沈陽藥科大學(xué)生物化學(xué)15

1、沈陽藥科大學(xué)生物化學(xué)沈陽藥科大學(xué)生物化學(xué)15第一節(jié)第一節(jié) 生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)生物藥物制造的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、生物藥物制備方法的特點(diǎn)一、生物藥物制備方法的特點(diǎn)1、目的物存在于組成非常復(fù)雜的生物材料中、目的物存在于組成非常復(fù)雜的生物材料中2、有些目的物在生物材料中含量極微，因此分離純、有些目的物在生物材料中含量極微，因此分離純化步驟多，難于獲得高收率化步驟多，難于獲得高收率3、生物活性成分離開生物體后，易變性破壞，所以、生物活性成分離開生物體后，易變性破壞，所以分離過程注意保護(hù)有效物質(zhì)的生物活性分離過程注意保護(hù)有效物質(zhì)的生物活性4、生物藥物制造工藝幾乎都在溶液中進(jìn)行，各種理、生物藥物制造工藝

2、幾乎都在溶液中進(jìn)行，各種理化因素和生物學(xué)因素對(duì)組分有綜合性影響。化因素和生物學(xué)因素對(duì)組分有綜合性影響。5、為了保護(hù)目的物的活性和結(jié)構(gòu)完整性，生物藥物、為了保護(hù)目的物的活性和結(jié)構(gòu)完整性，生物藥物工藝多采用工藝多采用“逐級(jí)分離逐級(jí)分離”的方法的方法6、生物藥物的均一性檢測(cè)與化學(xué)上的純度概念完全、生物藥物的均一性檢測(cè)與化學(xué)上的純度概念完全不同不同生物藥物分離制備方法的主要依據(jù)原理生物藥物分離制備方法的主要依據(jù)原理1、根據(jù)不同組分分配率的差別進(jìn)行分離根據(jù)不同組分分配率的差別進(jìn)行分離2、根據(jù)生物大分子的特性采用多種分離手段交、根據(jù)生物大分子的特性采用多種分離手段交互進(jìn)行。互進(jìn)行。二、生物合成技術(shù)原理二、

3、生物合成技術(shù)原理 生物合成是利用生物細(xì)胞的代謝反應(yīng)生物合成是利用生物細(xì)胞的代謝反應(yīng)( (更多的更多的是利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是利用微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)) )來合成化學(xué)方法難于來合成化學(xué)方法難于合成的藥物或藥物中間體。合成的藥物或藥物中間體。 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是利用微生物的代謝才作用來微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是利用微生物的代謝才作用來進(jìn)行某些化學(xué)反應(yīng)，確切地說就是利用微生物進(jìn)行某些化學(xué)反應(yīng)，確切地說就是利用微生物代謝過程中某種酶對(duì)底物進(jìn)行催化反應(yīng)，以生代謝過程中某種酶對(duì)底物進(jìn)行催化反應(yīng)，以生成所需要的活性物質(zhì)。成所需要的活性物質(zhì)。 生物合成技術(shù)的另一領(lǐng)域是半合成技術(shù)。生物合成技術(shù)的另一領(lǐng)域是半合成技術(shù)。 氨芐青霉素合

4、成氨芐青霉素合成RCONHCONSCOOHCH3CH3H2NCONSCOOHCH3CH3+ RCOOH青霉素青霉素?；?-氨基青霉酸(6-APA)氨芐青霉素CHNH2CONHCONSCOOHCH3CH3苯甘氨酸CHCOOHNH2三、生物技術(shù)原理三、生物技術(shù)原理 生物技術(shù)生物技術(shù)(botechnology)(botechnology)又稱生物工程又稱生物工程(bioengineering)(bioengineering)，是利用生物有機(jī)體，是利用生物有機(jī)體( (動(dòng)物、動(dòng)物、植物和微生物植物和微生物) )或其組成部分或其組成部分( (包括器官、組織、包括器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器等細(xì)胞或細(xì)胞器等)

5、 )發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種發(fā)展新產(chǎn)品或新工藝的一種技術(shù)體系。技術(shù)體系。 生物技術(shù)一般包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工生物技術(shù)一般包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程。程和發(fā)酵工程。三、生物技術(shù)原理三、生物技術(shù)原理 基因工程主要包括基因的分離、制備、體外剪切、基因工程主要包括基因的分離、制備、體外剪切、重組、擴(kuò)增、表達(dá)與產(chǎn)物的純化等技術(shù)；重組、擴(kuò)增、表達(dá)與產(chǎn)物的純化等技術(shù)； 細(xì)胞工程則包括一切生物類型的基本單位一細(xì)胞細(xì)胞工程則包括一切生物類型的基本單位一細(xì)胞(有有時(shí)也包括器官或組織時(shí)也包括器官或組織)的離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融的離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融合以及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)乃至染色體與細(xì)胞器合以

6、及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)乃至染色體與細(xì)胞器(如線粒如線粒體、葉綠體等體、葉綠體等)的移植與改建等操作技術(shù)；的移植與改建等操作技術(shù)； 酶工程是指酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其固定化技術(shù)以及由酶工程是指酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其固定化技術(shù)以及由酶制劑構(gòu)成的生物反應(yīng)器和生物傳感器等新技術(shù)、酶制劑構(gòu)成的生物反應(yīng)器和生物傳感器等新技術(shù)、新裝置的研究應(yīng)用；新裝置的研究應(yīng)用； 發(fā)酵工程也叫微生物工程，是在最適條件下，對(duì)單發(fā)酵工程也叫微生物工程，是在最適條件下，對(duì)單一菌種進(jìn)行培養(yǎng)，是生物特定產(chǎn)品的一種生物工藝一菌種進(jìn)行培養(yǎng)，是生物特定產(chǎn)品的一種生物工藝三、生物技術(shù)原理三、生物技術(shù)原理 現(xiàn)代生物技術(shù)的核心內(nèi)容主要包括重組現(xiàn)代生物技術(shù)的核心

7、內(nèi)容主要包括重組DNA技術(shù)技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)。和單克隆抗體技術(shù)。 生物工程藥物是指運(yùn)用重組生物工程藥物是指運(yùn)用重組DNA技術(shù)和單克隆抗技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)生產(chǎn)的多肽、蛋白、激素和酶類藥物以及體技術(shù)生產(chǎn)的多肽、蛋白、激素和酶類藥物以及疫苗、單抗和細(xì)胞生長因子類藥物等疫苗、單抗和細(xì)胞生長因子類藥物等 重組重組DNA技術(shù)又稱基因工程，其操作過程主要包技術(shù)又稱基因工程，其操作過程主要包括：目的基因的獲?。换蜉d體的選擇與構(gòu)括：目的基因的獲??；基因載體的選擇與構(gòu)建；目的基因與載體的拼接；重組建；目的基因與載體的拼接；重組DNA導(dǎo)人導(dǎo)人受體細(xì)胞；篩選并無性繁殖含重組分子的受體受體細(xì)胞；篩選并無性繁殖含重

8、組分子的受體細(xì)胞細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子)；工程菌；工程菌(或細(xì)胞或細(xì)胞)的大量培養(yǎng)與目的大量培養(yǎng)與目的蛋白的生產(chǎn)。的蛋白的生產(chǎn)。 圖圖15-2 由染色體由染色體DNA和和cDNA構(gòu)建重組構(gòu)建重組DNA生產(chǎn)目的蛋白示意圖生產(chǎn)目的蛋白示意圖質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體A、基因、基因DNA(從染色體從染色體DNA中分離中分離)B、cDNA(從從mRNA合成合成)編碼目的蛋白的基因編碼目的蛋白的基因mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶從逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA合成合成cDNADNA聚合酶聚合酶IdsDNA(雙鏈雙鏈DNA)目的基因目的基因DNA連接酶連接酶限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞胞篩選培養(yǎng)克隆篩選培養(yǎng)克隆將篩選的

9、克隆發(fā)酵，將篩選的克隆發(fā)酵，生產(chǎn)目的蛋白生產(chǎn)目的蛋白重組體質(zhì)粒重組體質(zhì)粒宿主宿主DNA圖圖15-2 A、染色體、染色體DNA、 B、cDNA構(gòu)建重組構(gòu)建重組DNA生產(chǎn)目的蛋白示意圖生產(chǎn)目的蛋白示意圖（一）基因載體（一）基因載體常用的基因載體常用的基因載體(Vector)有質(zhì)粒、有質(zhì)粒、噬菌體、噬菌體、M13噬菌體等。噬菌體等。逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA、昆蟲病毒、昆蟲病毒DNA是將外源基是將外源基因?qū)藙?dòng)物細(xì)胞的載體。因?qū)藙?dòng)物細(xì)胞的載體。圖圖15-3 pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒pBR322oriAmprTerrPst I 3609EcoR I 4361/0HindIII 29BamHI 375Sa

10、lI 651AvaI 1425PvuII 2066（二）目的基因的來源（二）目的基因的來源1、 直接從染色體直接從染色體DNA分離。分離。2、人工合成、人工合成 3、從、從mRNA合成合成cDNA4、基因文庫、基因文庫將生物體全部將生物體全部DNADNA提純，用限制性內(nèi)切酶隨機(jī)提純，用限制性內(nèi)切酶隨機(jī)切割成數(shù)以萬計(jì)的片段，所有片段均重組在同切割成數(shù)以萬計(jì)的片段，所有片段均重組在同一類載體上，得到許多重組體，又全部轉(zhuǎn)化人一類載體上，得到許多重組體，又全部轉(zhuǎn)化人宿主菌中保存起來，這就是基因文庫。宿主菌中保存起來，這就是基因文庫。用基因組用基因組(genome)的總的總DNA構(gòu)建的為構(gòu)建的為G文庫文

11、庫用細(xì)胞全部用細(xì)胞全部mRNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄制備的經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA后后建庫，則稱為建庫，則稱為cDNA文庫，文庫，（三）限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用（三）限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 核酸限制性內(nèi)切酶核酸限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)(restriction endonuclease)能特異識(shí)別核酸分子某些堿基序列并加以切開能特異識(shí)別核酸分子某些堿基序列并加以切開 其切口類型有兩種：其切口類型有兩種：一種為平端一種為平端(blunt end)(blunt end)切口、切口、另一種為粘端切口另一種為粘端切口(sticky end)(sticky end)，即兩鏈的，即兩鏈的切

12、口錯(cuò)開切口錯(cuò)開2 24 4個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。表表15-1 常用的限制性內(nèi)切酶常用的限制性內(nèi)切酶酶酶辨認(rèn)的序列和切口辨認(rèn)的序列和切口說明說明Alu I四核苷酸，平端切口四核苷酸，平端切口AGCTTCGABamH I 六核六核苷酸，平端切口苷酸，平端切口GGATCCCCTAGG Bgl I 六核六核苷酸，平端切口苷酸，平端切口AGATCTTGTAGA 表表15-1 常用的限制性內(nèi)切酶常用的限制性內(nèi)切酶酶酶辨認(rèn)的序列和切口辨認(rèn)的序列和切口說明說明EcoR I 六核六核苷酸，平端切口苷酸，平端切口GAATTCCTTAAG Hind III 六核六核苷酸，平端切口苷酸，平端切口AAGCTTTTCGAA

13、 Sal I 六核六核苷酸，平端切口苷酸，平端切口GTCGACCAGCTG Sma I 六核六核苷酸，平端切口苷酸，平端切口CCCGGGGGGCCC （四）重組體的構(gòu)建（四）重組體的構(gòu)建 用同種限制性內(nèi)切酶切割載體及目的基因后，無用同種限制性內(nèi)切酶切割載體及目的基因后，無論產(chǎn)生的是平端切口或粘端切口，都可以用論產(chǎn)生的是平端切口或粘端切口，都可以用DNADNA連連接酶把載體和目的基因連接起來，形成接酶把載體和目的基因連接起來，形成DNADNA重組體重組體粘端連接方式粘端連接方式：如用如用HpaHpa分別切割目的基因和質(zhì)粒分別切割目的基因和質(zhì)粒DNADNA，然后混合在一起，用連接酶作共價(jià)連接形成，

14、然后混合在一起，用連接酶作共價(jià)連接形成DNADNA重組體，這種方法稱為粘端連接方式。重組體，這種方法稱為粘端連接方式。還有還有“尾接法尾接法”連接方式。在載體和目的基因上找不連接方式。在載體和目的基因上找不到共同的酶切位點(diǎn)時(shí)，可先把它們各自的粘端切口用到共同的酶切位點(diǎn)時(shí)，可先把它們各自的粘端切口用單鏈核酸酶切平、在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下，催化單鏈核酸酶切平、在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下，催化脫氧單核苷酸加于脫氧單核苷酸加于DNA的的3末端，使形成粘端結(jié)構(gòu)。末端，使形成粘端結(jié)構(gòu)。如一股如一股DNA加上加上polyC，另一股，另一股DNA的的3曰末端加曰末端加polpolyC，因，因C-C互補(bǔ)配對(duì)，兩

15、種互補(bǔ)配對(duì)，兩種DNA經(jīng)連接酶處理，也經(jīng)連接酶處理，也可以形成共價(jià)結(jié)構(gòu)的重組體?？梢孕纬晒矁r(jià)結(jié)構(gòu)的重組體。圖圖15-4 粘端連接方式粘端連接方式CCGGGGCCGGCCCCGGCGGCGGCC哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物DNA片斷片斷限制性內(nèi)限制性內(nèi)切酶切酶HpaIICCGGGGCCCGGCGGCC限制性內(nèi)限制性內(nèi)切酶切酶HpaII+混合，退火混合，退火DNA連接酶連接酶CCGGGGCCCCGGGGCC細(xì)菌質(zhì)粒與哺乳動(dòng)物細(xì)菌質(zhì)粒與哺乳動(dòng)物DNA片段共同構(gòu)成的重組質(zhì)粒片段共同構(gòu)成的重組質(zhì)粒（五）重組體的轉(zhuǎn)化（五）重組體的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化(transformatiformation) ：重組體如系大腸桿菌質(zhì)粒，

16、可在重組體如系大腸桿菌質(zhì)粒，可在0-40-4用用CaCl2CaCl2處理大腸處理大腸桿菌，以增大其細(xì)胞膜的通透性，再將桿菌，以增大其細(xì)胞膜的通透性，再將CaCl2CaCl2處理過的處理過的受體細(xì)菌與重組質(zhì)粒溫育，使質(zhì)粒透人菌體，將重組受體細(xì)菌與重組質(zhì)粒溫育，使質(zhì)粒透人菌體，將重組DNADNA導(dǎo)人宿主細(xì)胞以改變其某些特性，此過程稱為轉(zhuǎn)化導(dǎo)人宿主細(xì)胞以改變其某些特性，此過程稱為轉(zhuǎn)化作用作用 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):(transduction):重組體如系噬菌體重組體如系噬菌體DNADNA，可進(jìn)行體外包裝，將其包人入，可進(jìn)行體外包裝，將其包人入噬菌體的頭部外殼蛋白，并使其含有尾部蛋白，

17、成為有噬菌體的頭部外殼蛋白，并使其含有尾部蛋白，成為有侵染力的噬菌體，以導(dǎo)人宿主細(xì)胞。亦可用侵染力的噬菌體，以導(dǎo)人宿主細(xì)胞。亦可用CaCl2CaCl2處理處理宿主細(xì)胞，將重組宿主細(xì)胞，將重組DNADNA直接引入細(xì)胞，以供體直接引入細(xì)胞，以供體DNADNA通過噬通過噬菌體導(dǎo)人細(xì)胞引起的轉(zhuǎn)化作用稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)菌體導(dǎo)人細(xì)胞引起的轉(zhuǎn)化作用稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transducion)(transducion)。 （六）重組體的篩選與鑒定（六）重組體的篩選與鑒定 在重組體導(dǎo)人宿主細(xì)胞后，經(jīng)初步擴(kuò)增后還應(yīng)在重組體導(dǎo)人宿主細(xì)胞后，經(jīng)初步擴(kuò)增后還應(yīng)加以篩選，以獲得含目的基因的工程菌加以篩選，以獲得含目的基因的工程菌( (或細(xì)或

18、細(xì)胞胞) )，并鑒定之。，并鑒定之。1 1、根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選2 2、限制酶切圖譜分析鑒定、限制酶切圖譜分析鑒定3 3利用核酸雜交技術(shù)進(jìn)行鑒定利用核酸雜交技術(shù)進(jìn)行鑒定 DNADNA重組技術(shù)的主要應(yīng)用重組技術(shù)的主要應(yīng)用運(yùn)用運(yùn)用DNADNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)基因工程藥物；重組技術(shù)大量生產(chǎn)基因工程藥物；定向改造生物的基因結(jié)構(gòu)，構(gòu)建高產(chǎn)菌株，用于改定向改造生物的基因結(jié)構(gòu)，構(gòu)建高產(chǎn)菌株，用于改造傳統(tǒng)制藥工業(yè)；造傳統(tǒng)制藥工業(yè)；用于基礎(chǔ)研究，如用于基因結(jié)構(gòu)與基因組功能的調(diào)用于基礎(chǔ)研究，如用于基因結(jié)構(gòu)與基因組功能的調(diào)節(jié)研究，通過擴(kuò)增目的基因、制造基因探針，用于節(jié)研究，通過擴(kuò)增目的基

19、因、制造基因探針，用于分子雜交操作分子雜交操作。細(xì)胞工程細(xì)胞工程 細(xì)胞工程技術(shù)系運(yùn)用細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)的方法按細(xì)胞工程技術(shù)系運(yùn)用細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)的方法按照人們的預(yù)先設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地改造細(xì)胞的遺傳照人們的預(yù)先設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地改造細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，以期獲得人類所需要的具有某些特性和基礎(chǔ)，以期獲得人類所需要的具有某些特性和功能的新細(xì)胞。功能的新細(xì)胞。 根據(jù)所要改造的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一般可分根據(jù)所要改造的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次一般可分為基因工程、染色體工程、染色體組工程、細(xì)為基因工程、染色體工程、染色體組工程、細(xì)胞質(zhì)工程及細(xì)胞融合胞質(zhì)工程及細(xì)胞融合( (體細(xì)胞雜交體細(xì)胞雜交) )等。等。 主要工作內(nèi)容有細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)

20、胞融合，細(xì)胞拼主要工作內(nèi)容有細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合，細(xì)胞拼合，染色體導(dǎo)人和基因轉(zhuǎn)移等。合，染色體導(dǎo)人和基因轉(zhuǎn)移等?；虻闹苯右浦才c轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因的直接移植與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移一般采用體外培養(yǎng)細(xì)胞顯基因在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移一般采用體外培養(yǎng)細(xì)胞顯微注射技術(shù)用顯微吸管吸取基因或帶基因的質(zhì)微注射技術(shù)用顯微吸管吸取基因或帶基因的質(zhì)粒，在顯微鏡下借助特殊的注射裝置，把目的粒，在顯微鏡下借助特殊的注射裝置，把目的基因注入受體細(xì)胞核內(nèi)，通常是將目的基因注基因注入受體細(xì)胞核內(nèi)，通常是將目的基因注入早期胚胎內(nèi)或受精卵的膜內(nèi)，如把人或哺乳入早期胚胎內(nèi)或受精卵的膜內(nèi)，如把人或哺乳動(dòng)物的某種基因?qū)说讲溉閯?dòng)物的受精卵

21、里，動(dòng)物的某種基因?qū)说讲溉閯?dòng)物的受精卵里，若導(dǎo)人基因與受精卵里的染色體整合在一起，若導(dǎo)人基因與受精卵里的染色體整合在一起，細(xì)胞分裂時(shí)，染色體倍增，基因也隨之倍增，細(xì)胞分裂時(shí)，染色體倍增，基因也隨之倍增，每個(gè)細(xì)胞里都帶有導(dǎo)人的基因，而且能穩(wěn)定地每個(gè)細(xì)胞里都帶有導(dǎo)人的基因，而且能穩(wěn)定地遺傳到下一代。這樣一種新的個(gè)體，稱為轉(zhuǎn)基遺傳到下一代。這樣一種新的個(gè)體，稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。因動(dòng)物。 單克隆抗體單克隆抗體(monoclonal antibody) 由一個(gè)雜交瘤細(xì)胞及其后代產(chǎn)生的抗體，具有由一個(gè)雜交瘤細(xì)胞及其后代產(chǎn)生的抗體，具有單一、特異與純化的特性。單一、特異與純化的特性。 雜交瘤細(xì)胞是將骨髓瘤細(xì)胞

22、與受免脾淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞是將骨髓瘤細(xì)胞與受免脾淋巴細(xì)胞融合而獲得的。雜交瘤細(xì)胞繼承了兩個(gè)親本細(xì)融合而獲得的。雜交瘤細(xì)胞繼承了兩個(gè)親本細(xì)胞的遺傳特性，既能分泌抗體又能快速無限地胞的遺傳特性，既能分泌抗體又能快速無限地生長繁殖。生長繁殖。圖圖15-5 雜交瘤細(xì)胞與單克隆抗體制造示意圖雜交瘤細(xì)胞與單克隆抗體制造示意圖培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞抗原注入小鼠體內(nèi)抗原注入小鼠體內(nèi)收集收集骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞用用PEG促使細(xì)胞融促使細(xì)胞融合得到雜交瘤細(xì)胞合得到雜交瘤細(xì)胞分離受免疫分離受免疫脾淋巴細(xì)胞脾淋巴細(xì)胞在在HLT培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中培養(yǎng)克隆雜交克隆雜交瘤細(xì)胞瘤細(xì)胞篩選產(chǎn)生專一性抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選

23、產(chǎn)生專一性抗體的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大組織培養(yǎng)擴(kuò)大組織培養(yǎng)生成腹水瘤生成腹水瘤單抗產(chǎn)品單抗產(chǎn)品分離純化分離純化分離純化分離純化第二節(jié)第二節(jié) 藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)藥物質(zhì)量控制的生物化學(xué)基礎(chǔ)一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法一、藥物質(zhì)量控制的常用生化分析法（一）免疫法（一）免疫法1、免疫擴(kuò)散法、免疫擴(kuò)散法2、免疫電泳法、免疫電泳法3、放射免疫測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法4、酶聯(lián)免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法（二）電泳分析法（二）電泳分析法電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其所電泳是帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。常用的介質(zhì)電泳有紙電泳、醋酸纖維素薄膜常用的介質(zhì)

24、電泳有紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖電泳。電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳和瓊脂糖電泳。毛細(xì)管電泳的分離機(jī)制是根據(jù)被分析物質(zhì)在毛細(xì)管電泳的分離機(jī)制是根據(jù)被分析物質(zhì)在單位電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率不同而將物質(zhì)分開。單位電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率不同而將物質(zhì)分開。（三）酶法分析（三）酶法分析 酶法分析的原理是借助酶促反應(yīng)酶法分析的原理是借助酶促反應(yīng)( (包括單酶或包括單酶或多酶偶聯(lián)反應(yīng)多酶偶聯(lián)反應(yīng)) )對(duì)酶或酶所作用的底物或參與對(duì)酶或酶所作用的底物或參與酶促反應(yīng)的輔酶、激動(dòng)劑和抑制劑等進(jìn)行定性、酶促反應(yīng)的輔酶、激動(dòng)劑和抑制劑等進(jìn)行定性、定量分析。定量分析。1、終止反應(yīng)法、終止反應(yīng)法2、連續(xù)測(cè)定法、連續(xù)

25、測(cè)定法3、循環(huán)放大分析法、循環(huán)放大分析法表表15-2 酶法分析的特點(diǎn)酶法分析的特點(diǎn)二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析法二、生物藥物質(zhì)量控制的生化分析法（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物的主要分析方法（一）多肽與蛋白質(zhì)類藥物的主要分析方法1、蛋白質(zhì)藥物的純度分析、蛋白質(zhì)藥物的純度分析2、多肽與蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定、多肽與蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定 凝膠層析法凝膠層析法 SDS-PAGE3、蛋白質(zhì)的定量測(cè)定、蛋白質(zhì)的定量測(cè)定物理性質(zhì)：紫外分光光度法，折射率法，比濁法物理性質(zhì)：紫外分光光度法，折射率法，比濁法化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法，雙縮脲比色法，化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法，雙縮脲比色法，F(xiàn)olin酚法，酚法，BCA法法染色性質(zhì)：考

26、馬斯亮蘭染色性質(zhì)：考馬斯亮蘭G-250結(jié)合法、銀染、金染結(jié)合法、銀染、金染其他：熒光激發(fā)其他：熒光激發(fā)4、生物質(zhì)譜法、生物質(zhì)譜法（二）核酸類藥物的主要分析方法（二）核酸類藥物的主要分析方法1、紫外分光光度法測(cè)定、紫外分光光度法測(cè)定DNA與與RNA含量含量2、地衣酚顯色法測(cè)定、地衣酚顯色法測(cè)定RNA含量含量3、二苯胺法測(cè)定、二苯胺法測(cè)定DNA含量含量（三）酶類藥物的分析（三）酶類藥物的分析 酶類藥物的主要質(zhì)量指標(biāo)是它的催化活力。酶類藥物的主要質(zhì)量指標(biāo)是它的催化活力。 酶的測(cè)活方法包括比色法、紫外分光光度法、酶的測(cè)活方法包括比色法、紫外分光光度法、氣量法、旋光測(cè)定法、電化學(xué)法和液閃計(jì)數(shù)氣量法、旋光

27、測(cè)定法、電化學(xué)法和液閃計(jì)數(shù)法等法等（四）重組（四）重組DNA藥物中可能雜質(zhì)檢查藥物中可能雜質(zhì)檢查1、外源性、外源性DNA2、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)3、二聚體或多聚體測(cè)定、二聚體或多聚體測(cè)定4、降解產(chǎn)物的測(cè)定、降解產(chǎn)物的測(cè)定三、生物技術(shù)原理三、生物技術(shù)原理 基因工程主要包括基因的分離、制備、體外剪切、基因工程主要包括基因的分離、制備、體外剪切、重組、擴(kuò)增、表達(dá)與產(chǎn)物的純化等技術(shù)；重組、擴(kuò)增、表達(dá)與產(chǎn)物的純化等技術(shù)； 細(xì)胞工程則包括一切生物類型的基本單位一細(xì)胞細(xì)胞工程則包括一切生物類型的基本單位一細(xì)胞(有有時(shí)也包括器官或組織時(shí)也包括器官或組織)的離體培養(yǎng)、繁殖、再生、融的離體培養(yǎng)、繁殖、再

28、生、融合以及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)乃至染色體與細(xì)胞器合以及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)乃至染色體與細(xì)胞器(如線粒如線粒體、葉綠體等體、葉綠體等)的移植與改建等操作技術(shù)；的移植與改建等操作技術(shù)； 酶工程是指酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其固定化技術(shù)以及由酶工程是指酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其固定化技術(shù)以及由酶制劑構(gòu)成的生物反應(yīng)器和生物傳感器等新技術(shù)、酶制劑構(gòu)成的生物反應(yīng)器和生物傳感器等新技術(shù)、新裝置的研究應(yīng)用；新裝置的研究應(yīng)用； 發(fā)酵工程也叫微生物工程，是在最適條件下，對(duì)單發(fā)酵工程也叫微生物工程，是在最適條件下，對(duì)單一菌種進(jìn)行培養(yǎng)，是生物特定產(chǎn)品的一種生物工藝一菌種進(jìn)行培養(yǎng)，是生物特定產(chǎn)品的一種生物工藝（三）限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用（三）限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 核酸限制性內(nèi)切酶核酸限制性內(nèi)切酶(restriction endonuclease)(restriction endonuclease)能特異識(shí)別核酸分子某些堿基序列并加以切開能特異識(shí)別核酸分子某些堿基序列并加以切開 其切口類型有兩種：其切口類型有兩種：一種為平端一種為平端(blunt end)(blun