微生物脂肪酶應用及研究進展

1、 微生物脂肪酶應用及研究進展 摘 要 微生物脂肪酶主要來源于真菌和細菌，它是一類能夠催化酯的水解反應以及在非水相體系中催化脂肪酸和醇類發(fā)生酯化反應的酶類。因其具有高底物專一性、區(qū)域選擇性和對映選擇性，而被廣泛應用。本文主要論述了脂肪酶的結構、脂肪酶的理化性質以及脂肪酶在食品行業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、紡織和化工工業(yè)方面的應用，并對其未來的發(fā)展進行了展望。關鍵詞 脂肪酶，酯化，應用，研究進展Progress in research and application of microbial lipase Abstract Microbial lipases are mainly derived from fu

2、ngi and bacteria, it is a kind of can catalyze hydrolysis of ester and enzyme catalyzed esterification of fatty acids and alcohols in non aqueous system. Because of its high substrate selectivity, regioselectivity and enantioselectivity, and is widely used. This paper mainly discusses the structure,

3、 properties and application of lipase in food industry, medicine, industry, and the future of its development was prospected.Key words lipase, esterification, application, research progress of 脂肪酶( EC 3.1.1.3) 又稱三?；视王；饷?，廣泛存在于動植物和微生物體內。脂肪酶不僅可水解三脂酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸（其中的二脂酰甘油可進一步被水解為一脂酰甘油、甘油和游離脂肪酸），并且能催化

4、水解反應的逆反應酯化反應(張數政，1984)。目前脂肪酶生產主要有提取法和微生物發(fā)酵法。由于微生物脂肪酶種類多， 作用溫度及范圍比動植物脂肪酶廣、 底物專一性高， 并且便于工業(yè)生產和獲得較高純度的酶制劑，因此微生物脂肪酶已成為工業(yè)生產脂肪酶的主要來源，關于脂肪酶在工業(yè)應用的研究也越來越多 。并且隨著非水酶學的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)，脂肪酶在非水相中能夠催化酯化、酯交換以及轉酯化反應，并且具有高度的選擇性和專一性，已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、洗滌劑等行業(yè)，特別是在食品行業(yè)中得到了大量的應用，并逐漸成為食品領域中應用最為廣泛的酶類之一（劉虹蕾等，2012）。談重芳等（2006）在微生物脂肪酶在工業(yè)中的應用及

5、研究進展對目前微生物脂肪酶在工業(yè)中的應用進行了綜述，包括食品工業(yè)、紡織和化工工業(yè)、洗滌添加劑、廢水處理添加劑、醫(yī)藥、造紙行業(yè)以及手性藥物的合成等，并展望了脂肪酶的研究方向及前景。蘭立新和肖懷秋（2010）在微生物脂肪酶應用研究進展對脂肪酶在食品工業(yè)、有機合成、生物柴油合成、手性藥物合成等方面的應用研究近況進行了綜述，并進行了展望。智倩等(2013)在微生物脂肪酶的研究進展中對脂肪酶菌種來源、催化類型及特性、脂肪酶的分子生物學及其在工業(yè)上的應用幾方面進行了簡要的概述，并對其未來發(fā)展進行了展望。最近10年，對脂肪酶的研究越來越深入，特別是在產脂肪酶的菌株誘變育種及基因克隆等方面的研究也取得長足進展

6、?，F(xiàn)將近幾十年來人們在各個行業(yè)對脂肪酶的應用及研究進展整理綜述如下。1 脂肪酶的來源早在100多年前，就有人開始從事脂肪酶的研究。隨著兔胰脂肪酶、胃脂肪酶和植物種子脂肪酶的相繼報道，微生物脂肪酶在20世紀初也被發(fā)現(xiàn)（王小花等，2005）。微生物脂肪酶的研究雖然起步較晚，但脂肪酶在微生物有廣泛的分布，因而近30年來，深入研究的微生物脂肪酶不斷增加，并應用到了工業(yè)生產中，其中曲霉、根霉、假單胞菌、地細菌、芽孢桿菌等是主要生產菌。根據文獻初步估計，自然界中的微生物大約有65個屬可產脂肪酶，其中放線菌4個屬，細菌28個屬，酵母10個屬，其他真菌23個屬（智倩等，2013）。2 脂肪酶的結構特點2.1

7、脂肪酶的多樣性與保守性到目前為止，大約2000多種脂肪酶及相關酶的冗余序列被提交到蛋白質數據庫。所有已知的脂肪酶沒有特征性的相似序列。相反，它們呈現(xiàn)出驚人的多樣性。在微生物酯酶及脂肪酶數據庫中，脂肪酶被分為16個超家族，39個同源家族。（Kang H Y and Kim M H，2006）它們的唯一共性是都有一個Gly-Z-Ser-W-Gly（在少數情況下，甘氨酸被其他小的殘基取代）的五肽序列；肪酶的一級序列不同，是所有脂肪酶表現(xiàn)為相同的結構框架，所謂的/水解酶折疊，且它們有相同的催化機制。這種結構的保守性是一種非常有用的工具，可以幫助對新酶進行分類鑒定，即使這些酶沒有明顯的序列相似性。典型的

8、/水解酶折疊的基礎是一個位于核心的，幾乎是8個平行的-折疊束構成，其中只有一束2是反平行的。不同來源的脂肪酶空間結構主要差別在于-疊束和-螺旋的數量以及-折疊角度和-螺旋的空間排列（Fickers P et al,2011）。2.2 “ 蓋子 ”結構脂肪酶通過與水/物界面的相互作用來獲得不同的構象狀態(tài)，關閉構象狀態(tài)時”子”覆蓋在酶的活性位點上，難以靠近底物分子.轉變到開放構象狀態(tài)時，催化通道入口打開。近年來發(fā)現(xiàn)蓋子的作用不僅僅是調節(jié)底物靠近活性位點的大門，蓋子是兩性分子結構，在關閉狀態(tài)#酶的結構是親水端面對溶劑，疏水端朝向蛋白質的內部，當酶轉變到開放狀態(tài)時，疏水端會暴露出來隱藏親水殘基團，在絲

9、氨酸殘基周圍形成親電子域，引起脂肪酶的構象改變，增加了酶與脂類底物的親和性，并穩(wěn)定了催化過程中過渡態(tài)中間產物( 酶分子周圍通常保留一定量的水分)從而保證了脂肪酶在油/水界面和脂相中的自體激活。3 微生物脂肪酶的理化性質微生物脂肪酶分子量一般在 19000 60000u。多數脂肪酶含碳水化合物糖蛋2%15%，以甘露糖為主碳水化合物部分對于催化活性并無貢獻，Semerive 等已證明 R.arrhine 脂肪酶自溶去除碳水化合物后具有更高的活性，而碳水化合物存在于脂肪酶中的作用至今尚不十分清楚。脂肪酶的性質研究主要包括最佳溫度與pH 、溫度與 pH 穩(wěn)定性、水解油脂的專一性與脂肪酸種類專一性等幾個

10、方面。位置專一性對于脂肪酶的工業(yè)應用是一項極為重要的性質,許多脂肪酶的位置專一性得到了詳細研究,如 Penicill ium sp 、Mucor miehei 為1 , 3-專一脂肪酶,而Candida cylindracea 、Pseudomonas sp 、Rhizopus sp 則為隨機酶。有些脂肪酶對脂肪酸具有高度專一性,來源于葡萄孢屬的一種脂肪酶對長鏈不飽和脂肪酸和亞油酸具有專一性，F(xiàn)usar-ium oxysporum 脂肪酶優(yōu)先作用于飽和脂肪酸。脂肪酶的催化特性在于: 在油水界面上其催化活力最大,這早在 1958 年被 Sarda 和 Desnnelv 發(fā)現(xiàn)。所謂的界面被認為是兩

11、個彼此分離的完全不同的相差,在分子水平上相當于兩個臨接的有序分子層,一個比較親水,一個比較疏水。對界面的形成可提高脂肪酶活性的理論解釋如下: 1 所有脂肪酶的一級結構都相似,包括重要區(qū)域 His -Gly- Z-Ser-Gly和Y- Gly -His -Ser-W-Gly( 這里X 、Y 、Z 、W 表示基因氨基酸殘基); 2 活性部位的絲氨酸殘基被 a -螺旋掩蓋,當脂肪酶與界面接觸時 a-螺旋打開,這導致脂肪酶通過在絲氨酸周圍創(chuàng)造一親電區(qū)域,暴露疏水殘基,增加與脂類底物的親和力并保持催化過程中過渡中間產物穩(wěn)定分離純化。4 脂肪酶在食品行業(yè)的應用4.1 糖酯的合成糖酯是以糖基為親水基團，脂肪

12、酸為疏水基團，同時具有親水性和親油性的一種非離子型生物表面活性劑。通過改變糖酯的脂肪酸碳鏈的長度和糖基上羥基的數目，可以調節(jié)其親水親油平衡值，最高可達11-13，最低可以到3.5-4.0，因而酯既可作為水包油型乳化劑，又可作為油包水型乳化劑( 朱振元和李盛峰，2011)。糖酯類食品添加劑具有優(yōu)良的表面活性、生物可降解性、無臭、無刺激等優(yōu)點某些糖酯還具有抑菌、抗病毒等活性，現(xiàn)已作為食品乳化劑、質地改良劑、保鮮殺菌劑、抗老化劑等廣泛應用于食品工業(yè)（吳秋明等，2004）。4.2 油脂改性生成類可可脂可可脂 CocoaButter CB 是從可可豆中提取的，具有特殊功能的天然油脂，液態(tài)呈琥珀色，固態(tài)呈

13、淡黃色或乳黃色，具有濃厚而獨特的香味。CB 在 27°C 以下是堅硬和易碎的，當溫度越過很窄的區(qū)間時，大多數 CB 開始熔化當溫度達到35°C時，基本全熔，這種熔融特性正是CB 適用于制作巧克力類食品的關鍵（王紅等，2009）。CB 是巧克力中唯一的連續(xù)相，對于其他所有成分的分散和巧克力的物理特性都至關重要它能賦予巧克力順滑的質地、特殊的風味和一定的光澤。4.3 母乳化結構脂的研制母乳是嬰兒最為重要的食品，為嬰兒的生長發(fā)育提供必需的營養(yǎng)。當由于個人文化經濟和健康等原因而導致無法進行母乳喂養(yǎng)時，嬰兒配方奶粉則是一種比較適合的替代品。由于目前業(yè)界沒有就哪種營養(yǎng)配比最適合嬰兒的成

14、長達成共識，所以模仿母乳的結構是較為理想和安全的做法。母乳脂肪中脂肪酸的組成因哺乳階段（初乳、過渡乳、成熟乳）飲食、種族、地理位置等不同而有所不同，也有一些共同點：在總脂肪酸中，油酸25%-35%，棕櫚酸20%-30%，亞油酸10-20%，其中70%的棕櫚酸位于sn-2位油酸主要分布在sn-13位上。游離棕櫚酸的熔點高于人的體溫，在小腸的堿性環(huán)境下易與鈣、鎂等反應形成不溶性的皂化物質，不能被小腸細胞吸收而排出體外，長久會造成鈣質的流失和脂肪能量的損失。同時，這些皂化物會提高嬰兒糞便硬度導致便秘和腹痛，甚至還可能會引發(fā)腸梗阻（袁小武，2008）。5 紡織和化工工業(yè)中的應用5.1 脫脂脂肪酶在絹紡

15、、皮毛、皮革、明膠等的脫脂方面都取得了良好的效果。解脂假絲酵母脂肪酶可使絹紡原料的油脂含量從10%降到0.5%，達到紡絲要求，而且不影響纖維強度。脂肪酶也能除去皮革膠原纖維間的脂肪和用于皮毛脫脂，不僅具有不影響皮革厚度和牢度的優(yōu)點，且皮毛產品豐滿柔軟，彈性好。經脂肪酶處理后能除去明膠液中的小液滴，還可去掉儀器抹布及光學元件上沾染的油污，使產品質量和潔凈程度提高。5.2 制備化工產品和試劑利用脂肪酶能水解、合成和轉脂肪酸的作用性質，可制備化學方法生產成本較高的化工產品。芥酸及其衍生物具有廣泛的化工用途，可用于石油化工、紡織 日化工業(yè)、輕工業(yè)、 塑料工業(yè)等。近年來，由于芥酸用途的拓寬和國際市場對芥

16、酸需求的增大，國內外均加大了芥酸的生產。目前芥酸的生產方法是高溫高壓下水解高芥酸菜籽油和芥子油，然后精餾得到高純度的產品?？蒲腥藛T發(fā)現(xiàn)，用解脂假絲酵母和地霉脂肪酶聯(lián)合作用于菜籽油，可生產芥酸、甘油、飽和脂肪酸、脂肪醇等產品。用酶法生產芥酸，作用條件低，產品的純度高，是以后芥酸生產的一個發(fā)展方向。5.3 洗滌添加劑和廢水處理添加劑在洗滌劑中加入脂肪酶，能提高洗滌劑的去污能力并降低表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量，減少去污劑對環(huán)境的污染。6 醫(yī)藥工業(yè)中的應用脂肪酶可作為幫助消化、降低血脂、治療局部炎癥的藥物，假單胞菌新種脂肪酶有類似于脂蛋白的特性，能分解血中的低密度脂蛋白和乳糜微粒E可用來治療和預防高

17、血脂病。脂肪酶還可作為臨床診斷脂血病、胰腺炎等疾病的依據之一，市場上已有作血脂分析用的酶制劑出售（周麗清和李煒煊，2004）。7 應用前景近年來隨著生物技術的興起，脂肪酶的研究特別是對產脂肪酶的菌株誘變育種也取得了很大的進步，在食品、牛奶、香水、化妝品和醫(yī)藥中添加天然成分的產品越來越受消費者青睞。而同樣的原料用化學法生產的產物則不受歡迎因此，天然成分在今后將會具有很大的需求，這使生物催化劑極具吸引力，因此，脂肪酶在油脂、食品、醫(yī)藥洗滌劑等領域具有廣闊的應用前景。參考文獻（References）Fickers P，Marty A，Nicaud J M，et al. 2011. The lipas

18、es from Yarrouia lipolytica：Genetics，production，rerulation，biochemical characterization and biotechnological applications. Bitoechnology Advances，29(6)：632-644.Kang H Y ，Kim H.，2006. MELDB：A database for microbial esterases and lipases. FEBS Letters，580（11）：2736-2740.劉虹蕾, 繆銘, 江波, 張濤，2012. 微生物脂肪酶的研究應用. 食品工業(yè)科技, 33(12): 377-388. 蘭立新, 肖懷秋, 2010. 微生物脂肪酶應用研究進展. 安徽農業(yè)科學, 38