纈沙坦在犬體外循環(huán)下對未成熟心肌保護的實驗研究

1、纈沙坦在犬體外循環(huán)下對未成熟心肌保護的實驗研究劉帥洲1，劉邕波2*，劉陶文2，李琪1(1、桂林醫(yī)學(xué)院，廣西桂林，541004；2、廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院，廣西桂林，541003)摘要：目的探討纈沙坦預(yù)處理在犬體外循環(huán)(CPB)下對未成熟心肌的保護作用及其可能機制。方法：將16只同種健康幼犬隨機分為實驗組和對照組各8只，實驗組術(shù)前1周給予纈沙坦(10mg/kg/d)，對照組術(shù)前1周給予生理鹽水(10mg/kg/d)，常規(guī)建立體外循環(huán)下行心內(nèi)直視手術(shù)動物模型，測定兩組不同時點血清中肌鈣蛋白-I(cTn-I)、月中瘤壞死因子a(TNF-a)水平的變化以及各相應(yīng)時段采集同一心肌組織0.5cm3固定液

2、中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，SP免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達。結(jié)果對照組cTn-I和TNF-a在CPB®間逐漸升高，恢復(fù)正常灌注后升高更明顯；實驗組cTn-I和TNF-a雖也有升高，但較對照組低，且恢復(fù)正常灌注后無明顯升高趨勢。實驗組Bax表達較對照組減弱，Bcl-2表達則較對照組增強。結(jié)論纈沙坦預(yù)處理在犬體外循環(huán)下可通過減少炎癥介質(zhì)(TNF-a)釋放，降低Bax蛋白表達，提高Bcl-2蛋白表達，從而抑制心肌細胞凋亡，避免心肌的缺血/再灌注損傷，達到對未成熟心肌的保護作用。關(guān)鍵詞：纈沙坦；未成熟心??；心肌保護；體外循環(huán)；犬ExperimentalStudyOfProte

3、ctiveEffortOfValsartanPretreamentOnImmatureMyocardiumUnderCardiopulmonaryBypassInDogLIUShuai-zhou1,LIUYong-bo2,LIUTao-wen2,LIQi1(1.GuilinMedicalCollege,Guilin,541004,China;2.DepartmentofCardiothoracicSurgery,GuangxiZhuangAutonomousRegionNanxishanHospital,541001,China)Abstract:ObjectToinvestigateprot

4、ectiveeffortofValsartanpretreamentonimmaturemyocardiumundercardiopulmonarybypassindog.MethosSisteenhealthyanghomogeneousminordogswererandomlydividedintotwogroups,theobservedgroupofferValsartan(10mg/kg/d)oneweekinpreoperative,thecontrolgroupofferphysiologicalsaline(10mg/kg/d)oneweekinpreoperative,rou

5、tineestablishopen-heartsurgeryonbeatingheartundercardiopulmonarybypassanimalmodel.ThebloodsampleweretakenindifferenttimeandthechangesofcTn-I、TNF-aweremeasuredandinrelevanttimecollecthomo-cardiac-tissue(0.5cm3)fixationinfixationfluid,routineparaffinembedding、slice，SPimmunohistochemistrytestBax、Bcl-2p

6、roteinexpress.ResultThelevelofcTn-I、TNF-ainthecontrolgroupincreasedgraduallyduringCPB,whichwereespeciallyhigheraftertherecoveryofperfusion.ThelevelofcTn-I、TNF-aintheobservedgroupalsoincreasedduringCPB,butlowerthatinthecontrolgroupandtherewasnoincreasingtrendaftertherecoveryofperfusion.Theobservedgro

7、upBaxproteinexpresslowerthanthecontrolgroup,andtheBcl-2proteinpresentoppositionresult.ConclusionValsartonpretreatmentthroughreducemediatorsofinflammationrelease,recedeBaxproteinexpress,improveBcl-2proteinexpress,restraincardiacmuscleapoptosis,availablyavoidischemiareperfusioninjury,canofferpreferabl

8、emyocardialprotectionprocess.Keyword：Valsartan；ImmatureMyocardium；Myocardialprotection；CardiopulmonaryBypass；Dog體外循環(huán)(CardiopulmonaryBypass,CPB)是心內(nèi)直視手術(shù)過程中的一項重要技術(shù)支持，心肌細胞缺血/再灌注損傷是影響心肌保護的主要因素，細胞凋亡(cellapoptosis)為重要的發(fā)生機制之一，因此減輕CPBS術(shù)期心肌細胞缺血/再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡，對提高未成熟心肌保護效果有重要意義。AT1受體拮抗劑纈沙坦臨床上主要用于治療原發(fā)性高血壓、心力衰竭等

9、，有較好保護心功能和改善冠脈血流量的作用1,本研究旨在探討繳沙坦對CPB術(shù)后缺血/再灌注(ischemiareperfusion，I/R)心肌細胞凋亡有無抑制作用。1 材料與方法1.1 材料實驗幼犬由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供；纈沙坦購自天大藥業(yè)有限公司；犬心肌鈣蛋白I(cTn-I)試劑盒購自美國ADL公司；月中瘤壞死因子a(TNF-a)試劑盒購自上海研生實業(yè)有限公司；Bax、Bcl-2試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。1.2動物分組及制模1.1.1 動物分組同種健康本地幼犬(<8周)16只，雌雄不限，體質(zhì)量2.5-3.5Kg，隨機分為實驗組(纈沙坦組10mg/kg/d術(shù)前灌胃一

10、周)和對照組(生理鹽水組10mg/kg/d術(shù)前灌胃一周)各8只，兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。1.1.2 動物模型制備實驗幼犬術(shù)前禁食飲。苯巴比妥鈉30-45mg/Kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規(guī)備皮消毒，下肢靜脈建立液體通路，經(jīng)口氣管插管接小動物呼吸機行機械通氣，F(xiàn)iO260%潮氣量10ml/kg,頻率16-18次/分，依據(jù)血氣PaCO2調(diào)整呼吸參數(shù)。針式電極監(jiān)測心電圖。經(jīng)胸骨正中切口，暴露心臟，打開心包并懸吊，全身肝素化4mg/kg,主動脈根部做荷包縫合后行主動脈插管，同樣右心耳插管，建立CPBSam900琳外循環(huán)機，寧波菲拉爾模肺。CPB預(yù)沖林格氏液60ml,羥乙基淀粉注射液50ml,術(shù)中C

11、PB灌注量維持在150-170ml/(kgmin),依平均動脈壓調(diào)整。開始CPB后，逐步進行全身降溫，維持肛溫28-30，阻斷上、下腔靜脈及升主動脈，灌注針插入主動脈根部灌注灌注4冷晶體停搏液(首次劑量15ml/kg)使心電活動消失，同時停止機械通氣，30min后再灌注心臟停搏液5ml/kg,主動脈阻斷持續(xù)60min,擬開放主動脈前氣，于血流動力學(xué)穩(wěn)定后逐漸停止CPB主動脈開放后120min采集標本后處死實驗動物，以從開胸到主動脈開放后120min生命體征平穩(wěn)為制模成功。1.3 標本采集分別在CPB前10min(T1),主動脈開放后60min(T2)、120min(T3)采集同一部位心肌組織0

12、.5cm3固定液中固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度為5pm待行免疫組化測定。及上述三個時間點血液各2ml,3000轉(zhuǎn)/分離心，取上精液置-80C保存待測定。1.4 標本檢測用SP免疫組織化學(xué)法檢測B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、B細胞淋巴瘤相關(guān)X基因(Bax)蛋白表達。ELISA檢測各組上精液樣本中cTn-I、TNF-a的含量。具體檢測方法按試劑說明書進行。測定值用血細胞比容(HCT)校正，其公式為實際值-測定值XCPB1HCT柳亥ijHCT1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(X±S)表示，各均數(shù)比較采用兩組間獨立樣本資料的t檢

13、驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果兩組各時間點cTn-I、TNF-a水平測定結(jié)果見表1。表一兩組各時間點血清cTn-I及TNF-“含量比較(一紅S)實驗組對照組時間'cTn-I(ng/ml)TNF-a(pg/ml)cTn-I(ng/ml)TNF-a(pg/ml)T1 #3.7600 ± 0.58728#16.7450 ± 1.638754.1225 ±0.71043#18.0663 ± 1.35445、T25.0313+ 0.6149223.6738 + 0.66852*5.7025 + 0.8181529.0825+0.73622

14、T35.2113 + 0.48449*29.8088+ 1.29380*6.3550 + 0.4700847.1963+ 1.06057注：與對照組相比，*P<0.01;與T1相比，#P<0.05。心肌組織結(jié)構(gòu)的改變石蠟切片HE染色：對照組肌纖維月中脹，排序紊亂，橫紋消失，心肌細胞的核濃縮、變形，可見大量中性粒細胞浸潤;實驗組肌纖維輕度腫脹,排列尚有序,部分肌細胞萎縮，有較多中性粒細胞浸潤。免疫組化染色：實驗組Bax蛋白胞漿陽性表達率低于對照組，而Bcl-2蛋白胞漿及胞膜陽性表達(棕黃色顆粒)高于對照組。討論：細胞凋亡是機體的正常細胞在受到生理性或病理性刺激觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序

15、而導(dǎo)致的細胞主動性死亡方式。缺血再灌注損傷可誘發(fā)細胞凋亡的發(fā)生。心肌細胞I/R損傷可能與AngR具有促進神經(jīng)末梢釋放兒茶酚胺、促使血管收縮和正性肌力作用，加重鈉水潴留等有關(guān)。AngR介導(dǎo)細胞內(nèi)鈣超載，增強心肌的收縮力,加重缺血心肌的氧耗。而鈣超載是心肌缺血再灌注損傷的重要的機制之一。AngH可損傷血管內(nèi)皮細胞，血管平滑肌收縮，同時因激活血小板內(nèi)鳥甘酸環(huán)化酶(guanylylcyclase,GC)的作用減弱，造成血小板及中性粒細胞在內(nèi)皮細胞的黏附與聚集,并釋放炎性介質(zhì),加重心肌缺血再灌注損傷。纈沙坦通過與Angn結(jié)合阻斷AngR上述作用達到一定的心肌保護作用。肌鈣蛋白是與橫紋肌細胞相關(guān)的一組結(jié)構(gòu)

16、蛋白質(zhì),而cTn-I則僅在心肌組織中表達,具有心肌高度特異性,其表達水平可間接反映心肌缺氧缺血性損傷程2。缺血/再灌注損傷可誘導(dǎo)心肌組織的炎性反應(yīng)，Powell3研究發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注損傷過程中，TNF-a對心肌具有負性肌力作用，可誘導(dǎo)心肌細胞凋亡和壞死，增加心肌梗死面積。Akashiba4繳沙坦可有效減輕自發(fā)性高血壓大鼠體內(nèi)炎癥因子釋放，減少心肌細胞凋亡。王繼春等5實驗研究認為纈沙坦預(yù)處理可通過其抑制炎性因子的釋放從而發(fā)揮心肌保護作用，減輕缺血再灌注損傷。本研究亦表明,與對照組比較，實驗組再灌注60、120mincTn-I及TNF-a釋放均顯著降低，繳沙坦可有效抑制心肌缺血/再灌注過程中炎性

17、因子的合成與釋放，可明顯減少I/R過程中炎性反應(yīng)所致的心肌損傷，對缺血/再灌注幼犬心肌具有一定的心肌保護作用。Loukogeorgak等6研究發(fā)現(xiàn)再灌注早期是減輕缺血再灌注損傷，提供心肌保護的最重要時間段。Park等7研究發(fā)現(xiàn)Bc1-2作為抗凋亡的調(diào)節(jié)物,其主要功能是抑制細胞凋亡、促進細胞生存，而Bax通過增加線粒體等通透性，啟動凋亡信號，促進細胞凋亡。寧險峰等8觀察到纈沙坦后處理可減少兔急性缺血再灌注后心肌細胞凋亡，并影響B(tài)cl-2、Bax蛋白的表達，認為可能與激活蛋白激酶C有關(guān)。心肌細胞凋亡可導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu)，誘發(fā)心律失常,影響心功能9。本實驗研究表明于主動脈開放120min時心肌組織切

18、片(免疫組化)顯微鏡下觀察Bax、Bcl-2蛋白表達較主動脈開放60min時明顯，而主動脈阻斷前10min，各組未見到Bax、Bcl-2蛋白表達。在本實驗中，用一定量的纈沙坦在幼犬心肌I/R前進行預(yù)處理，所得結(jié)果顯示，對照組cTn-I和TNF-a在CPBffl問逐漸升高，恢復(fù)正常灌注后升高更明顯；實驗組cTn-I和TNF-a雖也有升高，但較對照組低，且恢復(fù)正常灌注后無明顯升高趨勢。推測纈沙坦預(yù)處理對心肌的保護機制在一定程度上可能與纈沙坦選擇性阻斷心肌組織中血管緊張素H與受體的結(jié)合，以抑制血管緊張素n介導(dǎo)的心肌炎性損傷有關(guān)；此外，可能與其結(jié)構(gòu)中的酚醛基團具有清除自由基直接抗炎作用有關(guān)。同時繳沙坦

19、預(yù)處理后可降低心肌組織中Bax蛋白表達，而促進Bcl-2蛋白表達,說明纈沙坦可阻斷的促凋亡作用而發(fā)揮心肌保護作用。Higuchi等10放射性同位素研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死局部心肌組織Ancjn受體表達大量增加。我們觀察到纈沙坦可以減少缺血/再灌注損傷中心肌細胞凋亡的數(shù)量,說明纈沙坦可以減少心肌細胞凋亡,對缺血心肌具有一定保護作用。但從本實驗尚不能完全確定纈沙坦抑制心肌細胞凋亡的具體作用環(huán)節(jié),我們考慮其可能的作用機制為：AngR參與缺血心肌損傷，繳沙坦通過選擇性阻斷心肌組織中血管緊張素R與受體的結(jié)合，以抑制血管緊張素R介導(dǎo)的心肌炎性損傷，減少其對心肌具有負性肌力作用有關(guān)；AngR使冠狀動脈收縮，增加

20、心臟負荷及心肌耗氧量，加重心肌缺血。繳沙坦作為AngR拮抗劑可通過擴張冠狀動脈，減輕心臟負荷而間接產(chǎn)生保護心肌細胞的作用。繳沙坦可調(diào)控缺血/再灌注心肌Bax和Bcl-2蛋白表達,阻斷細胞的促凋亡因素，從而減少缺血/再灌注所引起的心肌細胞凋亡。參考文獻1、MaggioniAP,FabbriGI.VALIANT(ValsartanInacutemyocardialinfarction)trial.ExpertOpinPharmacother,2005,6:507-512.2、陳華夏，劉邕波，熊榮生，等.淺低溫不停跳心內(nèi)直視手術(shù)對未成熟心肌保護作用的實驗研究J.山東醫(yī)藥，2009,49(47)：7-

21、9.3、 PowellSRProteasomeinhibitorsinmyocardialischemia，someconcernsJAnnThoracSurg，2008，85(4)：15031504.4、 AkashibaA,OnoH,OnoY,etal.ValsartanimprovesL-NAME-exacerbatedcardiacfibrosiswithTGF-?inhibitionandapoptosisinductioninspontaneouslyhypertensiveratsJ.JCardiol,2008,52(3):239-246.5、王繼春，江洪，楊簡，等.纈沙坦預(yù)處理對大鼠缺血/再灌注心肌損傷的保護作用J.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，29(3)：224-226229.6、 Loukogeorgak