使冷水從一邊浸入紙盒，并立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。 石蠟切片法（三） -切片、貼片一、 實(shí)驗(yàn)原理切片就是把包埋好的材料塊用切片機(jī)切成所需要的厚度的切片帶。貼片是用粘貼劑把切片平鋪貼在載玻片上，以便于染色。二、 實(shí)驗(yàn)用品（一） 器材切片機(jī)，切片刀，磨刀機(jī)或磨刀石，單面刀片，展片臺(tái)，酒精燈，溫度計(jì)，蠟鏟，臺(tái)木，毛筆，蠟帶盤(pán)，載玻片，鑷子。（二） 試劑粘片劑，氯仿。（三） 材料以包埋好的蠟塊。三、 實(shí)驗(yàn)程序（一） 切片1. 切片前的準(zhǔn)備工作包埋好的石蠟塊裝在切片機(jī)上進(jìn)行

13、切片前還須做以下的準(zhǔn)備工作。（1） 石蠟快的固著：石蠟塊要進(jìn)行切片前，要先把它固著在臺(tái)木上，然后裝在切片機(jī)的夾持部分進(jìn)行切片。石蠟塊的固著方法如下：先將蠟塊用單面刀片切成方形或長(zhǎng)方形，然后四周留下23mm寬的石蠟。點(diǎn)燃酒精燈，然后用考熱的蠟鏟放在臺(tái)木和蠟塊之間，利用蠟鏟的溫度熔化兩者的蠟，抽出蠟鏟，在蠟塊上略加壓力，蠟塊就粘附在臺(tái)木上。（2） 整修：石蠟塊固著后稍放片刻，讓它完全凝固后就可以進(jìn)行修快。修快就是用單面刀片將蠟塊四周修整平行。如果上下兩面不平行的話，則切出的蠟帶會(huì)彎曲。其次，如果組織的上下、左右的蠟留得太多，那么每一切片所占的位置大，在一張載玻片上只能貼幾個(gè)切片，既不經(jīng)濟(jì)，鏡檢時(shí)也

14、不方便。（3） 磨刀：切片刀鋒利與否對(duì)切片的質(zhì)量有很大的關(guān)系，若切片刀遲鈍或有了缺口以后將會(huì)引起切片的斷裂、破碎、不完整或厚度不勻及皺折等現(xiàn)象。所以切片前一定要先把刀磨好。切片刀的刃磨一般有兩種：一種是機(jī)磨，另一種為手工磨。2. 切片機(jī)切片機(jī)的式樣很多，性能也不一樣，多數(shù)切片機(jī)除進(jìn)行石蠟切片外，還可安裝冷凍裝置進(jìn)行冷凍切片。一般常用的切片機(jī)為輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)。3. 切片的方法現(xiàn)將輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片的方法簡(jiǎn)述如下：（1） 將以固定和修好的石蠟塊臺(tái)木裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。（2） 將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。（3） 搖動(dòng)推動(dòng)螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過(guò)刀口。（4） 調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與

15、位置，刀片與石蠟切片約成15°左右。（5） 調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般410µm。（6） 一切調(diào)整好后就可以開(kāi)始切片。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以4050r/min為宜。（7） 切成的蠟帶到2030cm長(zhǎng)時(shí)，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。（8） 用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻片上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。（9） 切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存。（二） 貼片1

16、. 取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑于玻璃中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均勻薄層。2. 滴12滴的蒸餾水于已涂粘片劑的載玻片上。3. 用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開(kāi)的蠟帶，放在水面上，注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標(biāo)簽。4. 把玻片置于預(yù)先加熱的展片臺(tái)上（溫度保持在4045）。此時(shí)蠟片因受熱而伸展攤平。5. 展片后把載玻片放在平盤(pán)上編好記號(hào)置于37的溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。 石蠟切片法（四） -染色、封藏染色是生物制片中最重要的環(huán)節(jié)之一，只有通過(guò)染色，細(xì)胞和組織才顯得更清楚，微小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)才得以分辨。一、 實(shí)驗(yàn)原理1. 染色

17、的一般原理細(xì)胞和組織的不同結(jié)構(gòu)之所以能被染成各種不同顏色，是由于染料對(duì)它們所起的物理或化學(xué)的綜合作用。（1）物理作用 滲透作用：染料滲透到多孔的組織中，與組織沒(méi)有牢固的結(jié)合。 吸收作用：組織吸收染料中的色素粒子，與之牢固結(jié)合，組織著色與燃料的顏色相同，不一定與干燥燃料的顏色相同，如品紅在干燥狀態(tài)時(shí)為綠色，而其溶液呈紅色。組織在染色后也呈紅色，即使組織干燥后，其紅顏色仍不變。 吸附作用：染液中分散的色素粒子進(jìn)入被染物質(zhì)的粒子間隙內(nèi)，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色。也由于各種蛋白質(zhì)或膠體有不同的吸附面，因此可以吸附不同的離子。也就是說(shuō)對(duì)離子的吸附有選擇性，即有的容易被某些物質(zhì)吸附，有的則

18、不容易吸附。（2）化學(xué)作用：生物細(xì)胞內(nèi)含有酸性和堿性物質(zhì)，分別可與燃料中的陽(yáng)離子和陰離子互相結(jié)合，這種反應(yīng)使組織細(xì)胞染上顏色。例如,細(xì)胞核含酸性物質(zhì)，易與堿性染料蘇木精結(jié)合，細(xì)胞核被染上顏色。細(xì)胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，易與酸性染料伊紅中有染色作用的陰離子結(jié)合，細(xì)胞質(zhì)為伊紅所染。但是，嗜堿性和嗜酸性只是相對(duì)的，若標(biāo)本在堿性染料液內(nèi)留置過(guò)久，細(xì)胞質(zhì)也可著上堿性燃料的顏色。 上述這兩個(gè)主要的染色理論，若單獨(dú)用一種學(xué)說(shuō)來(lái)解釋所有的染色現(xiàn)象都是有困難的。染色的機(jī)制是很復(fù)雜的，目前了解得不很清楚。目前比較明確地認(rèn)為，染色主要是由于物理作用與化學(xué)作用綜合發(fā)生作用的結(jié)果。2. 封藏的原理封藏是使已經(jīng)透明的材料，保存在

19、適合折光率的封藏劑中（如封藏劑加拿大樹(shù)膠的折光率為1.52，它與玻璃的折光率1.51很接近），使材料能在顯微鏡下清晰的顯示出來(lái)，并能長(zhǎng)期保存。脂肪和類脂（磷脂、糖脂、固醇脂等）統(tǒng)稱為脂類。它是構(gòu)成人體組織的正常成分，不溶于水而易溶于酒精、乙醚、氯仿等脂溶劑中。在化學(xué)組成上，脂類屬于脂肪酸的酯或與這些酯有關(guān)的物質(zhì)。脂類的主要功能是氧化供能。脂肪主要存積于脂肪組織中，并以油滴狀的微粒存在脂肪細(xì)胞漿內(nèi)。在病理檢驗(yàn)中，脂類染色法最常用以證明脂肪變性，脂肪栓子以及腫瘤的鑒別。脂類染色使用最廣泛的染料是蘇丹染料，最常用的有蘇丹，蘇丹，蘇丹黑及油紅O 等。脂肪被染色，實(shí)際上是蘇丹染料被脂肪溶解吸附而呈現(xiàn)染料的顏色。經(jīng)研究認(rèn)為組織中脂質(zhì)在液態(tài)或半液態(tài)時(shí)，對(duì)蘇丹染料著色效果最好。根據(jù)這一原理，適當(dāng)提高溫度（37-60）對(duì)組織切片染色效果是有好處的。脂類染色，用冰凍或石蠟切片，以水溶性封固劑封固，如甘油明膠和阿拉伯糖膠等。二、 實(shí)驗(yàn)用品（一） 器材染色缸，酒精燈，樹(shù)膠瓶，鑷子，蓋玻片，顯微鏡。（二） 試劑 70酒精。染色液0.5蘇木精，蘇丹，甘油明膠，蒸餾水。（三） 材料已切好的石蠟切片。三、 實(shí)驗(yàn)程序蘇丹(