男科實(shí)驗(yàn)室診療常規(guī)

1、前 言隨著男科學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展和國(guó)際交流的廣泛、深入，對(duì)男科實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)化的共識(shí)日益增強(qiáng)，從而促使男科實(shí)驗(yàn)室診斷指南的編寫(xiě)，目的在于進(jìn)一步規(guī)范目前男科實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，以達(dá)到更好的標(biāo)準(zhǔn)；提高精液分析及其他相關(guān)分析的質(zhì)量，使不同實(shí)驗(yàn)室的分析結(jié)果具有可比性，從而滿足研究人員和臨床醫(yī)生的需要，并可減少重復(fù)檢查給病人帶來(lái)的沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。男科實(shí)驗(yàn)室診斷的分類男科實(shí)驗(yàn)室診斷以精液、血液分析為主，必要時(shí)可以采集分泌物鏡檢或培養(yǎng)來(lái)診斷。男科實(shí)驗(yàn)室診斷包括男性不育癥、性功能障礙、前列腺疾病、性傳播疾病等的實(shí)驗(yàn)室診斷。男性不育癥實(shí)驗(yàn)室診斷項(xiàng)目一般可分為：精液常規(guī)分析，一般包括精液量、pH值、液化時(shí)間、精液粘稠度

2、、精子密度、精子活動(dòng)力等的分析，也可包括精子存活率和精子形態(tài)學(xué)分析，但需臨床醫(yī)生特別注明，因?yàn)榫哟婊盥屎途有螒B(tài)學(xué)分析均需要特殊的染色方法；精漿生化指標(biāo)的檢測(cè)，目前常用的指標(biāo)為精漿葡糖苷酶、酸性磷酸酶和果糖的檢測(cè)，它們可分別反映附睪、前列腺和精囊腺的分泌功能，有些實(shí)驗(yàn)室也開(kāi)展了精漿鋅和肉毒堿水平的檢測(cè)，認(rèn)為它們可分別反映前列腺和附睪的功能；精液白細(xì)胞和生精細(xì)胞的檢測(cè)；抗精子抗體的檢測(cè)；精液培養(yǎng)及精子功能的檢測(cè)，目前男科學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展較少，其檢測(cè)意義尚不明確。性功能障礙的實(shí)驗(yàn)室診斷主要為生殖激素的測(cè)定。前列腺疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括前列腺按摩液的檢測(cè)和前列腺特異性抗原的檢測(cè)。性傳播疾病的實(shí)驗(yàn)室診

3、斷主要包括淋病雙球菌、支原體、衣原體等的檢測(cè)。遺傳性疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要為染色體的核型分析和各種特異性基因的檢測(cè)。要保證男科實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確，以及不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果具有可比性，質(zhì)量保證亦是男科實(shí)驗(yàn)室診斷的重要環(huán)節(jié)。質(zhì)量保證主要包括各種樣本的正確采集和處理，以及相關(guān)的質(zhì)量控制措施。第一節(jié) 男性不育癥的實(shí)驗(yàn)室診斷一 精液樣本的采集要使精液分析為臨床提供可靠的結(jié)果，精液的采集必須按標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行。通常，精液采集需要注意以下幾點(diǎn)：1 受檢者采集精液前，實(shí)驗(yàn)室工作人員需要給受檢者提供清晰的書(shū)面或口頭指導(dǎo)，需要詢問(wèn)禁欲時(shí)間和受檢目的，同時(shí)提供留樣容器，并囑咐留樣時(shí)的注意事項(xiàng)。如果受檢者不在實(shí)驗(yàn)室提供的

4、房間留取精液，還應(yīng)告訴受檢者如何轉(zhuǎn)運(yùn)精液標(biāo)本。2 標(biāo)本采集時(shí)間通常為禁欲27天。如果需要進(jìn)行精漿葡糖苷酶的檢測(cè)，禁欲時(shí)間應(yīng)為47天，因?yàn)榻?3天留取的精液所測(cè)精漿葡糖苷酶水平明顯低于禁欲47天留取的精液標(biāo)本。如果僅僅是為了觀察受檢者精液中有無(wú)精子，禁欲時(shí)間沒(méi)有嚴(yán)格的限制。3 標(biāo)本的采集最好在實(shí)驗(yàn)室提供的房間內(nèi)單獨(dú)進(jìn)行。如果在實(shí)驗(yàn)室提供的房間內(nèi)留取標(biāo)本確實(shí)有困難，可以允許受檢者在家里或賓館里留取精液標(biāo)本，但必須向受檢者強(qiáng)調(diào)以下幾點(diǎn)：不可用避孕套留取，因?yàn)槠胀ǖ娜槟z避孕套可影響精子的存活；不可用夫婦射精中段法，因?yàn)檫@很容易丟失部分精液或受到陰道分泌物的污染，尤其是初始部分的精液所含精子密度最高；

5、在運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室的過(guò)程中，標(biāo)本應(yīng)避免過(guò)冷或過(guò)熱，尤其是冬天，標(biāo)本通常置于內(nèi)衣口袋里送檢；在采集標(biāo)本后1小時(shí)內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。4 應(yīng)用手淫法留取精液，射入一干凈的、廣口的玻璃或塑料容器中，留取后置于3537水浴箱中液化。如果需要進(jìn)行精液培養(yǎng)，受檢者應(yīng)先洗凈雙手和陰莖，然后將精液射于一無(wú)菌容器中。留取精液必須采集完整。5 采樣容器上必須標(biāo)明受檢者姓名、采集時(shí)間、禁欲時(shí)間、以及樣本采集是否完整。6 受檢者最初的精液檢查應(yīng)分析兩份標(biāo)本。兩次采集的間隔時(shí)間通常為721天，如果兩次的結(jié)果有明顯差異，應(yīng)再次留取精液標(biāo)本供分析，因?yàn)槟行跃悍治鼋Y(jié)果可有相當(dāng)大的波動(dòng)。7 實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員應(yīng)注意自身安全防護(hù)。精液標(biāo)本應(yīng)視

6、為生物危險(xiǎn)品，其可能含有有害的感染物質(zhì)，如HIV病毒、肝炎病毒、單純皰疹病毒等。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員必須穿上實(shí)驗(yàn)室外罩，常規(guī)洗手，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)決不允許飲食、吸煙、化妝、貯存食物等。二 精液常規(guī)分析精液常規(guī)分析包括精液量、液化時(shí)間、pH、粘稠度、精子濃度、活動(dòng)力、存活率以及形態(tài)學(xué)分析等。（一）精液量目前WHO推薦使用的精液量測(cè)定方法有兩種，一是用錐形底的刻度量筒法，二是稱重法。目前，我國(guó)大多數(shù)男科實(shí)驗(yàn)室仍使用目測(cè)法來(lái)檢測(cè)，這是不可取的。因稱重法與精液密度有關(guān)，故建議以刻度量筒法檢測(cè)精液量為好。精液量的正常參考范圍為26 ml。發(fā)現(xiàn)精液量少時(shí)，應(yīng)注意詢問(wèn)收集方式是否正確，或鑒別是否有逆行射精，此時(shí)可囑咐患

7、者留取尿液，顯微鏡觀察尿液中是否有大量精子，必要時(shí)尿液可離心后再鏡檢。（二）液化時(shí)間精液標(biāo)本留取后應(yīng)充分混勻（但不能劇烈搖動(dòng)），置于37水浴箱中待其液化。正常精液標(biāo)本在60分鐘內(nèi)液化，但通常情況下在15分鐘內(nèi)精液液化即完成。因此，精液標(biāo)本留取后，應(yīng)間隔510分鐘觀測(cè)一次，精液液化后即可進(jìn)行精液常規(guī)指標(biāo)的檢測(cè)。男科實(shí)驗(yàn)室常常會(huì)遇到不液化的精液標(biāo)本，如果不進(jìn)行處理，將會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)于不液化精液標(biāo)本，可以加入1%的10 mg/ml的糜蛋白酶，混勻后置37水浴箱中溫育30分鐘后，精液液化可明顯改進(jìn)，此操作不影響精漿生化指標(biāo)包括葡糖苷酶、酸性磷酸酶和果糖的檢測(cè)，但精子運(yùn)動(dòng)指標(biāo)中直線性可顯著

8、性降低（P=0.025），側(cè)擺幅度可顯著升高（P=0.029），而其他指標(biāo)如精子濃度、活動(dòng)率、a+b級(jí)活動(dòng)率、直線運(yùn)動(dòng)速度、曲線運(yùn)動(dòng)速度、鞭打頻率、平均路徑速度等不受影響。機(jī)械混勻或菠蘿蛋白酶對(duì)促進(jìn)精液液化可能也起作用。這樣的操作應(yīng)記錄在檢測(cè)報(bào)告上。（三）pH值一般用pH試紙進(jìn)行檢測(cè)。將一滴混勻的精液在pH試紙上均勻展開(kāi)，30秒鐘后，與標(biāo)準(zhǔn)帶進(jìn)行比較讀出其pH值。正常精液pH值為7.28.0。當(dāng)附屬性腺或者附睪有急性感染性疾病時(shí)，精液的pH值可以大于8.0。當(dāng)輸精管阻塞或先天性精囊腺缺如時(shí)，均可導(dǎo)致精液pH下降。測(cè)定精液pH應(yīng)在精液液化后立即測(cè)定，因?yàn)榫悍胖脮r(shí)間較長(zhǎng)會(huì)影響pH值測(cè)定結(jié)果。（四

9、）粘稠度一般用一滴管吸入精液，而后讓精液依靠重力滴落并觀察拉絲的長(zhǎng)度，如果長(zhǎng)度大于2厘米，視為異常。也可以用一玻棒插入精液中，提起玻棒，觀察拉絲長(zhǎng)度，同樣視長(zhǎng)度大于2厘米為異常。粘稠度增加，與精液不液化一樣，同樣會(huì)影響精液分析結(jié)果，處理方法同不液化精液標(biāo)本。（五）精子濃度精子濃度檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性主要取決于精子計(jì)數(shù)池。盡管WHO手冊(cè)推薦使用改良牛鮑氏血細(xì)胞計(jì)數(shù)板作為精子計(jì)數(shù)池，并且建議了質(zhì)量控制方法，但許多其他類型的計(jì)數(shù)池亦被引入男科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，包括一次性計(jì)數(shù)池如DROP、Standard Count、Cell Vision、MicroCell等，它們均為20 m深，精液無(wú)需稀釋即可直接分析，均為

10、通過(guò)毛細(xì)管作用加樣的計(jì)數(shù)池；反復(fù)使用的計(jì)數(shù)池，包括2X-CEL、Makler、JCD、Burker及血球計(jì)數(shù)池，前兩者池深20 m，精液無(wú)需稀釋即可分析，而后三者精液均需作1:20稀釋；以及既可一次性又可反復(fù)使用的Cell-VU計(jì)數(shù)池。這些計(jì)數(shù)池的精確性和準(zhǔn)確性已被廣泛地評(píng)價(jià)和比較。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，又稱牛鮑氏板，用于精液分析已有50余年的歷史。目前仍然是我國(guó)大多數(shù)單位用于精液分析的主要工具。國(guó)際上血細(xì)胞計(jì)數(shù)板被認(rèn)為是精子計(jì)數(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。對(duì)于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是否為精子計(jì)數(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，不同學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映不一。WHO組織編寫(xiě)的人類精液及精子-宮頸粘液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)第4版仍推薦使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)

11、板。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的不足之處在于精液需要稀釋，而稀釋后的精子喪失了運(yùn)動(dòng)能力，因此不能用來(lái)分析精子的活動(dòng)力和活動(dòng)率等運(yùn)動(dòng)功能指標(biāo)。而且，粘稠的精液樣本稀釋后，由于水合分子和水合離子的形成，以及水分子與蛋白質(zhì)分子的相互作用，稀釋后的總體積并不等于稀釋前兩者體積之和，而是總體積降低，因而精子濃度相對(duì)增高。另外，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板多次重復(fù)使用造成的磨損同樣會(huì)影響到以后分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果亦傾向于增高。因此，目前的研究認(rèn)為，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板明顯高估精子濃度。Macro計(jì)數(shù)板（圖1）在我國(guó)男科學(xué)實(shí)驗(yàn)室也有一定市場(chǎng)，它主要作為CASA系統(tǒng)的配套產(chǎn)品。Macro計(jì)數(shù)板的基本原理同Makler計(jì)數(shù)板，池深10 m，蓋板的

12、蓋玻片厚度有1 mm和0.4 mm兩種，前者適合于在20或25物鏡下觀察，后者可在普通顯微鏡40物鏡下觀察。蓋板上可有或無(wú)計(jì)數(shù)網(wǎng)格，也有不刻網(wǎng)格的蓋板。未刻有計(jì)數(shù)網(wǎng)格的蓋板多用于CASA系統(tǒng)，可同時(shí)分析精子活動(dòng)率，而有計(jì)數(shù)網(wǎng)格的蓋板，網(wǎng)格刻在蓋板中央，為100個(gè)0.1 mm0.1 mm的小方格。計(jì)數(shù)時(shí)，取液化后充分混勻的精液5 l滴加在載物平臺(tái)上，輕輕蓋上蓋板，隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)小方格內(nèi)的精子數(shù)乘以106/ml，即為精子濃度。若精子濃度20106/ml，應(yīng)計(jì)數(shù)更多的小方格，使計(jì)數(shù)的精子總數(shù)達(dá)200條以上。圖1 Macro計(jì)數(shù)板最近，CellVU計(jì)數(shù)板（圖2）備受關(guān)注，研究顯示，不論是標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠溶液

13、、精子懸液還是精液樣本，Cell-VU計(jì)數(shù)池的計(jì)數(shù)結(jié)果總是最低，最接近標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠溶液濃度的參考值，而血球計(jì)數(shù)池和Makler計(jì)數(shù)池的計(jì)數(shù)結(jié)果明顯高估。而且，Cell-VU可一次性或反復(fù)多次使用，這在計(jì)數(shù)傳染性較強(qiáng)的樣本時(shí)將顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Cell-VU計(jì)數(shù)池由載玻片和0.5 mm厚的蓋玻片構(gòu)成，每個(gè)載玻片有兩個(gè)計(jì)數(shù)池，可同時(shí)配有兩個(gè)蓋玻片。蓋玻片中央有激光蝕刻的網(wǎng)格，網(wǎng)格區(qū)為1 mm1 mm，均分為100個(gè)0.1 mm0.1 mm的小方格。計(jì)數(shù)池的深度為0.02 mm。計(jì)數(shù)時(shí)，取液化精液4 l上樣，蓋上蓋玻片，避免氣泡產(chǎn)生。按數(shù)上不數(shù)下、數(shù)左不數(shù)右的原則計(jì)數(shù)10個(gè)或50個(gè)小方格的精子數(shù)，以保

14、證每次計(jì)數(shù)不少于200條精子。結(jié)果10106 /ml即為測(cè)定的精子濃度。圖2 Cell-VU計(jì)數(shù)池為了保證所有男科實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以及不同實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果具有可比性，必須建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)數(shù)池操作系統(tǒng)用于所有實(shí)驗(yàn)室，從而為不同實(shí)驗(yàn)室的精液質(zhì)量控制評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)?；谀壳暗难芯浚珻ell-VU計(jì)數(shù)池應(yīng)是此標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)池的最佳選擇。所有顯微鏡檢查未見(jiàn)精子的精液標(biāo)本都應(yīng)離心確定沉渣中有無(wú)精子。建議使用3000 g離心15分鐘后，傾去精漿后將沉渣重懸，徹底檢查后未發(fā)現(xiàn)精子才能作出無(wú)精子癥的診斷。（六）精子活動(dòng)力精子活動(dòng)力即精子的運(yùn)動(dòng)能力。WHO推薦精子活動(dòng)力分為a、b、c、d四級(jí)：a級(jí)：快速前向運(yùn)動(dòng)，

15、即37時(shí)速度25 m/s，或20時(shí)速度20 m/s；25 m大約相當(dāng)于5個(gè)頭的長(zhǎng)度或半個(gè)尾的長(zhǎng)度；b級(jí)：慢速或呆滯的前向運(yùn)動(dòng)；c級(jí)：非前向運(yùn)動(dòng)（5 m/s）；d級(jí)：不動(dòng)。由于不同男科實(shí)驗(yàn)室及其技術(shù)人員有不同的a級(jí)和b級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，快速和慢速前向運(yùn)動(dòng)沒(méi)有一個(gè)固定的標(biāo)準(zhǔn)。因此，精子活動(dòng)力分為a、b、c三級(jí)可能更加合理：a級(jí)：前向運(yùn)動(dòng)；b級(jí)：非前向運(yùn)動(dòng)；c級(jí)：不動(dòng)。另外，國(guó)內(nèi)一些教科書(shū)上將精子活動(dòng)力分為4類：無(wú)活動(dòng)能力、活動(dòng)能力差、活動(dòng)能力良好、活動(dòng)能力很好。無(wú)活動(dòng)能力表示精子無(wú)任何活動(dòng)；活動(dòng)能力差表示精子前向運(yùn)動(dòng)能力差，有的只在原地旋轉(zhuǎn)移動(dòng)；活動(dòng)能力良好表示精子呈曲線向前運(yùn)動(dòng)；活動(dòng)能力很好表示精子很

16、活躍地向前呈直線運(yùn)動(dòng)。Jenks等將精子活動(dòng)力分為0級(jí)。0無(wú)活動(dòng)精子；精子尾部活動(dòng)，但不能前向運(yùn)動(dòng)；緩慢的波形前向運(yùn)動(dòng)；有快速運(yùn)動(dòng)，但波形運(yùn)動(dòng)的較多；活躍快速前向運(yùn)動(dòng)。這樣的分類標(biāo)準(zhǔn)比較主觀，應(yīng)該被廢棄。精子活動(dòng)力的分析有手工和CASA系統(tǒng)分析兩種方法。手工分析時(shí)，在顯微鏡焦點(diǎn)平面上由標(biāo)線形成的區(qū)域內(nèi)，或者在精子密度低時(shí)取整個(gè)視野，首先計(jì)數(shù)a和b級(jí)精子，隨后在同一視野計(jì)數(shù)不動(dòng)的c級(jí)精子。借助于實(shí)驗(yàn)室計(jì)數(shù)器的幫助，計(jì)數(shù)每類精子的數(shù)目（即活動(dòng)率）。用來(lái)自于同一份精液的兩份不同的10 l標(biāo)本重復(fù)計(jì)數(shù)200條精子，并比較兩次獨(dú)立計(jì)數(shù)各級(jí)精子所占的百分?jǐn)?shù)。較大的差異提示出現(xiàn)計(jì)數(shù)錯(cuò)誤或精子并非隨機(jī)分布在載

17、玻片上。這種情況下，應(yīng)再制備兩片新的載玻片重新評(píng)估精子活動(dòng)率。精子活動(dòng)率的手工分析方法十分不準(zhǔn)確。因?yàn)榛顒?dòng)精子可能在幾秒鐘內(nèi)已從一個(gè)視野進(jìn)入另一個(gè)視野。而且，精子活動(dòng)率受時(shí)間和溫度的影響，手工分析時(shí)這種影響更大。因此，精子活動(dòng)率的手工方法不能作為標(biāo)準(zhǔn)化的方法被推薦。CASA系統(tǒng)是一種比較客觀的分析精子活動(dòng)率的方法，具有較高的精確性。但CASA系統(tǒng)并非萬(wàn)能，其仍依賴于樣本制備、所用顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)、分析池及參數(shù)設(shè)置。研究顯示，精子活動(dòng)率和運(yùn)動(dòng)方式隨著視頻幀數(shù)不同而不同，數(shù)字化速率高于60幀/s可以足夠定性精子運(yùn)動(dòng)方式和活動(dòng)率，但商業(yè)可得的CASA的數(shù)字化速率一般都低于60幀/s。盡管CASA儀器有

18、其本身的技術(shù)需要和局限性，并且受樣本處理和制備技術(shù)等多種因素的影響，但建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的操作方法、儀器的定標(biāo)以保證不同制造商儀器之間結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性還是有可能的，而且也是時(shí)候了。（七）精子存活率精子存活率以活精子所占百分比表示，可用染色技術(shù)確定，一般采用伊紅染色法。這是由于死精子的細(xì)胞膜受損可透入一定染料，從而使死精子著色而活精子不著色。用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)200個(gè)精子，即可得出精子存活率。伊紅Y染色法：用生理鹽水將伊紅Y配制成5 g/L的溶液，將一滴新鮮精液與一滴伊紅Y溶液在載玻片上混勻，并覆以蓋玻片，30秒后用光學(xué)顯微鏡觀察，活精子不著色，死精子被染成紅色。精子存活率可用以核實(shí)精子活動(dòng)力的準(zhǔn)確

19、性，精子存活率一般高于精子活動(dòng)率，因?yàn)樗谰颖壤粦?yīng)超過(guò)不動(dòng)精子的比例。如果活的但不動(dòng)的精子占很大比例，應(yīng)懷疑精子鞭毛結(jié)構(gòu)有缺陷。（八）精子形態(tài)學(xué)分析正常形態(tài)精子百分率是評(píng)價(jià)精子受精能力的重要指標(biāo)之一。目前，用于精子形態(tài)學(xué)分析的染色方法有：改良巴氏染色法、蘇木精-伊紅（HE）染色法、瑞氏染色法、瑞-吉氏染色法、Diff-Quik染色法和Shorr染色法。1 涂片的制備一般用新鮮的液化精液或生理鹽水洗滌過(guò)的精子懸液進(jìn)行涂片，通常每份標(biāo)本涂雙份片子，以備染色或操作出問(wèn)題。載玻片應(yīng)潔凈，可用70%酒精洗滌并干燥后使用；涂片的厚薄應(yīng)根據(jù)精子密度而定，精子密度高者涂片應(yīng)薄些，而精子密度低者涂片應(yīng)盡可能厚

20、些。涂片的方法有多種，WHO推薦的方法有拉薄技術(shù)和滴管法，拉薄技術(shù)即用另一張載玻片的邊緣拖拉載玻片上的一滴精液；滴管法即水平持滴管使一滴精液沿載玻片的表面展開(kāi)。由于精液有一定粘稠度，這兩種方法都很難涂成均勻的涂片?？山ㄗh用以下方法涂片：用滴管將一滴精液置于載玻片上，然后從液滴中央向周圍循環(huán)吸凈多余的精液，注意滴管的頭要平整，滴管與載玻片垂直，緩慢吸去多余的液體。低密度、粘稠的、或充滿碎屑的標(biāo)本，建議先離心去除精漿，沉淀的精子團(tuán)重新懸浮在適當(dāng)體積中，以獲得盡可能高的密度，但不應(yīng)超過(guò)80106/ml。正常精子密度且液化良好的精液標(biāo)本亦可以洗滌后用精子懸液進(jìn)行涂片，但離心操作對(duì)精子形態(tài)分析有無(wú)影響，

21、尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。精子涂片可進(jìn)行空氣干燥并固定。固定程序取決于染色方法。2 改良巴氏染色法這是WHO手冊(cè)推薦的方法。它可以使精子和其他細(xì)胞很好地染色，可使精子頭部的頂體和頂體后區(qū)、胞漿小滴、中段和尾部著色。染液中的俾士麥棕為鹽基性染料，伊紅、亮綠、橙黃等為酸性染料，能與細(xì)胞中具有相反電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，而染成各種不同的顏色，從而能清楚地區(qū)分各種細(xì)胞成分。以往用巴氏染色法進(jìn)行染色時(shí)，操作步驟繁瑣，目前已有改良的單一的巴氏染色液出售，操作非常簡(jiǎn)單，只需在自然干燥的精子涂片上滴加12滴巴氏染液，染15分鐘即可。流水沖洗后自然晾干，顯微鏡油鏡下觀察精子形態(tài)。3 HE染色帶正電荷的堿性染料蘇木素能與細(xì)胞核

22、中帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合而使核染成紫藍(lán)色，伊紅為酸性染料，能與細(xì)胞質(zhì)中具有相反電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使胞質(zhì)呈紅色。HE染色為醫(yī)院病理科的常用染色方法，操作比較繁瑣，對(duì)于可以借助病理科染色的醫(yī)療單位可以選用此法對(duì)精子進(jìn)行染色。4 瑞氏和瑞-吉氏染色法瑞氏染料是由酸性染料伊紅和堿性染料美藍(lán)組成的復(fù)合染料，細(xì)胞染色后可用于觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)；吉氏染料是由天青、伊紅組成的染料，天青對(duì)細(xì)胞核著色較好，結(jié)構(gòu)顯示更清晰。因此，瑞-吉氏染色法比瑞氏染色法效果稍好些，兩種染液均可自行配制或購(gòu)買，操作都比較簡(jiǎn)單。瑞氏染液：取瑞氏染料0.1 g放入清潔干燥的研缽中，邊加少量甲醇邊磨至染料完全溶解，加甲醇到60 ml，倒入棕色瓶中

23、，室溫下放置1周以后即可用。Giemsa染液：取Giemsa染料0.5 g，置于33 ml甘油中，60水浴2小時(shí)，使其溶解，再加入60預(yù)熱的甲醇33 ml，混勻后置棕色瓶中，室溫下放置數(shù)周后方能使用（最好放置半年以上）。30.1 mol/L pH6.9磷酸鹽緩沖液：稱取NaH2PO42H2O 1.4 g、Na2HPO412H2O 3.94 g，加蒸餾水至100 ml。染色時(shí)，將單獨(dú)瑞氏染液或瑞氏吉氏（101）混合染液滴加于精子涂片上，靜置10秒后，滴加等量pH6.9磷酸鹽緩沖液，染色10分鐘后自來(lái)水沖洗，自然干燥，置于油鏡下觀察。5 Shorr染色法精子涂片空氣干燥后，用蘇木精染色12分鐘；流

24、水浸洗后置42溫水中藍(lán)化5分鐘（或浸入乙醇銨中藍(lán)化）；Shorr染劑（BDH Shorr粉4 g溶于220 ml 50%溫乙醇中，冷卻，加入2.0 ml冰醋酸，過(guò)濾即可）染35分鐘；流水沖洗，晾干后鏡檢。 6 Diff-Quik染色法精子涂片先置于固定液（1.8 mg二芳基甲烷加至1 L甲醇中而成）中固定5分鐘；將玻片直立于吸水紙上以去除多余的液體；將玻片在溶液1（1 g氧甲蒽加至1 L疊氮鈉防腐液中）中染色10秒鐘，然后在溶液2（0.625 g天藍(lán)A和0.625 g亞甲基藍(lán)加至1 L緩沖液中）中染色5秒鐘，各步驟之間均除去多余的液體；在流水中浸洗1015次以除去多余的染料；將玻片垂直豎立以去

25、除水分，使之完全干燥；顯微鏡下觀察。7 六種染色方法的評(píng)價(jià)目前使用的精子形態(tài)學(xué)分析的6種方法，對(duì)精子頭大小的影響不同，瑞-吉氏和瑞氏染色法的精子頭的長(zhǎng)軸和短軸最高，其次為Diff-Quik染色法，它們均顯著高于其他三種染色方法，可能與精子頭發(fā)生腫脹有關(guān)；巴氏染色法的精子頭的長(zhǎng)軸和短軸最低，而HE和Shorr染色法的精子頭長(zhǎng)軸和短軸介于巴氏染色法和Diff-Quik染色法之間。不同染色方法對(duì)精子頭大小產(chǎn)生顯著影響的原因尚不清楚，可能與不同化學(xué)物質(zhì)的特性和不同染色液的滲透壓等有關(guān)。6種精子染色方法的染色效果亦不同，Diff-Quik和Shorr染色法可以很清楚地區(qū)分頂體和核，其次為HE染色法，而巴

26、氏、瑞氏和瑞-吉氏染色的精子頂體和核分界不很明顯?；诓煌旧椒▽?duì)精子頭大小的影響、染色效果以及操作的簡(jiǎn)易與否，Diff-Quik和Shorr染色法值得推薦。目前，評(píng)估精子形態(tài)學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)有：一般標(biāo)準(zhǔn)，正常生育男性精液中正常形態(tài)精子比例應(yīng)大于30%；嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)，正常生育男性精液中正常形態(tài)精子比例應(yīng)大于10%。在評(píng)估精子正常形態(tài)時(shí)，應(yīng)采用嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)。只有頭、頸、中段和尾部都正常的精子才正常。精子頭的形狀必須是橢圓形的?？紤]到固定和染色所致的輕度收縮，精子頭部長(zhǎng)度為4.05.0 m，寬為2.53.5 m，長(zhǎng)寬之比應(yīng)在1.501.75之間。這些范圍是巴氏染色精子頭部測(cè)量值的95%可信區(qū)間范圍。頂體的界限應(yīng)

27、是清晰的，占頭部的40%70%。中段應(yīng)細(xì)，寬度90度）、尾部寬度不規(guī)則、尾部彎曲或上述缺陷的任何組合。胞漿小滴大于正常精子頭部的一半。此小滴通常位于中段。只有帶有尾部的可辨認(rèn)精子，才考慮進(jìn)行不同形態(tài)精子計(jì)數(shù)；未成熟精子細(xì)胞包括圓形精子細(xì)胞階段，不能作為精子進(jìn)行計(jì)數(shù)。精子頭脫落或無(wú)精子頭的不作為精子計(jì)數(shù)，無(wú)尾精子亦不作為頭部缺陷計(jì)數(shù)，但應(yīng)分開(kāi)記錄。卷尾的精子可能與精子活力低相關(guān)，或提示精子已暴露于低滲透壓。偶爾，許多精子可能有特異的結(jié)構(gòu)缺陷，例如，頂體發(fā)育失敗，導(dǎo)致“小圓頭缺陷”或“球形精子癥”。精子形態(tài)分析要求在100的油鏡亮視野下進(jìn)行計(jì)數(shù)，應(yīng)系統(tǒng)地選擇涂片上多個(gè)區(qū)域進(jìn)行形態(tài)學(xué)的評(píng)估。不應(yīng)評(píng)估

28、重疊的精子和頭部位于邊緣的精子，后者可通過(guò)上下調(diào)整焦距加以識(shí)別。用目鏡上的微標(biāo)尺測(cè)量精子的大小是必要的。應(yīng)至少連續(xù)計(jì)數(shù)200個(gè)精子（一次計(jì)數(shù)200個(gè)優(yōu)于兩次計(jì)數(shù)100個(gè)）。當(dāng)病人的診斷和治療主要依賴于正常形態(tài)精子的百分比時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)兩次200個(gè)精子，以增加精確性。（九）精子凝集精子凝集是指活動(dòng)精子以不同方式，如頭對(duì)頭、頭對(duì)尾、尾對(duì)尾或混合型，彼此粘在一起。不活動(dòng)精子之間、活動(dòng)精子與粘液絲之間、非精子細(xì)胞成分或細(xì)胞碎片等粘在一起，為非特異性聚集而非凝集，這種情況應(yīng)如實(shí)記錄。圖3 6種染色法的精子顯微照片A、B為Diff-Quik染色；C、D為HE染色；E、F為巴氏染色；G、H為瑞氏染色；I、J為瑞

29、-吉氏染色；K、L為Shorr染色凝集的存在可能提示，但不足以說(shuō)明不育是免疫因素引起的。凝集在測(cè)定精子活動(dòng)力時(shí)評(píng)估。精子凝集的類型應(yīng)當(dāng)記錄，如頭對(duì)頭、尾對(duì)尾或混合型。可采用一種半定量的分級(jí)方法：從沒(méi)有凝集到所有可動(dòng)的精子凝集到一起（）。三 計(jì)算機(jī)輔助的精液分析手工精液分析往往帶有很大的主觀性，不同的技術(shù)人員分析的結(jié)果有時(shí)相差甚遠(yuǎn)，對(duì)精子運(yùn)動(dòng)能力的判斷缺少嚴(yán)格的量化指標(biāo)。計(jì)算機(jī)輔助的精液分析（computer-aided semen analysis,CASA）是80年代發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，現(xiàn)已逐步應(yīng)用于男科實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分析。CASA具有客觀、高效、高精度的特點(diǎn)，尤其能分析與精子運(yùn)動(dòng)功能相關(guān)的多種參

30、數(shù)。CASA系統(tǒng)識(shí)別精子是根據(jù)人為設(shè)定的大小和灰度來(lái)判斷的，準(zhǔn)確性受精液中細(xì)胞成分和非細(xì)胞顆粒的影響。計(jì)算精子活動(dòng)率時(shí)，精子只有產(chǎn)生了一定的位移，CASA系統(tǒng)才認(rèn)為是活動(dòng)精子，而對(duì)原地?cái)[動(dòng)的精子則判為不活動(dòng)精子，測(cè)出的值低于實(shí)際結(jié)果。CASA系統(tǒng)參數(shù)的設(shè)置、閾值的設(shè)定、視屏取像率等都可以影響最終結(jié)果。CASA對(duì)精子密度有一定的限制，在（2050）106/ml范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)果較理想。精子密度過(guò)高時(shí)，標(biāo)本需要適當(dāng)稀釋，一般采用同份精漿標(biāo)本稀釋。精子密度過(guò)低時(shí)應(yīng)多選幾個(gè)視野采樣。隨著軟件系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，目前新的CASA系統(tǒng)可檢測(cè)較大精子密度范圍的精液標(biāo)本。用于CASA系統(tǒng)的精子計(jì)數(shù)板有Macro計(jì)數(shù)板

31、、Makler板、MicroCell計(jì)數(shù)池、Cell-VU等。由于CASA系統(tǒng)的設(shè)置缺乏統(tǒng)一的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，不同廠商和型號(hào)的CASA分析結(jié)果可比性差，尤其是分析精子密度和活動(dòng)率。因此，建立標(biāo)準(zhǔn)化的CASA操作系統(tǒng)很有必要。CASA系統(tǒng)用于分析精子運(yùn)動(dòng)能力有一套術(shù)語(yǔ)：軌跡速度（VCL）：也稱曲線速度，即精子頭部沿其實(shí)際行走曲線的運(yùn)動(dòng)速度。平均路徑速度（VAP）：精子頭沿其空間平均軌跡的運(yùn)動(dòng)速度，這種平均軌跡是計(jì)算機(jī)將精子運(yùn)動(dòng)的實(shí)際軌跡平均后計(jì)算出來(lái)的，可因不同型號(hào)的儀器而有所改變。直線運(yùn)動(dòng)速度（VSL）：也稱前向運(yùn)動(dòng)速度，即精子頭部直線移動(dòng)距離的速度。直線性（LIN）：也稱線性度，為精子運(yùn)動(dòng)曲線的直

32、線分離度，即VSL/VCL。精子側(cè)擺幅度（ALH）：即精子頭實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡對(duì)平均路徑的側(cè)擺幅度，可以是平均值，也可以是最大值。不同型號(hào)的CASA系統(tǒng)由于計(jì)算方法不一致，因此相互之間不可直接比較。前向性（STR）：也稱直線性，計(jì)算公式為VSL/VAP，即精子運(yùn)動(dòng)平均路徑的直線分離度。擺動(dòng)性（WOB）：即精子頭沿其實(shí)際運(yùn)動(dòng)軌跡的空間平均路徑擺動(dòng)的尺度，計(jì)算公式為VAP/VCL。鞭打頻率（BCF）：也稱擺動(dòng)頻率，即精子頭部跨越其平均路徑的頻率。平均移動(dòng)角度（MAD）：即精子頭部沿其運(yùn)動(dòng)軌跡瞬間轉(zhuǎn)折角度的時(shí)間平均值。運(yùn)動(dòng)精子密度：每毫升精液中VAP0 m/s的精子數(shù)。這些參數(shù)可綜合反映精子的運(yùn)動(dòng)狀況，在

33、評(píng)價(jià)精子獲能和頂體反應(yīng)中也有一定意義。CASA系統(tǒng)一般包括下列幾個(gè)部分（圖4）：相差顯微鏡、恒溫裝置和專用計(jì)數(shù)板（Makler板、Macro板或Microcell計(jì)數(shù)池等）組成的攝像系統(tǒng)。高速、高分辨率的攝像機(jī)和電視監(jiān)視器組成的攝像系統(tǒng)。計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)及打印機(jī)打印輸出。不同廠家不同型號(hào)的CASA系統(tǒng)應(yīng)根據(jù)其說(shuō)明書(shū)具體操作。圖4 CASA系統(tǒng)的組成四 精漿生化指標(biāo)的檢測(cè)人類精漿的組成幾乎都來(lái)自于附屬性腺，其中約30%來(lái)自前列腺，60%來(lái)自精囊腺，5%10%來(lái)自附睪及尿道球腺等。一些精漿生化標(biāo)志可反映附屬性腺功能，如酸性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、鋅、檸檬酸和鎂反映前列腺功能；果糖和前列腺素反映精囊

34、腺功能；游離左旋肉毒堿、甘油磷酸膽堿和-葡糖苷酶反映附睪功能等。這些特異性標(biāo)志總排出量的高低可用以評(píng)價(jià)男性附屬性腺的功能狀態(tài)，也可用于綜合評(píng)價(jià)不育的發(fā)病原因和機(jī)制。目前，我國(guó)男科實(shí)驗(yàn)室已開(kāi)展的精漿生化指標(biāo)主要為-葡糖苷酶、果糖、酸性磷酸酶和鋅，但精漿谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的檢測(cè)可望取代精漿酸性磷酸酶的檢測(cè)。這些檢測(cè)的試劑可自行配制，也可購(gòu)買相應(yīng)的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。（一）精漿-葡糖苷酶測(cè)定精漿中存在兩種-葡糖苷酶的異構(gòu)體，其中中性-葡糖苷酶占80%，僅來(lái)源于附睪；酸性-葡糖苷酶占20%，主要來(lái)源于前列腺。WHO手冊(cè)推薦了中性-葡糖苷酶的檢測(cè)方法，而國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室基本上都是檢測(cè)精漿總-葡糖苷酶活性。1 精漿總-葡

35、糖苷酶的測(cè)定檢測(cè)方法為葡萄糖氧化酶法。檢測(cè)原理是：麥芽糖含有兩個(gè)吡喃型葡萄糖殘基，由-1，4-糖苷鍵相連，經(jīng)精漿-葡糖苷酶的作用，水解糖苷鍵生成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶法可測(cè)定其生成量。1單位-葡糖苷酶定義為每毫升精漿與底物在37作用30 min產(chǎn)生0.1 mg葡萄糖。所用試劑包括：醋酸鹽緩沖液：0.1 mol/L pH5.2。麥芽糖基質(zhì)液（56 mmol/L）：稱取麥芽糖100 mg，溶于5 ml 0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液中，用時(shí)新鮮配置。Tris-HCl緩沖液：0.5 mol/L pH7.0。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：5.56 mmol/L。153.06 mmol/L氯化鈉溶液。葡萄糖氧化酶法測(cè)定

36、試劑盒：市場(chǎng)廣泛可得。操作步驟見(jiàn)表1。表1 精漿-葡糖苷酶測(cè)定操作步驟BpRbUbUS醋酸鹽緩沖液（l）20-20-153.06 mmol/L氯化鈉（l）1010-麥芽糖基質(zhì)液（l）-20-2020葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（l）-1037 5 min精漿（l）-1010-37 30 minTris-HCl緩沖液(ml)0.50.50.50.50.5葡萄糖氧化酶試劑（ml）2.52.52.52.52.5混勻，37 15 min后，用505 nm波長(zhǎng)，Bp管調(diào)零，讀取吸光度值。結(jié)果計(jì)算：精漿-葡糖苷酶活性（U/ml）=(U-Ub-Rb)/(S-Rb)0.0121/0.010.1。正常生育男性精漿-葡糖苷酶活性

37、參考值為35.187.7 U/ml。精漿總-葡糖苷酶檢測(cè)中應(yīng)注意三點(diǎn)：離心速度不同，精漿總-葡糖苷酶活性有所差異。離心速度越高，精漿總-葡糖苷酶水平越低。1 000 g離心10 min后精漿總-葡糖苷酶水平與3 000 g離心15 min后精漿總-葡糖苷酶水平有顯著性差異（P=0.001）。不同速度離心后精漿總-葡糖苷酶活性的差異可能與精漿中殘存的精子、細(xì)胞或非細(xì)胞成分有關(guān)，因?yàn)榫禹旙w中含有-葡糖苷酶，前列腺分泌的非細(xì)胞組分中亦含有-葡糖苷酶，而在低速離心時(shí)，這樣的細(xì)胞或非細(xì)胞組分難以下沉，致使精漿中-葡糖苷酶活性增高。這對(duì)處于臨界水平的精漿-葡糖苷酶來(lái)說(shuō)，不同離心速度所得的結(jié)果極有可能一個(gè)

38、值處于正常范圍，而另一個(gè)值處于異常范圍，這將導(dǎo)致臨床醫(yī)生采取不同的治療措施。因此，在精漿總-葡糖苷酶的檢測(cè)中，精液離心時(shí)的速度不得低于3 000 g離心15 min，只有如此，各實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果才具有可比性。精漿總-葡糖苷酶活性與禁欲時(shí)間的長(zhǎng)短密切相關(guān)。研究顯示，禁欲時(shí)間對(duì)-葡糖苷酶水平有明顯影響，-葡糖苷酶水平亦與禁欲時(shí)間成顯著正相關(guān)(P 0.001)。禁欲時(shí)間越長(zhǎng)，-葡糖苷酶水平越高。禁欲4 5天和禁欲6 7天的結(jié)果之間沒(méi)有顯著性差異，而禁欲2 3天的精漿-葡糖苷酶水平明顯降低，禁欲7天以上的精漿-葡糖苷酶水平明顯升高。因此，精漿-葡糖苷酶水平檢測(cè)的最佳禁欲時(shí)間最好為4 7天。精漿總-

39、葡糖苷酶活性的檢測(cè)應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制。通常情況下，每批檢測(cè)中應(yīng)包括高、低濃度的兩種質(zhì)控品。冷藏精漿標(biāo)本可望作為同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部或不同實(shí)驗(yàn)室之間的質(zhì)控品。2 精漿中性-葡糖苷酶的測(cè)定前列腺分泌的酸性-葡糖苷酶能夠被十二烷基硫酸鈉（SDS）選擇性抑制，檢測(cè)過(guò)程中加入SDS后，檢測(cè)出的-葡糖苷酶活性即為中性-葡糖苷酶活性。WHO推薦的方法檢測(cè)步驟比較繁瑣，而且，由于SDS溶液為混濁，很容易形成沉淀，在實(shí)際檢測(cè)中不易操作，且國(guó)內(nèi)很少開(kāi)展此項(xiàng)檢測(cè)，因此，精漿中性-葡糖苷酶的檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值尚待評(píng)估。（二）精漿果糖測(cè)定精漿果糖的測(cè)定幾乎被在世界上所有男科學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，而且，WHO也推薦以精漿果糖濃度的測(cè)定

40、作為評(píng)價(jià)精囊腺功能的指標(biāo)。精漿果糖可為精子的運(yùn)動(dòng)提供能量。精囊腺功能紊亂時(shí)，可使精液總量減少，精漿果糖含量降低，進(jìn)而引起精子活力不足，導(dǎo)致不育。目前，用于檢測(cè)精漿果糖的方法有間苯二酚顯色法、氣相層析法、吲哚顯色法等多種方法。尤以間苯二酚法為臨床男科實(shí)驗(yàn)室常用，該法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特殊儀器，特異性好。間苯二酚顯色法檢測(cè)精漿果糖的原理為：果糖與溶于強(qiáng)酸的間苯二酚溶液加熱后，產(chǎn)生紅色化合物，參比標(biāo)準(zhǔn)品，即可知其含量。所用試劑包括：果糖標(biāo)準(zhǔn)貯存液（500 mg/L）：50 mg果糖加蒸餾水至100 ml。果糖標(biāo)準(zhǔn)液（50 mg/L）：取果糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液1 ml，加蒸餾水至10 ml。0.175 mol/L

41、 ZnSO47H2O：稱取50.2 g加蒸餾水至1 L。0.15 mol/L Ba(OH)28H2O：稱取47.3 g加蒸餾水至1 L。1 g/L間苯二酚(雷鎖辛)：用95%乙醇配制。10 mol/L HCl：于87 ml蒸餾水中加入濃HCl 413 ml。具體操作步驟為：精漿預(yù)處理：取精漿0.1 ml，加蒸餾水2.9 ml，混勻；加Ba(OH)2（0.15 mol/L）0.5 ml，ZnSO4（0.175 mol/L）0.5 ml，混勻；靜置5 min，離心取上清液備用。按表2加入試劑。加完后，90水浴10 min，流水冷卻，490 nm波長(zhǎng)下、以空白管調(diào)零讀取吸光度值。結(jié)果計(jì)算：果糖（g/

42、L）=測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度2。正常生育男性精漿果糖參考值為0.873.95 g/L。表2 間苯二酚法測(cè)定精漿果糖操作步驟測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管待測(cè)上清液（ml）1果糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）1蒸餾水（ml）1間苯二酚（ml）111HCl（ml）333精漿果糖檢測(cè)中應(yīng)注意四點(diǎn)：果糖標(biāo)準(zhǔn)液配制后應(yīng)放置2周后使用，而使用2周后出現(xiàn)吸光度降低時(shí)應(yīng)立即更換新的果糖標(biāo)準(zhǔn)液。研究顯示，果糖標(biāo)準(zhǔn)液在配制的最初2周內(nèi)吸光度值變異相對(duì)較大，在隨后的2周內(nèi)吸光度值趨于穩(wěn)定，然后快速降低，在10天內(nèi)從0.30降至0.19（圖3）。果糖為多羥基酮糖，有不對(duì)稱碳原子，具有旋光性，在水溶液中有變旋現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)大約2周的時(shí)間，可能存在

43、的5種異構(gòu)體達(dá)到平衡，比旋光度也達(dá)到一個(gè)平衡值而相對(duì)穩(wěn)定，因而在隨后的2周時(shí)間內(nèi)吸光度值相對(duì)穩(wěn)定且變異小。由于水為弱親核試劑，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間酮糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿┨遣⑦_(dá)到一個(gè)平衡。由于間苯二酚與濃鹽酸遇酮糖呈紅色，遇醛糖呈很淺的顏色，一旦果糖在水溶液中逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槿┨?，吸光度值將逐漸降低，因而出現(xiàn)了最后10天吸光度值快速降低的情形。離心速度不同精漿果糖濃度稍有差異。離心速度增加時(shí)精漿果糖濃度有升高趨勢(shì)。可能原因?yàn)椋弘x心速度高時(shí)，精漿中殘余精子濃度明顯降低，由于精子不含果糖，因而低速離心時(shí)精漿中殘留的精子將占據(jù)一定體積，使實(shí)際精漿量有所降低，因而濃度有降低趨勢(shì)。因此，為了得到最真實(shí)的精漿果糖濃度值，離心速度不

44、得低于3 000 g離心15 min。精液液化后應(yīng)立即離心將精子和精漿分離，否則會(huì)影響精漿果糖檢測(cè)結(jié)果。這是由于體外活動(dòng)精子不斷消耗果糖。研究顯示，隨著精液放置時(shí)間的延長(zhǎng)，精漿果糖濃度逐漸降低。精液放置2 h后離心所得精漿果糖濃度比立即離心時(shí)精漿果糖濃度顯著降低，放置4 h比2 h又顯著降低，而且，此種降低與活動(dòng)精子濃度呈顯著正相關(guān)（r = 0.374，P = 0.009）。精漿果糖測(cè)定中應(yīng)引入質(zhì)量控制體系。對(duì)每批標(biāo)本的測(cè)試都應(yīng)該帶有高、低濃度的兩種質(zhì)控品。凍融精漿標(biāo)本可望作為果糖測(cè)定的質(zhì)控品。圖5 果糖標(biāo)準(zhǔn)液隨時(shí)間變化的OD值（三）精漿酸性磷酸酶測(cè)定精漿中含有較高的酸性磷酸酶活性，比血清高數(shù)

45、十萬(wàn)倍。國(guó)內(nèi)男科學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用檢測(cè)方法普遍為磷酸苯二鈉法，WHO推薦的方法使用的是相同原理，只是底物稍有不同，磷酸苯二鈉法的底物為磷酸苯二鈉，而WHO推薦的方法所用底物為p-硝基酚磷酸二鈉。故這里只介紹磷酸苯二鈉法。磷酸苯二鈉法有標(biāo)準(zhǔn)曲線法和試劑盒法，尤以前者應(yīng)用廣泛，但后者有一定優(yōu)勢(shì)。磷酸苯二鈉法的檢測(cè)原理為：精漿酸性磷酸酶在酸性條件下分解磷酸苯二鈉產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化成紅色醌的衍生物，根據(jù)紅色深淺測(cè)出酶活力的高低。所用試劑包括：0.2 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH4.9）：枸櫞酸鈉（C6H8O7H2O）42 g，溶于600 ml水中，用Na

46、OH矯正pH值至4.9，加蒸餾水至1 L。加氯仿數(shù)滴，冰箱保存。0.01 mol/L磷酸苯二鈉基質(zhì)液：取無(wú)水磷酸苯二鈉2.18 g（如含2分子結(jié)晶水應(yīng)加2.54 g），加蒸餾水至1 L。此溶液應(yīng)迅速煮沸，以消滅微生物，冷卻后加氯仿4 ml防腐，冰箱保存（一次不宜配過(guò)多）。堿性溶液：碳酸氫鈉4.2 g，4-氨基安替比林0.1 g，溶于100 ml蒸餾水中，加入0.5 mol/L NaOH 100 ml，混勻。鐵氰化鉀溶液：分別稱取鐵氰化鉀2.5 g，硼酸17 g，各溶于400 ml蒸餾水中，二液混合，加水至1 L，棕色瓶暗處保存。酚標(biāo)準(zhǔn)貯存液（1 mg/ml）：稱取酚（AR）1 g于0.1 mo

47、l/L HCl中，用 0.1 mol/L HCl稀釋到1 L。具體操作步驟為：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：按表3操作，加完試劑后，立即充分混勻，用510 nm波長(zhǎng)、0號(hào)管調(diào)零，讀取吸光度值，以15管所得讀數(shù)與其相應(yīng)的酸性磷酸酶單位（依次為100、200、300、400、500 U）回歸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將精漿用等滲鹽水稀釋1 000倍后按表4操作。加完試劑后混勻，于510 nm波長(zhǎng)、蒸餾水調(diào)零后讀取吸光度。結(jié)果計(jì)算：以測(cè)定管吸光度對(duì)照管吸光度之差值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線求酶活力。1單位酸性磷酸酶定義為每毫升精漿在37與基質(zhì)作用15分鐘，產(chǎn)生10 mg酚。正常生育男性精漿酸性磷酸酶活性為48.8208.6 U/ml。表3

48、 酸性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)曲線建立步驟管號(hào)012345酚標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.010.020.030.040.05蒸餾水（ml）0.510.500.490.480.470.46枸櫞酸緩沖液（ml）0.500.500.500.500.500.5037水浴5 min堿性溶液（ml）1.01.01.01.01.01.0鐵氰化鉀液（ml）1.51.51.51.51.51.5表4 酸性磷酸酶操作步驟測(cè)定管對(duì)照管稀釋精漿（ml）0.01-枸櫞酸緩沖液（ml）0.50.537水浴5 min預(yù)溫至37基質(zhì)液（ml）0.50.5混勻，37水浴15 min堿性溶液（ml）1.01.0鐵氰化鉀溶液（ml）1.51.5稀釋精漿（

49、ml）0.01試劑盒法檢測(cè)精漿酸性磷酸酶活性，是利用檢測(cè)血酸性磷酸酶試劑盒的方法加以改進(jìn)而成的。每批檢測(cè)時(shí)均帶有標(biāo)準(zhǔn)品。首先將精漿標(biāo)本作1:10 000稀釋，即5 l精漿加入495 l生理鹽水，充分混勻后再吸取5 l加入495 l生理鹽水，再次充分混勻后，取50 l稀釋精漿按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。ACP活性（U/ml）=測(cè)定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度10，其定義為：1 ml精漿與基質(zhì)在37條件下作用30 min產(chǎn)生100 mg酚為1個(gè)活力單位。試劑盒方法的每次檢測(cè)中均帶有標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品可以和常規(guī)標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)，并且可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度直接求出樣本的ACP活性值，從而避免了標(biāo)準(zhǔn)曲線法中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得AC

50、P活性所帶來(lái)的不足。由于標(biāo)準(zhǔn)曲線不可能在每次檢測(cè)時(shí)都制備，而往往是發(fā)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果差異較大或者是更換試劑時(shí)才重新制備，這常常需經(jīng)歷相當(dāng)一段時(shí)間。然而，在這一段時(shí)期內(nèi)的每次檢測(cè)過(guò)程中，由于樣本制備、吸樣、孵育、比色等條件的不同，每次檢測(cè)的吸光度并不能真正代表所測(cè)得的精漿ACP活性。而且，試劑盒方法的批間CV（分別為13.8%和15.49%）明顯低于常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測(cè)的批間CV（分別為24.43%和21.04%）。精漿酸性磷酸酶檢測(cè)中應(yīng)注意三點(diǎn)：精漿稀釋后需立即檢測(cè)。因?yàn)?，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)曲線法還是試劑盒方法，精漿稀釋后放置30 min后的ACP活性均明顯低于精漿稀釋后立即檢測(cè)的ACP活性。而且，由于標(biāo)本稀

51、釋倍數(shù)較大，應(yīng)確保充分混勻。離心速度對(duì)精漿酸性磷酸酶檢測(cè)結(jié)果可能有影響。雖然3 000 g離心15 min后精漿ACP活性與1 000 g離心10 min后精漿ACP活性沒(méi)有顯著性差異，但卻有增高的趨勢(shì)。因此，要想得到“單純”的精漿，離心速度不得低于3 000 g離心15 min，只有如此，各實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果才具有可比性。精漿酸性磷酸酶測(cè)定中應(yīng)引入質(zhì)量控制體系。對(duì)每批標(biāo)本的測(cè)試都應(yīng)該帶有高、低濃度的兩種質(zhì)控品。凍融精漿標(biāo)本可望作為酸性磷酸酶測(cè)定的質(zhì)控品。（四）精漿-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（-GT）測(cè)定精漿-GT含量是血清的200500倍，因其稀釋倍數(shù)遠(yuǎn)低于酸性磷酸酶，故檢測(cè)誤差比酸性磷酸酶檢測(cè)為低。

52、與酸性磷酸酶檢測(cè)一樣，-GT檢測(cè)也可分為標(biāo)準(zhǔn)曲線法和試劑盒法，兩者檢測(cè)原理一樣，均為：精漿-GT可分解-谷氨酰-萘酚為游離的-萘酚，-萘酚與重氮試劑作用產(chǎn)生紅色，其色澤深淺與酶活性成正比。標(biāo)準(zhǔn)曲線法使用的試劑包括：硼酸鹽緩沖液（pH9.0）：硼酸鈉3.092 g、氯化鉀3.728 g，溶于500 ml蒸餾水中，加1 mol/L NaOH 21.4 ml，加水至1 L?；|(zhì)緩沖液（10 mol/L）：取-谷氨酰-萘酚27.1 mg，加pH9.0硼酸緩沖液10 ml，加熱助溶，注意加熱時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)。溶解后即置冷水中冷卻，防止基質(zhì)分解，冰箱保存，可用2周。重氮試劑：臨用時(shí)取甲液96 ml加乙液4 m

53、l混合。甲液：氨基苯磺酸 2 g，溶于400 ml水中加熱，冷卻后加冰乙酸200 ml，再加水稀釋至1 L。乙液：亞硝酸鈉0.1 g溶于100 ml水中，約可用一周。-萘胺標(biāo)準(zhǔn)液（2 mol/L）：取-萘胺143 mg，溶于無(wú)水乙醇10 ml中，加水至500 ml，臨用前配置。具體操作步驟：-GT標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取-萘胺標(biāo)準(zhǔn)液（2 mol/L）以蒸餾水稀釋成每毫升含0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol的標(biāo)準(zhǔn)液，按表5分別加入管中，每管0.25 ml。試劑加完后，混勻，10 min后，用520 nm波長(zhǎng)以0管調(diào)零讀取吸光度值，與其相應(yīng)的-GT單位（依次為25，50，100，1

54、50，200，250 U）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精漿用生理鹽水稀釋10倍后按表6操作。試劑加完后，混勻，10 min后，于520 nm波長(zhǎng)用蒸餾水調(diào)零讀取吸光度值。結(jié)果計(jì)算：以測(cè)定管吸光度值空白管吸光度值的差值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得-GT活力。1 U -GT定義為每毫升精漿在37與基質(zhì)作用30 min，釋出-萘胺0.5 mol。正常生育男性精漿-GT活性為69.3206.5 U/ml。表5 -GT標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備0123456標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.250.250.250.250.250.25蒸餾水（ml）0.260.010.010.010.010.010.01重氮試劑（ml）5.05.05.05.05.05.

55、05.0表6 精漿-GT檢測(cè)程序測(cè)定管空白管稀釋精漿（ml）0.01基質(zhì)液（預(yù)溫37）（ml）0.250.2537水浴30 min重氮試劑（ml）5.05.0稀釋精漿（ml）0.01試劑盒法檢測(cè)精漿-GT活性是利用檢測(cè)血-GT活性試劑盒的方法加以改進(jìn)而成的。每批檢測(cè)都帶有標(biāo)準(zhǔn)品。即取 5 l精漿，加入到995 l生理鹽水中，充分混勻后吸取50 l加至0.5 ml底物基質(zhì)液中，37水浴15 min，加顯色劑5 ml，混勻后靜置5 min，在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。精漿中-GT活力（U/ml）=（測(cè)定管A值空白管A值）/（標(biāo)準(zhǔn)管A值空白管A值）30，其定義為：1 ml精漿與基質(zhì)在37作用15 min釋放出1 mol -萘胺為1個(gè)單位。