第五章分子生物學(xué)研究法(上)3

1、分子生物學(xué)基本研究法（上）分子生物學(xué)基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù)及蛋白質(zhì)操作技術(shù)第五章 扉頁(yè)：扉頁(yè)： 當(dāng)你進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要像脫去外衣那樣放下你當(dāng)你進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時(shí)，要像脫去外衣那樣放下你的想象力，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作中不能有一丁點(diǎn)兒的想象，的想象力，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作中不能有一丁點(diǎn)兒的想象，否則，你對(duì)事物的觀察就會(huì)受影響；當(dāng)你翻開書本否則，你對(duì)事物的觀察就會(huì)受影響；當(dāng)你翻開書本的時(shí)候，你又必須盡可能展開想象的的時(shí)候，你又必須盡可能展開想象的“翅膀翅膀”，否，否則，你就不可能走在別人的前面。則，你就不可能走在別人的前面。5.4 SNP的理論與應(yīng)用 SNP的定義定義：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性 ( singl

2、e nucleotide polymorphism，SNP) 主要是指在基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。 是第三代遺傳標(biāo)記。5.4.1 SNP概述 單倍型：是指位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)。 SNP分類： cSNP 同義cSNP 非同義cSNP pSNP rSNP基因調(diào)控區(qū)基因調(diào)控區(qū)SNP基因間隨機(jī)非編碼區(qū)基因間隨機(jī)非編碼區(qū)SNP基因編碼區(qū)基因編碼區(qū)SNP5.4.2 SNPs經(jīng)典檢測(cè)方法 一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測(cè)方法,如: 1 . 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法 PCR-RFLP ; 2 .單鏈構(gòu)象多態(tài)性法 PCR-SSCP ; 3 . 變性梯

3、度凝膠電泳 ( denaturing gradient gel eletrophoresis DGGE ); 4 .等位基因特異性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等PCR-RFLP方法 原理：原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性，用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片斷，如果存在SNP位點(diǎn)，酶切片斷的長(zhǎng)度和數(shù)量則會(huì)出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位點(diǎn)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點(diǎn)必須含有該限制內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，它是SNP篩查中最經(jīng)典的方法之一.PCR-RFLP原理圖單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP) 原理：原理：?jiǎn)捂淒N

4、A 在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)在電泳中會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴于堿基的組成，單個(gè)堿基的改變也會(huì)影響其構(gòu)象，最終會(huì)導(dǎo)致在凝膠上遷移速度的改變。 在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈 DNA 和RNA 分子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象，這樣在凝膠上的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測(cè)SNP。特點(diǎn)：特點(diǎn)：由于該方法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測(cè)。這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置。變性梯度凝膠電泳（DGGE） 原理：原理：是利用長(zhǎng)度相同的雙鏈 DNA片段解鏈溫度不同的原理,通過梯度變性膠將 DNA片段分開的電泳技術(shù)。 電泳開始時(shí),DNA 在膠

5、中的遷移速率僅與分子大小有關(guān), 而一旦DNA 泳動(dòng)到某一點(diǎn)時(shí), 即到達(dá)該DNA 變性濃度位置時(shí), 使得DNA 雙鏈開始分開,從而大大降低了遷移速率。當(dāng)遷移阻力與電場(chǎng)力平衡時(shí), DNA 片段在凝膠中基本停止遷移。由于不同的DNA 片段的堿基組成有差異, 使得其變性條件產(chǎn)生差異, 從而在凝膠上形成不同的條帶。等位基因特異 PCR ( AS-PCR)原理：原理：根據(jù) SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物,其中一條鏈(特異鏈)的3末端與 SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同) ,另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì),因此,AS-PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因?yàn)樘禺愐镌谝环N基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物,在另一種基因型中沒

6、有擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú),從而確定基因型的 SNP。5.4.3 SNPs高通量的檢測(cè)方法 另一大類檢測(cè)方法是近些年來發(fā)展起來的, 高通量、 自動(dòng)化程度較高的檢測(cè) SNPs的方法,較為常用的有: 1 . DNA測(cè)序法; 2 . DNA芯片檢測(cè); 3 . 飛行質(zhì)譜儀 (MALDI- TOFMS )檢測(cè); 4 . 變性高效液相色譜 ( DHPLC )法等等DNA測(cè)序法 直接測(cè)序是最容易實(shí)施的SNP檢測(cè)方法。原理原理: 通過對(duì)不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測(cè)序和序列比較, 以確定所研究的堿基是否變異, 其檢出率可達(dá)100%。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：可以得到SNP 的類型及其準(zhǔn)確位

7、置等SNP分型所需要的重要參數(shù)?；蛐酒夹g(shù)( Genechips) 原理原理: :是將具有特定堿基序列的探針固定在特殊的載體上，待測(cè)基因經(jīng)提取、熒光標(biāo)記后，與固定好的探針進(jìn)行雜交，最后根據(jù)熒光的強(qiáng)度和種類測(cè)出待測(cè)序列的堿基類別。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：基因芯片具有信息量大和自動(dòng)化程度高的突出優(yōu)點(diǎn)。但它也存在若干問題: 芯片造價(jià)高昂, 所需設(shè)備貴重, 不利于普及應(yīng)用。MALDI-TOF 原理：原理：是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過與硅芯片上的化合物共價(jià)結(jié)合后, 在硅芯片上進(jìn)行引物的退火, 延伸反應(yīng), 突變部位配對(duì)的堿基與正常配對(duì)的堿基不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰

8、而檢測(cè)SNP。變性高效液相色譜( DHPLC)原理：原理：目標(biāo)核酸片段PCR擴(kuò)增，部分加熱變性后，含有突變堿基的DNA序列由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈。因包含錯(cuò)配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對(duì)的同源配對(duì)區(qū)和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來, 從而達(dá)到分離的目的。SNPs的有無(wú)最終表現(xiàn)為色譜峰的峰形或數(shù)目差異,依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的堿基。特點(diǎn)：特點(diǎn)：使用高效液相色譜檢測(cè)SNPs具有檢測(cè)效率高，便于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)未知SNPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。但DHPLC檢測(cè)對(duì)所用試劑和環(huán)境要求較高,容易產(chǎn)生誤差, 不能檢測(cè)出純合突變。 SNP及突變研究的最新工具

9、高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting）High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列變化的是基于有序列變化的Amplicon之間微弱的之間微弱的Tm值差異，通過值差異，通過DNA片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測(cè)，比如：片段熔解曲線的差異進(jìn)行突變檢測(cè)，比如：5.4.4 SNP的應(yīng)用Gene SNP by bioinformatics 真核生物基因組龐大，含有大量重復(fù)序列。真核生物基因組龐大，含有大量重復(fù)序列。無(wú)論是電泳分離技術(shù)還是通過雜交的方法，無(wú)論是電泳分離技術(shù)還是通過雜交的方法，都難以直接分離到目的基因片段。都難以直接分離到目的基因片段

10、。 盡管高等生物一般具有盡管高等生物一般具有3-5萬(wàn)種左右不同的萬(wàn)種左右不同的基因，在單個(gè)細(xì)胞或組織的特定時(shí)間段中，基因，在單個(gè)細(xì)胞或組織的特定時(shí)間段中，僅有僅有15-20%左右的基因得以表達(dá)。左右的基因得以表達(dá)。5. 5 基因克隆技術(shù) cDNA克隆的基本過程是通過一系列酶催作克隆的基本過程是通過一系列酶催作用，使總用，使總poly（A）mRNA轉(zhuǎn)變成雙鏈轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA群體并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)群體并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌寄主菌株細(xì)胞，構(gòu)成包含所有化大腸桿菌寄主菌株細(xì)胞，構(gòu)成包含所有基因編碼序列的基因編碼序列的cDNA基因文庫(kù)。基因文庫(kù)?；蚬こ袒静襟E 目的DNA 制

11、備；載體DNA選擇DNA體外重組技術(shù) （ DNA酶切實(shí)驗(yàn)、 連接實(shí)驗(yàn)）重組DNA的轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)染）試驗(yàn) 重組克隆的篩選與鑒定（重組體的表型篩選，（重組體的表型篩選，指紋圖譜法， PCR方法，探針雜交法 ） 目的基因表達(dá)產(chǎn)物的篩選與鑒定（遺傳互補(bǔ)法，免疫化學(xué)法遺傳互補(bǔ)法，免疫化學(xué)法Western印雜交法，微細(xì)胞法微細(xì)胞法(microcell method)基因工程流程示意圖基因工程流程示意圖5.5.1 RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增末端快速擴(kuò)增)5RACE1.在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以已在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以已知基因片段內(nèi)部。特異性引物知基因片段內(nèi)部。特異性引物啟始啟始cDNA第一條鏈的合成第一條鏈的合

12、成2.RNase混合物降解模板混合物降解模板mRNA，純化，純化cDNA第一條鏈。第一條鏈。3.用末端轉(zhuǎn)移酶在用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈鏈3端端加入連續(xù)的加入連續(xù)的dCTP4.以連有以連有oligo(dG)的錨定引的錨定引物和基因片段內(nèi)部特異的物和基因片段內(nèi)部特異的nested引物進(jìn)行引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增，以期得到目的片段，并可用期得到目的片段，并可用nest PCR進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行檢測(cè)。5.5.2 應(yīng)用應(yīng)用cDNA差示分析法克隆基因差示分析法克隆基因 該法通過降低該法通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片段。因?yàn)榉椒?，特異性擴(kuò)

13、增目的基因片段。因?yàn)門ester和和Driver在在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。 每次每次T減減D反應(yīng)后僅設(shè)置反應(yīng)后僅設(shè)置72復(fù)性與延伸，復(fù)性與延伸，94變性這兩變性這兩個(gè)參數(shù)共個(gè)參數(shù)共20個(gè)個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)，PCR產(chǎn)物的特異性和所得探針產(chǎn)物的特異性和所得探針的純度非常高。的純度非常高。 RDA流程圖。5.5.3 TA載體載體Topo TA載體載體Invitrogen Proprietary & Confidential3

14、8Different ways to generate the entry clone2.2.TOPO CloningTOPO CloningTOPOTOPOBP ClonaseBP Clonase1.1.BP CloningBP CloningPCR ProductPCR Product+ +TOPO-ActivatedTOPO-ActivatedEntry VectorEntry VectorL1L1L2L2GeneGene+ +attB attB PCR ProductPCR ProductB2B2GeneGeneB1B1Donor VectorDonor VectorP2P2ccdBc

15、cdBP1P1Entry CloneEntry CloneL2L2GeneGeneL1L1+ +digested DNA Fragmentdigested DNA FragmentGeneGeneB1B1digested Entry Vectordigested Entry VectorL2L2L1L14. Pre-made entry clone4. Pre-made entry clone5. Custom-made entry clone5. Custom-made entry cloneLigaseLigase3.3.Restriction/Ligase CloningRestrict

16、ion/Ligase CloningORF CollectionORF CollectionL2L2ORFORFL1L1MultiSite Gateway - Extending the applicationsYour ApplicationYour ApplicationGene1Gene1Gene2Gene2Gene3Gene3Gene4Gene4Your ApplicationYour ApplicationGeneGeneProteinProteinLocalizationLocalizationGeneGeneGeneGeneProteinProteinPurificationPu

17、rificationGeneGeneRNAiRNAiGeneGeneCell-FreeCell-FreeGeneGeneProteinProtein interactioninteractionGeneGeneGeneGeneEntry CloneEntry ClonePCRPCRGeneGenesynthesissynthesisORFORFcollectioncollectionLibraryLibraryYourYourSourceSourceGateway大規(guī)模克隆技術(shù)大規(guī)?？寺〖夹g(shù) 大量的基因組序列被測(cè)定，要闡明這些基因大量的基因組序列被測(cè)定，要闡明這些基因的功能需要將不同的可譯框架

18、連入載體，傳的功能需要將不同的可譯框架連入載體，傳統(tǒng)的方法不能滿足大規(guī)?？寺〉男枰＝y(tǒng)的方法不能滿足大規(guī)模克隆的需要。 Gateway基因大規(guī)模克隆法：利用基因大規(guī)?？寺》ǎ豪檬删w噬菌體進(jìn)行位點(diǎn)特異性進(jìn)行位點(diǎn)特異性DNADNA片段重組，實(shí)現(xiàn)了基因片段重組，實(shí)現(xiàn)了基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移?？焖倏寺『洼d體間平行轉(zhuǎn)移。 Entry載體上的載體上的CCCTT被拓?fù)洚悩?gòu)酶識(shí)別，切被拓?fù)洚悩?gòu)酶識(shí)別，切開后通過開后通過274位酪氨酸位酪氨酸與切口處的磷酸基團(tuán)形與切口處的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)鍵，加入成共價(jià)鍵，加入PCR產(chǎn)物后，形成的產(chǎn)物后，形成的3突出突出端端GTGG,攻擊攻擊PCR產(chǎn)產(chǎn)物的互補(bǔ)性末端并與

19、接物的互補(bǔ)性末端并與接頭序列頭序列CACC退火，切退火，切去去GTGG后使后使PCR產(chǎn)產(chǎn)物以正確方向連入物以正確方向連入Entry載體載體5.5.4基因的圖位克?。∕ap-based cloning）5.6 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù) 1995年，首次發(fā)表關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)年，首次發(fā)表關(guān)于蛋白質(zhì)組學(xué)（proteome）概念的論文。）概念的論文。 蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)白質(zhì) 蛋白質(zhì)組學(xué)是指在蛋白質(zhì)組水平上研究蛋蛋白質(zhì)組學(xué)是指在蛋白質(zhì)組水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯與修飾

20、、蛋白與蛋白相互作用等，并由譯與修飾、蛋白與蛋白相互作用等，并由此獲得相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞代謝等此獲得相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展及細(xì)胞代謝等過程的整體認(rèn)識(shí)過程的整體認(rèn)識(shí) 5.6.1雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù) 5.6.2蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法 5.6.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù) 5.6.1雙向電泳技術(shù)雙向電泳技術(shù) 等電聚焦電泳（等電聚焦電泳（Isoelectric focusing, IFE） 利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場(chǎng)作用利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場(chǎng)作用下在凝膠內(nèi)沿電場(chǎng)方向制造一個(gè)下在凝膠內(nèi)沿電場(chǎng)方向制造一個(gè)pH梯度。梯度。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠

21、電泳（SDS-PAGE） 在有去污劑十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯在有去污劑十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺凝膠電泳。酰胺凝膠電泳。依賴于蛋白質(zhì)的兩個(gè)性質(zhì)：等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量依賴于蛋白質(zhì)的兩個(gè)性質(zhì)：等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時(shí)，每種蛋當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品在這樣的凝膠上電泳時(shí)，每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的白質(zhì)都將遷移至與它的pI 相一致的相一致的pH處，具有不同處，具有不同pI的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的的各種蛋白質(zhì)最后都遷移至凝膠中相應(yīng)的pH處，處，達(dá)到分離的目的。達(dá)到分離的目的。 蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合后，充分結(jié)合后，SDS負(fù)電荷掩負(fù)電荷掩蓋或消除了不

22、同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差蓋或消除了不同種類蛋白質(zhì)分子之間原有的電荷差異。異。 這樣的蛋白質(zhì)這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在復(fù)合物在SDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子量凝膠系統(tǒng)中的電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子量大小。大小。如果將等電聚焦電泳與如果將等電聚焦電泳與SDS-PAGE結(jié)合起結(jié)合起來，就是分辨率更高的雙向電泳。雙向電泳后來，就是分辨率更高的雙向電泳。雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向的凝膠經(jīng)染色蛋白呈現(xiàn)二維分布圖，水平方向反映出蛋白在反映出蛋白在pI上的差異，而垂直方向反映出上的差異，而垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e。所以雙向電

23、泳可以將它們?cè)诜肿恿可系牟顒e。所以雙向電泳可以將分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)以及等電點(diǎn)分子量相同而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)以及等電點(diǎn)相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開。相同而分子量不同的蛋白質(zhì)分開。蛋白質(zhì)樣品蛋白質(zhì)樣品電泳電泳非標(biāo)記抗體（一抗非標(biāo)記抗體（一抗）發(fā)生免疫反應(yīng)）發(fā)生免疫反應(yīng)熒光素酶或放射性同位素?zé)晒馑孛富蚍派湫酝凰貥?biāo)記的第二抗體起反應(yīng)標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)通過顯色或放射自顯影法通過顯色或放射自顯影法檢測(cè)凝膠中的蛋白質(zhì)成分檢測(cè)凝膠中的蛋白質(zhì)成分轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素薄膜）轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素薄膜）方法：方法：圖圖528免疫印跡法示意圖免疫印跡法示意圖封閉封閉影響免疫印跡法成敗的因素：影響免疫印跡法成敗的

24、因素：用于檢測(cè)的二級(jí)抗體一般分為以下三種用于檢測(cè)的二級(jí)抗體一般分為以下三種 1. 放射性標(biāo)記的抗體放射性標(biāo)記的抗體 2. 與酶偶聯(lián)的抗體：與酶偶聯(lián)的抗體： 主要包括：辣根過氧化物酶主要包括：辣根過氧化物酶 堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶 3. 與生物素相偶聯(lián)的抗體與生物素相偶聯(lián)的抗體western blot實(shí)驗(yàn)步驟視頻Western Blot - SNAP i.d System5.6.3 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析技術(shù) 基質(zhì)輔助的激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF） 電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）質(zhì)譜基礎(chǔ)質(zhì)譜基礎(chǔ)樣品樣品離子源離子源質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器離子檢測(cè)器離子檢測(cè)器固體固體液體

25、液體蒸汽蒸汽形成離子形成離子(帶電分子帶電分子)電離電離質(zhì)量分選質(zhì)量分選(過濾過濾)檢測(cè)檢測(cè)根據(jù)根據(jù)m/z分選離子分選離子數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理質(zhì)譜質(zhì)譜檢測(cè)離子檢測(cè)離子基本步驟基本步驟:1. 樣品離子化樣品離子化 2. 根據(jù)質(zhì)量根據(jù)質(zhì)量(m/z)不同分離離子不同分離離子3. 檢測(cè)每種質(zhì)量離子的數(shù)目檢測(cè)每種質(zhì)量離子的數(shù)目 4. 收集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖收集、處理數(shù)據(jù)得到質(zhì)譜圖 質(zhì)譜的評(píng)價(jià)指標(biāo)質(zhì)譜的評(píng)價(jià)指標(biāo) 質(zhì)量范圍質(zhì)量范圍 速度速度 靈敏度靈敏度 分辨率分辨率 精確度精確度+自由漂移區(qū)自由漂移區(qū)檢測(cè)器檢測(cè)器基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)樣品探針樣品探針激光激光335 nmm/z相對(duì)強(qiáng)度相對(duì)強(qiáng)度MH+MH+MH+特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高靈敏度高準(zhǔn)確度高準(zhǔn)確度高分辨率高分辨率高質(zhì)量范圍廣質(zhì)量范圍廣圖譜簡(jiǎn)明圖譜簡(jiǎn)明速度快速度快ESI四級(jí)桿質(zhì)量分析器四級(jí)桿質(zhì)量分析器碰撞室碰撞室反射器反射器MCP檢測(cè)器檢測(cè)器碰撞氣體碰撞氣體串聯(lián)質(zhì)譜法串聯(lián)質(zhì)譜法 (MS/MS)ESI-Q-TOF 質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀步驟：步驟：1 1質(zhì)量分析質(zhì)量分析 2 2碰撞碰撞( (離子裂解離子裂解) )3 3質(zhì)量分析質(zhì)量分析TOF質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器 強(qiáng)的抗背景干擾能力強(qiáng)的抗背景干擾能力 極高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確極