NatureofMutations

1、遺遺 傳傳 分分 析析發(fā)育生物學(xué)研究所發(fā)育生物學(xué)研究所吳曉暉吳曉暉 xiaohui_IV. 分析突變分析突變 突變對(duì)應(yīng)了多少個(gè)基因？突變對(duì)應(yīng)了多少個(gè)基因？ 每個(gè)基因分別是什么？每個(gè)基因分別是什么？ 基因突變導(dǎo)致哪些異常？基因突變導(dǎo)致哪些異常？ 各個(gè)基因怎樣受到突變影響？各個(gè)基因怎樣受到突變影響？ 各個(gè)基因的正常功能？各個(gè)基因的正常功能？ 各個(gè)基因的相互作用？各個(gè)基因的相互作用？ 有什么沒被發(fā)現(xiàn)？有什么沒被發(fā)現(xiàn)？突變表型分析突變表型分析 突變表型：一個(gè)生物體攜帶的基因突變表型：一個(gè)生物體攜帶的基因突變?cè)斐傻母鞣N表型變化突變?cè)斐傻母鞣N表型變化 野生表型：正常個(gè)體野生表型：正常個(gè)體(野生型野生型)的

2、表型的表型 自然野生群體缺乏一致表型自然野生群體缺乏一致表型乳腺癌患者的人種差異乳腺癌患者的人種差異 發(fā)生率發(fā)生率 (2005-2009) 白人：白人：122.1 x 10-6 黑人：黑人：116.9 x 10-6 死亡率死亡率/發(fā)生率發(fā)生率 (2005-2009) 白人：白人：0.18 黑人：黑人：0.27 65歲生存率歲生存率 (各各7,375名名) 白人：白人：68.8% 黑人：黑人：55.9% 治療差異的差異：治療差異的差異：0.81%CDC, MMWR, 2012Silber JH et al. JAMA, 2013用于遺傳分析的野生型用于遺傳分析的野生型 選擇自交系為野生型選擇自交

3、系為野生型 所有個(gè)體基因型一致所有個(gè)體基因型一致 所有位點(diǎn)均已純合化所有位點(diǎn)均已純合化 由野生型出發(fā)進(jìn)行誘變篩選由野生型出發(fā)進(jìn)行誘變篩選 實(shí)際使用中的限制實(shí)際使用中的限制 自交系不健康自交系不健康(小鼠小鼠) 多種充當(dāng)野生型的自交系多種充當(dāng)野生型的自交系(小鼠、斑馬魚、小鼠、斑馬魚、果蠅、酵母、擬南芥等果蠅、酵母、擬南芥等) 自交系存在遺傳漂變自交系存在遺傳漂變 (果蠅果蠅)遺傳背景影響著表型遺傳背景影響著表型Qiu J et al, Endocrinology 2001 142: 3421-5Ob突變引起突變引起C57BL/6J和和BALB/cJ小小鼠表現(xiàn)不同鼠表現(xiàn)不同與多個(gè)自交系回交以了解

4、基因功能與多個(gè)自交系回交以了解基因功能克服遺傳背景的影響克服遺傳背景的影響 誘變篩選獲得的品系往往攜帶多個(gè)突變誘變篩選獲得的品系往往攜帶多個(gè)突變 利用遺傳定位檢測(cè)各種表型是否定位一利用遺傳定位檢測(cè)各種表型是否定位一致致 Nusslein-Volhard和和Weischaus分別定位了分別定位了致死和胚胎發(fā)育圖式表型致死和胚胎發(fā)育圖式表型 通過連續(xù)回交獲得攜帶單一突變的個(gè)體通過連續(xù)回交獲得攜帶單一突變的個(gè)體 在反式雜合子中檢測(cè)突變表型在反式雜合子中檢測(cè)突變表型 Nusslein-Volhard和和Weischaus用反式雜合用反式雜合子確認(rèn)了幾乎所有突變表型子確認(rèn)了幾乎所有突變表型基因功能多效性

5、與表型基因功能多效性與表型 單個(gè)基因經(jīng)常在不同生命活動(dòng)中起作用單個(gè)基因經(jīng)常在不同生命活動(dòng)中起作用(pleiotropy) 一類表型可以掩蓋另一類表型一類表型可以掩蓋另一類表型 誘變篩選發(fā)現(xiàn)特定表型的突變體誘變篩選發(fā)現(xiàn)特定表型的突變體 突變體往往具有其他表型突變體往往具有其他表型原發(fā)表型與繼發(fā)表型原發(fā)表型與繼發(fā)表型 突變經(jīng)常引起一系列因果相繼的表突變經(jīng)常引起一系列因果相繼的表型變化型變化 篩選經(jīng)常發(fā)現(xiàn)最終的表型缺陷篩選經(jīng)常發(fā)現(xiàn)最終的表型缺陷 確定原發(fā)表型需要細(xì)致分析確定原發(fā)表型需要細(xì)致分析篩選剛毛發(fā)育突變體篩選剛毛發(fā)育突變體Rooke et al, 1996Epidermal precursor

6、sProneural GenesProneural cluster cellsNotch SignalingNeural precursors發(fā)現(xiàn)調(diào)控發(fā)現(xiàn)調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的基因細(xì)胞命運(yùn)的基因Artavanis-Tsakonas et al, 1997IV. 分析突變分析突變 突變對(duì)應(yīng)了多少個(gè)基因？突變對(duì)應(yīng)了多少個(gè)基因？ 每個(gè)基因分別是什么？每個(gè)基因分別是什么？ 基因突變導(dǎo)致哪些異常？基因突變導(dǎo)致哪些異常？ 各個(gè)基因怎樣受到突變影響？各個(gè)基因怎樣受到突變影響？ 各個(gè)基因的正常功能？各個(gè)基因的正常功能？ 各個(gè)基因的相互作用？各個(gè)基因的相互作用？ 有什么沒被發(fā)現(xiàn)？有什么沒被發(fā)現(xiàn)？突變對(duì)基因功能的影響突變

7、對(duì)基因功能的影響 喪失功能的突變喪失功能的突變 亞效突變亞效突變(Hypomorphs): 部分失活部分失活 無效突變無效突變(Amorphs): 完全失活完全失活 (null) 獲得功能的突變獲得功能的突變 超效突變超效突變(Hypermorph): 表型效應(yīng)超過野生型基因表型效應(yīng)超過野生型基因 (顯性激活顯性激活，dominant active) 反效突變反效突變(Antimorph): 作用和野生型基因相對(duì)抗作用和野生型基因相對(duì)抗 (顯性失活，顯性失活，dominant negative) 新效突變新效突變(Neomorphs): 產(chǎn)生野生型基因沒有的新性產(chǎn)生野生型基因沒有的新性狀狀表型

8、評(píng)估表型評(píng)估 顯性與隱性顯性與隱性等位基因與表型的共有特征等位基因與表型的共有特征對(duì)生命活動(dòng)穩(wěn)健性的影響對(duì)生命活動(dòng)穩(wěn)健性的影響 評(píng)估表型的強(qiáng)弱評(píng)估表型的強(qiáng)弱外顯率外顯率: : 具有表型的動(dòng)物比例具有表型的動(dòng)物比例表現(xiàn)度表現(xiàn)度: : 表型的嚴(yán)重程度表型的嚴(yán)重程度The Cell, 2nd ed, GM Cooper線蟲產(chǎn)卵器發(fā)育線蟲產(chǎn)卵器發(fā)育The Cell2nd edGM CooperRas 在產(chǎn)卵器誘導(dǎo)中的作用在產(chǎn)卵器誘導(dǎo)中的作用Vulval+acVulacMuvac正常狀態(tài)正常狀態(tài)Ras的調(diào)控的調(diào)控: : 被限制的被限制的 VPC 誘導(dǎo)誘導(dǎo) 形成一個(gè)產(chǎn)卵器形

9、成一個(gè)產(chǎn)卵器Ras失活失活: : 沒有沒有VPC 誘導(dǎo)誘導(dǎo) 沒有產(chǎn)卵器形成沒有產(chǎn)卵器形成(Vul)Ras 過度激活過度激活: : 所有所有 V VPCs 被誘導(dǎo)被誘導(dǎo)多個(gè)產(chǎn)卵器形成多個(gè)產(chǎn)卵器形成(Muv)失活突變失活突變 線蟲線蟲let-60 ras 完全失活完全失活 - - 早期致死早期致死 = = ras維持生命維持生命 部分失活部分失活 - - 沒有產(chǎn)卵器沒有產(chǎn)卵器 = = ras在產(chǎn)卵器誘導(dǎo)中起作用在產(chǎn)卵器誘導(dǎo)中起作用10050W.T.VulLethal產(chǎn)卵器正常發(fā)育所需最小基因劑量存活所需最小基因劑量完全失活突變完全失活突變 顯示了最完整的基因功能顯示了最完整的基因功能 容易推斷出正

10、常的基因功能容易推斷出正常的基因功能 在信號(hào)通路研究中更具說服力在信號(hào)通路研究中更具說服力 ( (上位分析上位分析) )區(qū)分部分失活與完全失活 分子水平分子水平分子損傷分子損傷基因表達(dá)基因表達(dá) 遺傳水平遺傳水平表型的嚴(yán)重程度表型的嚴(yán)重程度與基因缺失系的比較與基因缺失系的比較根據(jù)表型強(qiáng)弱評(píng)估基因失活程度 外顯率外顯率: : 具有表型的動(dòng)物數(shù)量具有表型的動(dòng)物數(shù)量例例: : let-60 ras品系品系% 致死的動(dòng)物致死的動(dòng)物n20211%n187657% 外顯率外顯率: : 具有表型的動(dòng)物數(shù)量具有表型的動(dòng)物數(shù)量例例: : let-60 ras品系品系% 致死的動(dòng)物致死的動(dòng)物n20211%n1876

11、57% 表現(xiàn)度表現(xiàn)度: : 表型的嚴(yán)重程度表型的嚴(yán)重程度例例: : dpy-20 collagen 野生型野生型部分失活部分失活完全失活完全失活根據(jù)表型強(qiáng)弱評(píng)估基因失活程度例例: : dpy-20 collagen 野生型野生型部分失活部分失活完全失活完全失活 多效性多效性: : 顯示出新的表型顯示出新的表型多效性越強(qiáng)表明基因的突變?cè)綇?qiáng)多效性越強(qiáng)表明基因的突變?cè)綇?qiáng)根據(jù)表型強(qiáng)弱評(píng)估基因失活程度 外顯率外顯率: : 具有表型的動(dòng)物數(shù)量具有表型的動(dòng)物數(shù)量例例: : let-60 ras品系品系% 致死的動(dòng)物致死的動(dòng)物n20211%n187657% 表現(xiàn)度表現(xiàn)度: : 表型的嚴(yán)重程度表型的嚴(yán)重程度與缺

12、失系比較與缺失系比較 缺失系相應(yīng)的基因完全失活缺失系相應(yīng)的基因完全失活 完全失活突變的表型應(yīng)與缺失系表型相似完全失活突變的表型應(yīng)與缺失系表型相似 缺失系表型不應(yīng)比完全失活表型嚴(yán)重缺失系表型不應(yīng)比完全失活表型嚴(yán)重 多種比較多種比較 Df/mut = mut/mut Df/mut(weak) = null/mut(weak)非互補(bǔ)篩選非互補(bǔ)篩選非互補(bǔ)篩選非互補(bǔ)篩選 篩選與已知品系篩選與已知品系“無法互補(bǔ)無法互補(bǔ)”的新品系的新品系 從部分失活突變分離新的完全失活突變從部分失活突變分離新的完全失活突變 不需要對(duì)表型進(jìn)行假設(shè)不需要對(duì)表型進(jìn)行假設(shè) 完全失活表型最有力的遺傳學(xué)證據(jù)完全失活表型最有力的遺傳學(xué)證

13、據(jù)Hypomorph/Df已知表型已知表型Hypomorph/null相同已知表型相同已知表型Hypomorph/+根據(jù)表型尋找完全失活突變根據(jù)表型尋找完全失活突變誘變劑誘變劑非互補(bǔ)篩選非互補(bǔ)篩選 dpy-20 dpy-20 完全失活突變完全失活突變第一步：檢測(cè)第一步：檢測(cè)hypomorph/Df 是否引起一個(gè)可以是否引起一個(gè)可以用于篩選的表型用于篩選的表型W.T. dpy-20 (hypo) dpy-20 (hypo) dpy-20 (hypo) Df篩選這個(gè)表型篩選這個(gè)表型第二步：篩選第二步：篩選 + + dpy-20(hypo) dpy-20(hypo)x最常見:dpy-20(hypo)

14、/+Non-Dpy少見:dpy-20(hypo)/dpy-20(NEW)Dpy誘變劑非互補(bǔ)篩選非互補(bǔ)篩選 dpy-20 完全失活突變完全失活突變第三步：分析第三步：分析 表型最強(qiáng)的突變可能是完全失活突變表型最強(qiáng)的突變可能是完全失活突變 即使完全失活突變有新表型也可以被分離即使完全失活突變有新表型也可以被分離 會(huì)得到表型相同的顯性突變會(huì)得到表型相同的顯性突變! !非互補(bǔ)篩選非互補(bǔ)篩選 dpy-20 完全失活突變完全失活突變失活突變通常是隱性的失活突變通常是隱性的10050+/+/nullVul 表型的臨界值Let 表型的臨界值VulLet% 正常功能例例: let-60 ras結(jié)論結(jié)論: : 通

15、常檢測(cè)到表型的臨界值小于正常水平的通常檢測(cè)到表型的臨界值小于正常水平的50%50%顯性的失活突變顯性的失活突變 單倍劑量不足單倍劑量不足(Haploinsufficiency) 正常劑量的正常劑量的50%已經(jīng)小于臨界值已經(jīng)小于臨界值 可用缺失系表型模擬可用缺失系表型模擬 常見于劑量敏感的基因常見于劑量敏感的基因 由多突變產(chǎn)生的表型由多突變產(chǎn)生的表型 由腫瘤抑制基因突變導(dǎo)致的癌癥易感性由腫瘤抑制基因突變導(dǎo)致的癌癥易感性Rb-/+ - Rb-/- W.T. - 腫瘤腫瘤 Rb- 攜帶者易因自發(fā)的第二點(diǎn)突變而患視網(wǎng)膜母細(xì)攜帶者易因自發(fā)的第二點(diǎn)突變而患視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤胞瘤 常染色體顯性常染色體顯性區(qū)分各

16、種獲得功能的突變區(qū)分各種獲得功能的突變 根據(jù)基因劑量區(qū)分根據(jù)基因劑量區(qū)分增加野生型拷貝增加野生型拷貝減少野生型拷貝減少野生型拷貝超效突變超效突變 增強(qiáng)增強(qiáng)減弱減弱新效突變新效突變不變不變不變不變反效突變反效突變減弱減弱增強(qiáng)增強(qiáng) 用染色體缺失減少野生型拷貝數(shù)用染色體缺失減少野生型拷貝數(shù) 用染色體重復(fù)增加野生型拷貝數(shù)用染色體重復(fù)增加野生型拷貝數(shù)功能獲得突變的等位性功能獲得突變的等位性 無法進(jìn)行互補(bǔ)測(cè)試無法進(jìn)行互補(bǔ)測(cè)試 根據(jù)相似表型與相同遺傳定位判斷根據(jù)相似表型與相同遺傳定位判斷 尋找分子證據(jù)尋找分子證據(jù) 回復(fù)顯性突變，產(chǎn)生完全失活品系，檢測(cè)等位性回復(fù)顯性突變，產(chǎn)生完全失活品系，檢測(cè)等位性 例例.

17、Let-60(n1046gf)n1046/ n104695% Muvn1046/null7% Muvn1046/(n1046 null) 7% Muv+/+Dosagenull/+lfnullDp/+gf/+野生型野生型突變表型突變表型突變表型突變表型IV. 分析突變分析突變 突變對(duì)應(yīng)了多少個(gè)基因？突變對(duì)應(yīng)了多少個(gè)基因？ 每個(gè)基因分別是什么？每個(gè)基因分別是什么？ 基因突變導(dǎo)致哪些異常？基因突變導(dǎo)致哪些異常？ 各個(gè)基因怎樣受到突變影響？各個(gè)基因怎樣受到突變影響？ 各個(gè)基因的正常功能？各個(gè)基因的正常功能？ 各個(gè)基因的相互作用？各個(gè)基因的相互作用？ 有什么沒被發(fā)現(xiàn)？有什么沒被發(fā)現(xiàn)？ 表達(dá)與活性表達(dá)與

18、活性 空間分辨率與時(shí)間分辨率空間分辨率與時(shí)間分辨率 動(dòng)物、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器水平動(dòng)物、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器水平 發(fā)育階段或?qū)崟r(shí)檢測(cè)發(fā)育階段或?qū)崟r(shí)檢測(cè)基因產(chǎn)物在何時(shí)何地起作用？基因產(chǎn)物在何時(shí)何地起作用？基因表達(dá)分析基因表達(dá)分析檢測(cè)檢測(cè)RNA Northern 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR 原位雜交原位雜交 報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄 微芯片微芯片 大規(guī)模大規(guī)模RNA測(cè)序測(cè)序檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)蛋白質(zhì) Western 免疫熒光免疫熒光 報(bào)告基因表達(dá)報(bào)告基因表達(dá) 蛋白組學(xué)蛋白組學(xué)空間分辨率與時(shí)間分辨率空間分辨率與時(shí)間分辨率基因捕捉基因捕捉: 為突變基因貼上標(biāo)簽為突變基因貼上標(biāo)簽真核基因表達(dá)真核基因表達(dá)增強(qiáng)子增強(qiáng)子SASASDSDpolyAAAAAA啟動(dòng)子啟動(dòng)子插入突變插入突變SASASDSDpolyA增強(qiáng)子增強(qiáng)子啟動(dòng)子啟動(dòng)子增強(qiáng)子捕捉增強(qiáng)子捕捉SASASDSDpolyAAAAAA 獲得細(xì)胞或組織特異標(biāo)記獲得細(xì)胞或組織特異標(biāo)記 基因編碼區(qū)可能仍在遠(yuǎn)處基因編碼區(qū)可能仍在遠(yuǎn)處 可能不存在相應(yīng)基因可能不存在相應(yīng)基因 必需依靠?jī)?nèi)源基因表達(dá)進(jìn)行選擇必需依靠?jī)?nèi)源基因表達(dá)進(jìn)行選擇報(bào)告基因報(bào)告基因增強(qiáng)子增強(qiáng)子啟動(dòng)子啟動(dòng)子SASASDSDpolyA 難以發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子較小的基因難以發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子較小的基因