第十三章 ELISA

1、第十三章第十三章 ELISAELISA原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果1.ELISA的原理的原理2.ELISA的類(lèi)型的類(lèi)型3.試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑免疫吸附劑 結(jié)合物結(jié)合物 酶底物的準(zhǔn)備酶底物的準(zhǔn)備 4.對(duì)照設(shè)定對(duì)照設(shè)定5.標(biāo)本的采取和保存標(biāo)本的采取和保存6.結(jié)果判斷結(jié)果判斷 原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果 ELISA ELISA是一種免疫測(cè)定（是一種免疫測(cè)定（immunoassayimmunoassay，IAIA） ?；A(chǔ)。基礎(chǔ): :抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底

2、物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.ELISA的原理的原理原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果酶免疫測(cè)定類(lèi)型酶免疫測(cè)定類(lèi)型 這種固相酶免疫測(cè)定方法在這種固相酶免疫測(cè)定方法在19711971年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（吸附劑測(cè)定（Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay），簡(jiǎn)），簡(jiǎn)稱(chēng)稱(chēng)ELISAE

3、LISA。酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果1.11.1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K K表示：表示：K

4、=AgK=AgAbAbAgAb ,AgAgAb ,AgAbAb的解離程度與的解離程度與K K值有關(guān)。值有關(guān)。高親高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果1.1.21.1.2特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性

5、。之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果1.1.31.1.3最適比例最適比例 原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果1.1.41.1.4敏感性敏感性化學(xué)比色法的敏感度為化學(xué)比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)標(biāo)

6、記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達(dá)，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml0.1ng/ml。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果1.41.4免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備

7、準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果2 2ELISAELISA的類(lèi)型的類(lèi)型 ELISA ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：方法中有三個(gè)必要的試劑：（1 1）固相的抗原或抗體，即）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑免疫吸附劑 （immunosorbentimmunosorbent）；（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為 結(jié)合物結(jié)合物 （conjugateconjugate）；（3 3）酶反應(yīng)的底物。）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。 原理原理類(lèi)型類(lèi)

8、型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果2.2.12.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于用于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶結(jié)合物酶結(jié)合物而建立此法。而建立此法。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果2.2.2 2.2.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體雙抗原夾心法測(cè)抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物

9、。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAgHBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。適的標(biāo)記方法。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果2.2.3 2.2.3 間接法測(cè)抗體間接法測(cè)抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相

10、應(yīng)抗體的方法。建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果2.2.4 2.2.4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。 原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果2.2.5 2.2.5 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，

11、可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISAELISA測(cè)定多用此法。測(cè)定多用此法。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果2.2.6 2.2.6 捕獲包被法測(cè)抗體捕獲包被法測(cè)抗體IgMIgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgMIgM抗體包被固相抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本

12、中的，以捕獲血清標(biāo)本中的IgMIgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgMIgM抗體和非特異性的抗體和非特異性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒性感染的早此法常用于病毒性感染的早期診斷。期診斷。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果2.2.7 ABS-ELISA2.2.7 ABS-ELISA法法 ：固相支持物；：固相支持物；：樣品；：樣品；：特異性：特異性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）；：辣根過(guò)氧化物酶：辣根過(guò)氧化物酶HRP-HRP-酶標(biāo)鏈親和素（酶標(biāo)鏈親和素（AvidinAvidin）；）

13、；：DABDAB顯色液；顯色液；：顯色；：顯色；原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3. ELISA3. ELISA的試劑的試劑(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。底物。（1 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5

14、5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6 6）洗滌液；）洗滌液；（7 7）酶反應(yīng)終止液）酶反應(yīng)終止液原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果ELISAELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備A A 固相載體固相載體 聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，聚氯乙烯。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板應(yīng)該是板應(yīng)該是吸附性能

15、好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底透明孔底透明度高度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相性能相近近。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 將抗原或抗體固定在過(guò)程稱(chēng)為包被將抗原或抗體固定在過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)(coating)。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受

16、蛋白質(zhì)的分子團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的通常含有更多的疏水基團(tuán)疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。，故更易吸附到固相載體表面。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果不易吸附不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。較多的抗原也可采用捕獲包被法。

17、親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNADNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。量測(cè)定。脂類(lèi)物質(zhì)脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)

18、的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體量太小，往往難

19、于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.1.4 3.1.4 包被用抗體包被用抗體IgGIgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在FcFc段上，抗體結(jié)合段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液. .須除去雜抗體后才能須除去雜抗體后才能用于用于ELISAELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收腹水中單抗的濃度

20、較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。，可取得更好的效果。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.1.5 3.1.5 包被的條件包被的條件pH9.6pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL緩沖液。緩沖液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置過(guò)夜，冰箱中放置過(guò)夜，3737中保溫中保溫2 2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，小

21、時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.1.6 3.1.6 封閉封閉封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥空隙，從而排斥ELISAELISA后

22、的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明膠明膠; ;脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%5%）。）。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封閉？固相均需封閉？原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.4 3.4 洗滌液洗滌液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀釋液為含中，常用的稀釋液為含0.05%0.05%吐溫吐溫2020磷磷酸鹽緩沖液。酸鹽緩沖液。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備

23、準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果ELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備B 3.2 3.2 結(jié)合物結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關(guān)鍵的試劑中關(guān)鍵的試劑 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的免疫活性 3 3含有或少含有游離的抗體（或抗原）含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.2.1 3.2.1 結(jié)合物用的抗原和抗體結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgGIgG，以

24、免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISAELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。的要求是抗原必須是高純度的。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.2.23.2.2酶酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不

25、貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和半乳糖苷酶和脲酶等。脲酶等。HRPHRP是一種糖蛋白，含糖量約為是一種糖蛋白，含糖量約為18%18%，分子量為，分子量為4400044000，是一，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成

26、，是一種卟啉蛋白質(zhì)。成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.2.3 3.2.3 結(jié)合物的制備結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%60%-70%）和重）和重復(fù)性好。復(fù)性好。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一

27、，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果?？贵w與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2 2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRPHRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成成chiffchiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效. .原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISAELISA中最后的酶活性測(cè)中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因定。但

28、游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。測(cè)，效果更好。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.2.43.2.4結(jié)合物的保存結(jié)合物的保存 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較

29、為穩(wěn)酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（例如慶大霉素）和防腐劑（HRPHRP結(jié)合物加硫柳泵，結(jié)合物加硫柳泵，APAP結(jié)結(jié)合物可加疊氮鈉）。合物可加疊氮鈉）。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.2.5 3.2.5 結(jié)合物的稀釋液結(jié)合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物

30、在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%0.1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白， 0.05%0.05%吐溫吐溫20 20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋?zhuān)谑褂脮r(shí)不需再行稀釋?zhuān)?-84-8保存期可達(dá)保存期可達(dá)6 6個(gè)月。個(gè)月。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物酶的底物原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在氧

31、化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm492nm處處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRPHRP結(jié)合物最常用的結(jié)合物最常用的底物。底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2為供氧體，為供氧體， H2O2為受氫體。為受氫體。DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。E原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHR

32、P作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMBTMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與試劑，只需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMBTMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm450nm。ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。所采用。HRPHRP對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O2H2O2、小分醇的過(guò)氧化、小分醇

33、的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物物和尿素過(guò)氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果APAP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯作為作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm405nm波長(zhǎng)處有吸波長(zhǎng)處有吸收峰。用收峰。用NaOHNaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。APAP也有發(fā)熒光底物（磷酸也有發(fā)熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮），可用于甲基傘酮），可用于ELISAELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的

34、比色法。作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果3.5 3.5 酶反應(yīng)終止液酶反應(yīng)終止液常用的常用的HRPHRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果4 4 對(duì)照設(shè)定對(duì)照設(shè)定 陽(yáng)性對(duì)照品陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)(positive control)和陰性對(duì)照品和陰性對(duì)照品(negative (negative co

35、ntrol)control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。的對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱(chēng)；加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱(chēng)；在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。質(zhì)的量。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果參考標(biāo)準(zhǔn)品參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等

36、）應(yīng)含有制作定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-54-5個(gè)個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中. .陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAgHBsAg檢測(cè)的陰檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含性對(duì)照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是陰性。也是陰性。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果5 5 標(biāo)本的采取和保存標(biāo)本的采取和保存 體液、分泌物和

37、排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原纖維蛋白原和和抗凝劑抗凝劑外，外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以酶活性的物質(zhì)，以HRPHRP為標(biāo)記的為標(biāo)記的ELISAELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。特異性顯色。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果加樣加

38、樣: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马?xiàng)基本操作注意事項(xiàng)原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果保溫保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)(incubation)。ELISAELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上

39、發(fā)屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么生。為什么ELISAELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？溫育常采用的溫度有溫育常采用的溫度有4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度）等（冰箱溫度）等。3737是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。合的合適溫度。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果保溫方式：保溫方式：ELISAELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：若用保溫箱：ELISAELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的

40、紗布，最板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布，最后將后將ELISAELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-2520-25，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一

41、次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。時(shí)測(cè)定。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果洗滌洗滌洗滌在洗滌在ELISAELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。的成敗。ELSIAELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)

42、。這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在可以說(shuō)在ELISAELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些洗滌的方式除某些ELISAELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有工操作有流水沖洗式和流水沖洗式和浸泡式兩種：浸泡式兩種：原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果（1 1）流水沖洗式）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流

43、水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性疏水性的，的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果

44、顯色顯色顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMBTMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。閱讀結(jié)

45、果。TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，約作用后，約4040分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至漸減弱，至2 2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果比色比色拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。 以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸

46、的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以光密度（結(jié)果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（度（absorbenceabsorbence，A A），兩者含義相同。通常的表示方法是），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波長(zhǎng)為的吸收波長(zhǎng)為492nm492nm，表示方法為，表示方法為AA4924

47、92nmnm或或ODOD492492nmnm。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISAELISA光度計(jì)。針對(duì)固光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到數(shù)一般可精確到0.0010.001，準(zhǔn)確

48、性為，準(zhǔn)確性為1%1%，重復(fù)性達(dá)，重復(fù)性達(dá)0.5%0.5%。操作時(shí)室溫宜在操作時(shí)室溫宜在15-3015-30，使用前先預(yù)熱儀器，使用前先預(yù)熱儀器15-3015-30分鐘，測(cè)分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。原理原理類(lèi)型類(lèi)型試劑試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備對(duì)照對(duì)照標(biāo)本標(biāo)本結(jié)果結(jié)果6 6 結(jié)果判斷結(jié)果判斷 6.1 6.1 定性測(cè)定定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出定性測(cè)定的結(jié)果