微生物菌種鑒定與保藏學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1微生物菌種鑒定微生物菌種鑒定(jindng)與保藏與保藏第一頁，共64頁。2內(nèi)容菌種篩選(shixun)菌種鑒定菌種保藏第1頁/共64頁第二頁，共64頁。3微生物代謝(dixi)產(chǎn)物的平板檢測方法有機(jī)酸有機(jī)酸: 檸檬酸:pH指示劑的顏色變化,或摻入瓊脂平板的碳酸鈣的溶解.胞外酶胞外酶:1.淀粉酶:由碘指示的可溶性淀粉的液化2.蛋白酶:酪蛋白的溶解3.脂酶:乳化的三丁酸甘油酯的消化,清除或向橄欖油瓊脂中添加0.05-0.25%的OsO4溶液4.果膠酶:果膠凝膠的液化(1.5%的聚果膠酸鈉),多糖沉淀劑5.彈性蛋白酶:彈性蛋白的溶解6.核酸酶(DNA,RNA):未水解的核酸的沉淀,酸過量時

2、可見混濁.或者氮蒽橙熒光和紫外熒光7.磷酸脂酶C:卵磷脂平板的混濁圈8.磷酸脂酶A:卵磷脂平板的透明圈9.纖維素酶:纖維素平板的透明圈10.酯酶:氯化鈣和Tween20釋放出的月桂酸反應(yīng)生成月桂酸鈣沉淀.或者7-羥-4甲基香豆素?zé)晒夥磻?yīng). DNA酶:亞甲胺藍(lán)的DNA熒光變化 過氧化酶:噴灑對-茴香堿-過氧化氫酶抑制劑酶抑制劑:(用含酶的瓊脂平板上的抑制圈篩選)1.胰蛋白酶抑制劑:2.蛋白酶抑制劑 其他的代謝物其他的代謝物:1.脂類. 酵母的脂類營養(yǎng)缺陷型的生長譜來撿出2 . N A D : 以 豬 流 感 嗜 血 菌 （haemophilus inflluenzae ）的生長譜來撿出3.雌激素

3、:噴灑對硝基苯重氮鹽 （1%在50%乙酸中）形成紅色撿出4.chlorostatin: Euglena gracilis 褪綠圈 第2頁/共64頁第三頁，共64頁。4第3頁/共64頁第四頁，共64頁。5第4頁/共64頁第五頁，共64頁。6第5頁/共64頁第六頁，共64頁。7影印(yngyn)法第6頁/共64頁第七頁，共64頁。8顯微鏡 第一代 第二代 第三代第7頁/共64頁第八頁，共64頁。9細(xì)菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)(jigu)觀察在顯微鏡下觀察細(xì)菌(xjn)個體的形態(tài)細(xì)菌形態(tài)受培養(yǎng)時間(shjin)、培養(yǎng)基成分、濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間(shjin)等發(fā)生變化。第8頁/共64頁第九頁，共64頁。10

4、第9頁/共64頁第十頁，共64頁。11第10頁/共64頁第十一頁，共64頁。12鏈霉菌第11頁/共64頁第十二頁，共64頁。13第12頁/共64頁第十三頁，共64頁。14第13頁/共64頁第十四頁，共64頁。15第14頁/共64頁第十五頁，共64頁。16第15頁/共64頁第十六頁，共64頁。17 來源于不同微生物的抗生素放線菌產(chǎn)生 鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、利福霉素 慶大霉素、麥迪霉素、林可霉素等真菌產(chǎn)生 青霉素、頭孢菌素C等細(xì)菌產(chǎn)生 多粘菌素、桿菌肽等 目前已篩選出抗生素達(dá)9000種以上，每年(minin)還新增百余種。投入生產(chǎn)的僅百余種。菌種菌種發(fā)酵工業(yè)發(fā)酵工業(yè)(gngy)的核心的核心第16

5、頁/共64頁第十七頁，共64頁。18Current Methods of Identification第17頁/共64頁第十八頁，共64頁。19第18頁/共64頁第十九頁，共64頁。20 BIOLOG以檢測微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過程中產(chǎn)生的酶與四唑類物質(zhì)（如TTC、TV）發(fā)生顏色反應(yīng)(fnyng)和濁度差異為基礎(chǔ)，運(yùn)用獨(dú)有的顯型排列技術(shù)檢測出每種微生物的特征指紋圖譜，在大量試驗(yàn)和數(shù)學(xué)模型基礎(chǔ)上，建立起指紋圖譜與微生物種類相對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。檢測時通過智能軟件將待鑒定微生物的圖譜與數(shù)據(jù)庫參比，即可得出鑒定結(jié)果。第19頁/共64頁第二十頁，共64頁。21分離分離(fnl)純化純化平板擴(kuò)大平

6、板擴(kuò)大(kud)培養(yǎng)培養(yǎng)制備菌懸液制備菌懸液調(diào)整濁度調(diào)整濁度接種培養(yǎng)接種培養(yǎng)獲取結(jié)果獲取結(jié)果第20頁/共64頁第二十一頁，共64頁。22The Bacterial Identification ProcessStep 1Step 2Step 3Step 4Step 5Isolate a pure culture on Biolog mediaDo a Gram stain and determine testingprotocolPrepare inoculum at specified cell densityInoculate and incubate MicroPlateRead Mic

7、roPlate and determine ID第21頁/共64頁第二十二頁，共64頁。23The Fungi Identification ProcessStep 1 Step 2 Step 3 Step 4 Step 5 Isolate a pure culture on Biolog media Harvest spores from the Fungi Prepare inoculum at specified cell density Inoculate and incubate MicroPlate Read MicroPlate every 24 hours and determ

8、ine Identification 第22頁/共64頁第二十三頁，共64頁。24Pure Cultures are ImportantKrieg, Bergeys Manual, 1986第23頁/共64頁第二十四頁，共64頁。25第24頁/共64頁第二十五頁，共64頁。26Microlog1Microlog2Microlog3(Microstation)培養(yǎng)基培養(yǎng)基BUG，BUABUG，BUABUG，BUA，BUY鑒定板鑒定板GN2,GP2,ANGN2,GP2,ANGN2,GP2,AN,YT,FF接種液接種液GN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IFGN/GP-IFAN-IF,F

9、F-IF其它通用消耗品其它通用消耗品疏基乙酸鈉，水楊酸鈉，試管架，吸嘴，加樣槽，一次性疏基乙酸鈉，水楊酸鈉，試管架，吸嘴，加樣槽，一次性移液管，長棉簽，木制接種棒。移液管，長棉簽，木制接種棒。第25頁/共64頁第二十六頁，共64頁。27微生物鑒定(jindng)（95種碳源）微生物研究(ynji)GN2鑒定(jindng)革蘭氏陰性好氧菌GP2鑒定革蘭氏陽性好氧菌AN 鑒定厭氧菌YT 鑒定酵母菌FF 鑒定絲狀真菌SFN2用于革蘭氏陰性放線菌和真菌代謝研究SFP2用于革蘭氏陽性放線菌和真菌代謝研究ECO用于微生物特性和群落分析研究（31）MT2用于微生物代謝研究（不含碳源）ES 用于埃希氏大腸桿

10、菌沙門氏菌的研究 （95種碳源）第26頁/共64頁第二十七頁，共64頁。28第27頁/共64頁第二十八頁，共64頁。29第28頁/共64頁第二十九頁，共64頁。30Electron micrograph of strain ZJB-05174 cells 第29頁/共64頁第三十頁，共64頁。31分子分子(fnz)遺傳學(xué)鑒定遺傳學(xué)鑒定 第30頁/共64頁第三十一頁，共64頁。32Genomic DNA extraction 第31頁/共64頁第三十二頁，共64頁。33Primers design 16S/18S rDNA sequence amplification第32頁/共64頁第三十三頁

11、，共64頁。34Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)第33頁/共64頁第三十四頁，共64頁。35第34頁/共64頁第三十五頁，共64頁。36第35頁/共64頁第三十六頁，共64頁。37第36頁/共64頁第三十七頁，共64頁。38第37頁/共64頁第三十八頁，共64頁。39第38頁/共64頁第三十九頁，共64頁。40第39頁/共64頁第四十頁，共64頁。41第40頁/共64頁第四十一頁，共64頁。42第41頁/共64頁第四十二頁，共64頁。43第42頁/共64頁第四十三頁，共64頁。44第43頁/共64頁第四十四頁，共64頁。45第44頁/

12、共64頁第四十五頁，共64頁。46第45頁/共64頁第四十六頁，共64頁。47第46頁/共64頁第四十七頁，共64頁。48第47頁/共64頁第四十八頁，共64頁。49第48頁/共64頁第四十九頁，共64頁。50第49頁/共64頁第五十頁，共64頁。51第50頁/共64頁第五十一頁，共64頁。52第51頁/共64頁第五十二頁，共64頁。53第52頁/共64頁第五十三頁，共64頁。54定義定義(dngy) 菌種保藏菌種保藏是指在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌是指在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株的基礎(chǔ)上，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰株的基礎(chǔ)上，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不污染以便于研究

13、、交換和使用的目的。、不污染以便于研究、交換和使用的目的。 第二節(jié)第二節(jié) 工業(yè)工業(yè)(gngy)微生物菌種的保藏微生物菌種的保藏第53頁/共64頁第五十四頁，共64頁。55 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，人工創(chuàng)造條件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變件，使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平，缺氧狀異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平，缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于“休眠休眠”狀態(tài)，抑制其繁殖能狀態(tài)，抑制其繁殖能力。力。 一種好的保藏方法一種好

14、的保藏方法(fngf)，首先應(yīng)能長期保持菌種原有，首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變。的優(yōu)良性狀不變。 菌種保藏菌種保藏(bocng)的原理的原理第54頁/共64頁第五十五頁，共64頁。56 菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：菌種保藏的方法很多，一般有下面幾種：A 斜面冰箱保藏法斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面斜面保藏是一種短期、過渡的保藏方法，用新鮮斜面接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子接種后，置最適條件下培養(yǎng)到菌體或孢子(boz)生長豐滿生長豐滿后，放在后，放在4冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月。冰箱保存。一般保存期為三個月到六個月。第55頁/共6

15、4頁第五十六頁，共64頁。57第56頁/共64頁第五十七頁，共64頁。58C、石蠟油封存法、石蠟油封存法 向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，向培養(yǎng)成熟的菌種斜面上，倒入一層滅過菌的石蠟油，用量要高出斜面一厘米，然后用量要高出斜面一厘米，然后(rnhu)保存在冰箱中。此保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細(xì)菌、霉菌、酵母等法可通用于不能利用石蠟油作碳源的細(xì)菌、霉菌、酵母等微生物的保存。微生物的保存。 保存期約一年左右。保存期約一年左右。第57頁/共64頁第五十八頁，共64頁。59D、真空冷凍干燥保減法、真空冷凍干燥保減法 真空冷凍干燥保藏法是目前常用的較理想的一種方法。

16、真空冷凍干燥保藏法是目前常用的較理想的一種方法。其基本原理是在較低的溫度下（其基本原理是在較低的溫度下（15），快速將細(xì)胞凍），快速將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。在這結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生樣的環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生變異。變異。 因此，菌種可以保存很長時間，一般因此，菌種可以保存很長時間，一般5年左右。這種保藏年左右。這種保藏方法雖然需要一定的設(shè)備，要求亦比較嚴(yán)格，但由于該方方法雖然需要一定的設(shè)備，要求亦比較嚴(yán)格，但由于該方法保藏效果好，對各種法保藏效果好，對各種( zh

17、n)微生物都適用。所以，國微生物都適用。所以，國內(nèi)外都已較普遍地應(yīng)用。內(nèi)外都已較普遍地應(yīng)用。第58頁/共64頁第五十九頁，共64頁。60 這種方法的基本操作過程是先將微生物制成懸浮液，再與保護(hù)劑混合，然后放在特制的安瓶管內(nèi)，用低溫酒精或干冰，使其迅速凍結(jié)，在低溫下用真空泵抽干，最后將安瓿管真空熔封，并低溫保藏。 保護(hù)劑一般采用脫脂牛奶或血清。保護(hù)劑的作用可能是在冷凍干燥的脫水過程中代替結(jié)合水而穩(wěn)定細(xì)胞成分（細(xì)胞膜）的構(gòu)型，防此細(xì)胞膜因?yàn)閮鼋Y(jié)而破壞。保護(hù)劑還可以起支持作用，使微生物疏松(sh sn)地固定在上面。牛奶可以離心或加熱的方法脫脂。第59頁/共64頁第六十頁，共64頁。61E 液氮超低溫保藏法液氮超低溫保藏法 國外較普遍國外較普遍(pbin)采用，是適用范圍最廣的微生物采用，是適用范圍最廣的微生物保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其它保藏保藏法。尤其是一些不產(chǎn)孢子的菌絲體，用其它保藏方法不理想，可用液氮保臧法。其保存期最長。方法不理想，可用液氮保臧法。其保存期最長。a 原理原理 用液氮能長期保存菌種。這是因?yàn)橐旱臏囟瓤捎靡旱荛L期保存菌種。這是因?yàn)橐旱臏囟瓤蛇_(dá)一達(dá)一196，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其新陳代謝作用停止