第八章霉菌毒素檢驗(yàn)

1、第七章第一節(jié)概述定義及來源危害及方法第二節(jié)抗生素類四環(huán)素類氯霉素類磺胺類硝基呋喃類第三節(jié)鹽酸克倫特羅概述檢驗(yàn)第四節(jié)激素類概述HPLC測(cè)乙烯雌酚第七章課后復(fù)習(xí)n抗生素類分類：四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類藥物、硝基呋喃類nCAPs是禁止用于食品動(dòng)物并不得在動(dòng)物性食品中檢出的抗生素。n鹽酸克倫特羅毒性第九章第九章 食品中真菌毒素檢驗(yàn)食品中真菌毒素檢驗(yàn)n9.1 概述概述n9.2 黃曲霉毒素的檢驗(yàn)黃曲霉毒素的檢驗(yàn)n9.3 赭曲霉毒素赭曲霉毒素A的檢驗(yàn)的檢驗(yàn)n9.4 展青霉素的檢驗(yàn)展青霉素的檢驗(yàn)n9.5 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的檢驗(yàn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的檢驗(yàn)n9.6 T-2毒素的檢

2、驗(yàn)毒素的檢驗(yàn)n9.7 玉米赤霉烯酮的玉米赤霉烯酮的檢驗(yàn)檢驗(yàn)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述n1.1 霉菌及霉菌毒素霉菌及霉菌毒素n1.2 霉菌毒素的命名及分類霉菌毒素的命名及分類n1.3 霉菌毒素的產(chǎn)生條件霉菌毒素的產(chǎn)生條件n1.4 毒性與危害毒性與危害1.1 霉菌及霉菌毒素霉菌及霉菌毒素n霉菌（fungi）：是菌絲體比較發(fā)達(dá)而又沒有較大子實(shí)體的一部分真菌的通稱。n霉菌毒素（Mycotoxin）：指少數(shù)霉菌在污染食品上繁殖所產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，它對(duì)人、牲畜引起損害。霉菌產(chǎn)毒的特點(diǎn)霉菌產(chǎn)毒的特點(diǎn)n1）霉菌中僅少數(shù)菌種能夠產(chǎn)毒，少數(shù) 產(chǎn)毒 霉菌只有一部分菌株可以產(chǎn)毒。n2）霉菌產(chǎn)毒具有可變性n3) 產(chǎn)毒的菌

3、種所產(chǎn)生的霉菌毒素?zé)o嚴(yán) 格專一性n4） 產(chǎn)毒霉菌產(chǎn)生毒素需一定條件。常見霉菌和霉菌毒素名稱常見霉菌和霉菌毒素名稱n曲霉菌屬：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、 雜色曲霉毒素n青霉菌屬：黃綠青霉素、展青霉素、黃天 精、桔青霉毒素n鐮刀菌屬： 單端孢霉烯族化合物、玉米赤霉烯酮、丁烯酸內(nèi)酯、串珠鐮刀菌毒素1.2 霉菌毒素的命名及分類霉菌毒素的命名及分類n霉菌毒素的命名常按產(chǎn)生毒素的霉菌名稱來確定n霉菌毒素的分類尚無統(tǒng)一的系統(tǒng)命名方法，常用的分類法是按毒素作用部位分為肝臟毒素、腎臟毒素、神經(jīng)毒素等；按毒素來源分為霉菌毒素類、青霉毒素類、鐮刀菌毒素類；按作用機(jī)理分為抑制蛋白質(zhì)合成類、作用于離子通道類、作用于細(xì)胞骨

4、架類、作用于細(xì)胞突觸類；按毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)分為二呋喃類、內(nèi)酯環(huán)類、醌類。1.3 霉菌毒素的產(chǎn)生條件霉菌毒素的產(chǎn)生條件n霉菌毒素產(chǎn)生過程：是霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物。在生長(zhǎng)后期，初級(jí)代謝產(chǎn)物：如三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物乙酰輔酶A、丙酮酸等大量堆積，使其啟動(dòng)另外合成途徑。n產(chǎn)生條件：水分、pH值、環(huán)境溫度、濕度及氧氣等因素。糧食水分在1718、濕度在8090、溫度在2530及有氧條件、中性附件處有利于霉菌的繁殖。 1.3 霉菌毒素的產(chǎn)生條件霉菌毒素的產(chǎn)生條件n食品菌相：共存于食品中的細(xì)菌種類和相對(duì)數(shù)量的構(gòu)成。食品菌相：共存于食品中的細(xì)菌種類和相對(duì)數(shù)量的構(gòu)成。如：糧谷中以曲霉和青霉常見，小麥和玉米以鐮刀菌污染為主

5、。因此，通過對(duì)食品霉菌菌相的分析，大致可判斷可能產(chǎn)生的毒素種類。n黃曲霉毒素： 玉米、花生等 青霉菌毒素： 大米、水果等 鐮刀菌及毒素：小米、玉米等 霉菌污染食品質(zhì)量的評(píng)定及食品衛(wèi)生意義霉菌污染食品質(zhì)量的評(píng)定及食品衛(wèi)生意義 n1) 霉菌菌相構(gòu)成n田野霉：新鮮，交鏈孢酶素n曲霉、青霉:可檢毒素，但不表示變質(zhì)n毛霉、根霉：糧食霉變n2) 霉菌的污染度：即單位重量或容積的食品或100粒糧食上霉菌總數(shù)，表示食品帶染霉菌情況 。1.4 毒性與危害毒性與危害n霉菌引起食品和飼料霉變?cè)斐傻慕?jīng)濟(jì)損失很大，據(jù)介紹，世界上平均每年由于霉變而不能食用的各類谷物約占總量的2。60年代以來，不斷發(fā)現(xiàn)霉菌污染食品引起中毒

6、的事件，研究其原因是由于不少霉菌的代謝產(chǎn)物為有毒物質(zhì)。1960年英國(guó)的10萬只火雞發(fā)生肝損害而死亡，后來證實(shí)是飼料中黃曲霉菌的代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素所致。n可引起急性中毒，更多是慢性中毒。致癌、致畸和致突變的物質(zhì)。特別是黃曲霉毒素。第二節(jié)第二節(jié) 黃曲霉毒素的檢驗(yàn)黃曲霉毒素的檢驗(yàn)n2.1 概述概述n2.2 薄層色譜法薄層色譜法n2.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法n2.4 高效液相色譜測(cè)定法高效液相色譜測(cè)定法n2.5 微柱篩選法微柱篩選法2.1 概述概述n理化性質(zhì)：結(jié)構(gòu)，黃曲霉毒素（aflatoxins,AFT）是含有二呋喃環(huán)和香豆素（氧雜萘鄰?fù)┮活惢衔锏目偡Q；溶解性，難溶于水、乙醚、石

7、石油醚、己烷油醚、己烷等，易溶于甲醇、三氯甲烷、苯、甲醇、三氯甲烷、苯、乙腈乙腈等極性較小的有機(jī)溶劑；穩(wěn)定性，對(duì)光穩(wěn)定，一般烹調(diào)加工溫度不被破壞，中性和弱酸性條件下穩(wěn)定，堿性條件下易分解為無毒物質(zhì)；對(duì)氧化劑不穩(wěn)定。n天然食品中常檢出天然食品中常檢出AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、AFTM1。n從結(jié)構(gòu)上看從結(jié)構(gòu)上看，可把它們分成兩大類：即，可把它們分成兩大類：即B族和族和G族，從族，從B族和族和G族又派生出許多衍生物。所謂族又派生出許多衍生物。所謂B族和族和G族的來源是在研究族的來源是在研究AFT初期，用氧化鋁板初期，用氧化鋁板作薄層板，在紫外光照射下，作薄層板，在紫外光照射下，

8、可觀察到一些物質(zhì)可觀察到一些物質(zhì)發(fā)藍(lán)色熒光發(fā)藍(lán)色熒光(blue)，稱為，稱為B族；另一些物質(zhì)發(fā)綠族；另一些物質(zhì)發(fā)綠色熒光色熒光(green) 稱為稱為G族。族。n主要來源：主要是黃曲霉（Aspergillus flavus部分產(chǎn)毒） 、寄生曲霉(Aspergillus parasitlas 所有菌株產(chǎn)毒)等代謝產(chǎn)物。AFT主要污染糧油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉子等。此外，在核桃、乳及乳制品、干辣椒中也有發(fā)現(xiàn)AFT的污染。n常檢出AFTB1，奶和奶制品中易檢出AFTM1。n在我國(guó)，產(chǎn)生黃曲霉毒素的菌種主要是黃曲霉，一般濕熱地區(qū)產(chǎn)毒株多、產(chǎn)毒量大。黃曲霉菌絲狀菌落黃曲霉菌絲狀菌落n毒

9、性與危害：是一類毒性很大的物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物能造成急性中毒，其毒性是氰化鉀10倍；還能引起慢性中毒和致癌、致畸、致突變。其慢性中毒的主要表現(xiàn)是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)生障礙，肝臟出現(xiàn)亞急性或慢性損傷AFT是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物質(zhì)。比二甲基亞硝胺誘發(fā)肝癌的能力大75倍，所以，世界衛(wèi)生組織(WHO)在確定重點(diǎn)研究的毒物中，AFT被列在首位。其作用部位主要是肝臟。nAFTB1在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)羥化反應(yīng)生成兩種主要代謝產(chǎn)物AFTM1和AFTQ。前者與AFTB1的毒性和致癌性近似。牛飼料、牛奶。名稱名稱 LDLD5050倍數(shù)倍數(shù)AFBAFB1 10.3350.3351 166666630030013601360DDTDDT

10、200200630630CDTCDT5959201201AsAs2 2O O3 330306363KCNKCN3 31010 AFB1與其它毒物的與其它毒物的LD50慢性毒性慢性毒性A 肝組織學(xué)變化：肝細(xì)胞變性，壞死，再生結(jié)節(jié)，肝管上皮增生及肝纖維化、肝硬化 B 肝功能變化：血清轉(zhuǎn)氨酶，ATP ，堿性磷酸酶,球蛋白升高C 其它癥狀：生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，體重下降，食物利用率降低，母畜不育或產(chǎn)仔少等。性別AFB1飼料 ppm喂飼時(shí)間平均周數(shù)肝癌發(fā)病率雄14118/22雌1644/4雄0.3526/20雌0.37011/11雄0.0156812/12雌0.0158213/13AFB1 對(duì)大鼠致癌性對(duì)大鼠致

11、癌性AFT 對(duì)人類毒性對(duì)人類毒性A人體細(xì)胞體外試驗(yàn)：抑制細(xì)胞分裂、DNA合 成、染色體破碎B人類急性中毒：非洲、印度、中國(guó)等均有 攝入AFT污染食品中毒報(bào)道 2005年年5月肯尼亞月肯尼亞7人食用人食用AFT污染玉米中毒死亡污染玉米中毒死亡C人類肝癌流行病學(xué)：AFT污染程度與人群肝癌發(fā)病率死亡率正相關(guān)；AFT增加乙肝患者肝癌發(fā)病率國(guó)家地區(qū)AFTB1攝入攝入量量（ng/Kg體重體重/日日 原發(fā)性原發(fā)性 病例數(shù)病例數(shù)肝癌肝癌發(fā)病率（發(fā)病率（1/10萬人年）萬人年）肯尼亞肯尼亞高地勢(shì)區(qū)高地勢(shì)區(qū)3.541.2泰國(guó)泰國(guó)Songkhla5.022.0斯威士蘭斯威士蘭 高原高原5.1112.2肯尼亞肯尼亞中

12、地勢(shì)區(qū)中地勢(shì)區(qū)5.9332.5斯威士蘭斯威士蘭溫暖草原溫暖草原8.9293.8肯尼亞肯尼亞低地勢(shì)區(qū)低地勢(shì)區(qū)10.0494.0斯威士蘭斯威士蘭Lebombo15.444.3泰國(guó)泰國(guó)Rntburi45.066.0斯威士蘭斯威士蘭低溫草原低溫草原43.1429.2莫桑比克莫桑比克Inhamba222.446213黃曲霉毒素?cái)z入量與原發(fā)性肝癌發(fā)病率n衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：污染食品的主要是AFTB1、B2、Gl 、 G2、 M1等，其中尤以AFTB1最為重要。世界衛(wèi)生組織的糧農(nóng)組織(FA0WHO)規(guī)定食品中AFTB1不得超15ppb；美國(guó)不得超過25ppb；日本規(guī)定不得超過10ppb；以色列和瑞典規(guī)定不得檢出。我國(guó)

13、對(duì)各種主要食品中AFT B1允許含量是：玉米、花生仁、花生油及其制品不得超過20ppb；大米和其他食用油不得超過10ppb；其他糧食、豆類、發(fā)酵食品不得超過5ppb；嬰兒代乳品不得檢出。預(yù)防措施預(yù)防措施n去毒：去毒： 挑選霉粒挑選霉粒n物理方法物理方法: 碾軋加工法碾軋加工法n 加水搓洗加水搓洗n 吸附法吸附法n化學(xué)方法：加堿處理法加堿處理法 n 二甲基乙醚去油脂中的二甲基乙醚去油脂中的AFB1n新方法：新方法：高壓破壞、臭氧、微生物去毒高壓破壞、臭氧、微生物去毒二、霉菌毒素的檢測(cè)二、霉菌毒素的檢測(cè) 黃曲霉毒素的檢測(cè)黃曲霉毒素的檢測(cè) 我國(guó)涉及黃曲霉毒素的限量及檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有我國(guó)涉及黃曲霉毒素

14、的限量及檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有GB 27611981(食品中黃曲霉毒素食品中黃曲霉毒素B1允許量標(biāo)準(zhǔn)允許量標(biāo)準(zhǔn))、GB 9676-1988(牛乳及其制品中黃曲霉毒索牛乳及其制品中黃曲霉毒索M，限量衛(wèi)生，限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn))、GBT 17480-1998(酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定飼料中黃曲霉酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定飼料中黃曲霉毒素毒素B1)、GBT 500922-1996薄層色譜法薄層色譜法(第一法第一法)ELISA(第第二法二法)測(cè)定食品中黃曲霉毒素測(cè)定食品中黃曲霉毒素B，GBT 5009231996薄層色譜法薄層色譜法(第一法第一法)微柱篩選微柱篩選法法(第二法第二法)測(cè)定食品中黃曲霉毒素測(cè)定食品中黃曲霉毒素B

15、1、B2、G1、G22.2 薄層色譜法薄層色譜法n原理：樣品中AFTB1經(jīng)甲醇-水溶液提取后，濃縮、苯-乙腈溶液定容、點(diǎn)樣于硅膠G薄層板上，經(jīng)展開分離后，在波長(zhǎng)365nm紫外光下觀察藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的強(qiáng)度于標(biāo)準(zhǔn)比較來確定含量。n樣品處理：樣品經(jīng)正己烷或石油醚石油醚和甲醇甲醇-水溶液（5545）振蕩提取，樣品中油脂、色素等雜質(zhì)進(jìn)入正己烷層，而AFTB1和水溶性雜質(zhì)留在甲醇-水層。用三氯三氯甲烷甲烷反提取甲醇-水層，由于AFTB1更易溶于三氯甲烷層，從而進(jìn)入三氯甲烷層，雜質(zhì)留在水層。將三氯甲烷層通過盛有無水硫酸鈉的慢速定量濾紙過濾于蒸發(fā)皿中，水浴通風(fēng)揮干，冷卻后用苯-乙腈（98

16、2）混合液溶解殘?jiān)鼽c(diǎn)樣液。n定性測(cè)定：將樣液與標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)樣，用丙酮-三氯甲烷（892）展開，晾干在365nm紫外光下觀察，若在Rf值0.6附近有藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，可能有。然后在點(diǎn)樣處滴加三氟乙酸，則AFTB1水解成AFTB2a ，極性增大， Rf值由0.6降為0.1。n定量測(cè)定：以最低檢出限量0.0004g為標(biāo)準(zhǔn)。n雙向展開法：先用無水乙醚作橫向展開，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)外而AFTB1不動(dòng)，然后再縱向展開。2.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法n原理：原理：將已知抗原吸附在酶標(biāo)微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗體與待測(cè)樣品提取液的混合液，競(jìng)爭(zhēng)孵育后，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物

17、，消除多余抗體成分及游離的抗原抗體復(fù)合物，然后加入酶標(biāo)記的第二抗體，與吸附在固體表面的抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和樣品的吸光度值，計(jì)算樣品中的抗原含量。n樣品處理：粉碎均勻樣品用乙腈-水（5050）（碳酸鹽緩沖液pH至8.0）進(jìn)行提取，濾紙過濾，濾液用含0.1牛血清白蛋白（BSA）的洗液稀釋后，供檢測(cè)。n測(cè)定：用包被抗原（ AFTB1和牛血清白蛋白結(jié)合物）包被酶標(biāo)微孔板，4過夜。用洗液洗去酶標(biāo)微孔板多余抗原后，加入毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品提取液，然后再加入AFTB1抗單克隆抗體，37孵育。多余抗體用洗液洗去，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗

18、鼠IgG， 37孵育。再次洗滌酶標(biāo)微孔板，加底物四甲基聯(lián)苯胺溶液， 37 孵育后用硫酸中止反應(yīng)。n方法說明：最低檢出限濃度為0.01ppb；ELISA試劑盒低溫保存。包被固相載體包被固相載體: : 用已知抗原包被用已知抗原包被固相載體固相載體 加待檢標(biāo)本加待檢標(biāo)本: : 使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合使相應(yīng)抗體與固相抗原結(jié)合洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì)洗滌，除去無關(guān)的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗抗體加酶標(biāo)抗抗體: :與固相載體上抗原抗體與固相載體上抗原抗體復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去復(fù)合物結(jié)合；洗滌，除去未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體未結(jié)合的酶標(biāo)抗抗體 加底物加底物顯色顯色 根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量測(cè)

19、定該抗原的定性或定量測(cè)定 飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定飼料中鹽酸克倫特羅的測(cè)定 飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素，飼料中毒素的測(cè)定（主要包括黃曲霉毒素， 赭赭曲霉毒素曲霉毒素 ） 飼料中有害微生物的快速篩檢飼料中有害微生物的快速篩檢 （如沙門氏（如沙門氏菌菌 ） 甲胺磷殘留分析甲胺磷殘留分析 甲基對(duì)硫磷殘留分析甲基對(duì)硫磷殘留分析 呋喃丹殘留分析呋喃丹殘留分析 ELISA在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用在飼料安全檢測(cè)中的應(yīng)用ELISA用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)河豚毒素河豚毒素 植物毒素如罌粟堿、嗎啡、藻類毒素植物毒素如罌粟堿、嗎啡、藻類毒素 苯并芘苯并芘 主要有除草劑與殺蟲劑兩大類主要有除草劑與

20、殺蟲劑兩大類 例如殺暝松（例如殺暝松（ FN FN ）、）、 甲氟磷酸異已酶（甲氟磷酸異已酶（ SOMAN SOMAN ）、）、 草不綠（草不綠（ Alachor Alachor ）、）、 西維因（西維因（ Carbaryl Carbaryl ）、）、 多菌靈及克菌丹（多菌靈及克菌丹（ Captan Captan ）等。）等。農(nóng)藥的檢測(cè)農(nóng)藥的檢測(cè)：2.4 高效液相色譜測(cè)定法高效液相色譜測(cè)定法n原理：樣品中的黃曲霉毒素經(jīng)C18柱分離，用帶熒光檢測(cè)器的HPLC檢測(cè)，時(shí)間定性面積定量。n樣品處理：（1）樣品提取，適量樣品加水浸潤(rùn)后加入三氯甲烷三氯甲烷振搖提取，加無水硫酸鈉濾紙過濾于量筒中。（2）樣品

21、凈化和衍生化反應(yīng)，將少量提取液通過多功多功能凈化柱能凈化柱層析管，用三氯甲烷-正己烷、三氯甲烷-甲醇淋洗液洗除雜質(zhì)，用丙酮-水洗脫，水浴揮干用三氯甲烷溶解殘?jiān)?，取部分溶液加入正己烷、三氟乙酸（TFA）混勻靜置30min，使AFTB1衍生為AFTB2a。氮?dú)獯蹈?，加入少量流?dòng)相溶解供HPLC測(cè)定。n方法說明：n提取時(shí)也可使用水溶性有機(jī)溶劑，如乙腈-水（91）或甲醇-水（82）。n本法流動(dòng)相含有磷酸鹽，用完后應(yīng)用去離子水徹底沖洗，再用甲醇沖洗，以保護(hù)色譜柱。流動(dòng)相也可用不含鹽的組分如乙腈-甲醇-水（50150300）。n衍生化的目的是確證樣品中是否含有AFTB1n二、免疫親和層析二、免疫親和層析-

22、高效液相色譜法高效液相色譜法n原理：試樣用甲醇-水提取后，用免疫親和層免疫親和層析柱析柱凈化，以水或含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗柱除去雜質(zhì)，再用甲醇洗脫交聯(lián)在柱上的黃曲霉毒素，洗脫液經(jīng)高效液相色譜分離，柱后衍生后，熒光檢測(cè)器檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量2.5 微柱篩選法微柱篩選法n原理：樣品經(jīng)提取后通過裝有氧化鋁、硅鎂吸附劑的微柱管，AFT被吸附后在365nm下顯示藍(lán)紫色光環(huán)，其熒光強(qiáng)度與AFT在一定濃度范圍成正比。n樣品處理：磨細(xì)混勻樣品用甲醇水振蕩提取過濾，再加三氯甲烷反萃取，無水硫酸鈉脫水即樣品提取液。n測(cè)定方法：三支管中分別加入樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和三氯甲烷。加展開劑（19）后照射。若出現(xiàn)微黃色熒光環(huán)

23、，則未檢出AFT，若出現(xiàn)藍(lán)紫色熒光則進(jìn)一步分析。n方法說明：所測(cè)結(jié)果為AFT總含量；吸附劑應(yīng)活化；柱管要保持垂直；洗脫廢液要密閉。 由于AFT是一劇毒且強(qiáng)致癌性物質(zhì)，使用時(shí)應(yīng)特別小心應(yīng)按以下規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)后的清洗消毒工作。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)戴口罩；配標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)戴手術(shù)手套。若衣服被污染，需用5次氯酸鈉溶液浸泡15 30分鐘再用清水洗凈。對(duì)于剩余的AFT標(biāo)液或陽性樣液，應(yīng)先用5次氯酸鈉處理后方可倒到指定的地方。 實(shí)驗(yàn)中所用的或被污染的玻璃器皿需經(jīng)實(shí)驗(yàn)中所用的或被污染的玻璃器皿需經(jīng)5次氯次氯酸鈉溶液浸泡酸鈉溶液浸泡5分鐘再清洗之。分鐘再清洗之。 實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)用實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)用5次氯酸鈉清洗消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)等。次氯

24、酸鈉清洗消毒實(shí)驗(yàn)臺(tái)等。 萬一皮膚被污染，可用次氯酸鈉溶液搓洗，再萬一皮膚被污染，可用次氯酸鈉溶液搓洗，再用肥皂水洗凈。用肥皂水洗凈。第三節(jié)第三節(jié) 赭曲霉毒素赭曲霉毒素A的檢驗(yàn)的檢驗(yàn)n3.1 概述概述n3.2 薄層色譜法薄層色譜法3.1 概述概述n理化性質(zhì)：赭曲霉毒素（ochratoxin）是由曲霉菌和青霉屬的幾個(gè)種屬產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。基本結(jié)構(gòu)是異香豆素連接到-苯丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D四種化合物。其中赭曲霉毒素A （OTA）最重要。nOTB沒有氯元素，OTC是A的乙酯，OTD是4-羥基A。nOTA酸性條件下溶于苯、三氯甲烷和稀碳酸氫鈉溶液，加堿成鹽，其鹽溶于水。n主要來源：寒冷條件

25、下由純綠青霉產(chǎn)生，溫暖氣候下由赭曲霉產(chǎn)生。谷物、大豆和香辛料，特別是紅辣椒易受污染。動(dòng)物飼料優(yōu)甚。n與人體健康關(guān)系：存在于動(dòng)物的腎、肝、肌肉和血液中，豬是最敏感的動(dòng)物，腎是主要靶器官。1956年巴爾干地方性腎病。特定的癌癥基因變異，p53 龍膽瀉肝湯（丸），原藥方以木通入藥，至1983年因木通資源短缺，中國(guó)大陸地方標(biāo)準(zhǔn)便以關(guān)木通代替木通。關(guān)木通是馬兜鈴科草藥，含馬兜鈴酸，2003年底 。n衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：食品中沒有限量標(biāo)準(zhǔn)。n分析方法：薄層色譜法、HPLC、ELISA。3.2 薄層色譜法薄層色譜法n原理：用三氯甲烷-磷酸（0.1mol/L）或石油醚-甲醇/水提取樣品中OTA，凈化濃縮后薄板展開，根據(jù)

26、樣品在紫外光燈下，OTA標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相應(yīng)處產(chǎn)生黃綠色熒光的強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)比較確定含量。n樣品處理：樣品用三氯甲烷和0.1mol/L磷酸提取，OTA在酸性條件下進(jìn)入有機(jī)相，過濾加碳酸氫鈉溶液堿化，OTA進(jìn)入水相分離后碳酸氫鈉水層用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH2-3，用三氯甲烷振搖提取分層后，揮干三氯甲烷加入苯-乙腈（982）溶解殘?jiān)?，供TLC用。n測(cè)定方法：滴加標(biāo)準(zhǔn)、樣品、樣品標(biāo)準(zhǔn)三個(gè)點(diǎn)。先用橫展劑乙醚或乙醚-甲醇-水（9451），將薄層板縱展2-3cm，此時(shí)OTA不動(dòng)而雜質(zhì)向前移動(dòng)。取出揮干，再將該薄層板靠近標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長(zhǎng)邊置于同一展開槽內(nèi)的溶劑進(jìn)行橫展，使雜質(zhì)偏離點(diǎn)樣點(diǎn)，與OTA 分離，避免了雜質(zhì)熒光的干擾。然后

27、將經(jīng)橫展后的薄層板縱展，縱展劑為甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（631.20.06）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（631.4），苯-冰乙酸（91）。365nm下紫外觀察，若與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)處有熒光點(diǎn)則估計(jì)稀釋倍數(shù)，再點(diǎn)樣。同時(shí)做確證實(shí)驗(yàn)。n確證實(shí)驗(yàn)：用碳酸氫鈉乙醇溶液噴灑薄層色譜板，干燥于長(zhǎng)波紫外燈下觀察，這時(shí)OTA熒光點(diǎn)應(yīng)由黃綠色變?yōu)樗{(lán)色，而且熒光強(qiáng)度有所增加。n方法說明：點(diǎn)樣量若超過了硅膠的吸附能力，原點(diǎn)上的雜質(zhì)和殘留的溶劑在橫展中可將OTA點(diǎn)橫向拉長(zhǎng)，可根據(jù)熒光強(qiáng)度于標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，估計(jì)減少的加樣體積或所需稀釋的倍數(shù)；OTA標(biāo)準(zhǔn)液應(yīng)用黑紙遮光；最低檢出限為10ppb。第四節(jié)第四節(jié) 展青霉素的檢驗(yàn)展青霉素的檢驗(yàn)n4

28、.1 概述概述n4.2 雙向薄層掃描測(cè)定法雙向薄層掃描測(cè)定法4.1概述概述n理化性質(zhì)：展青霉素（patulin）為無色結(jié)晶，70-100可升華，分子式C7H6O4，溶于水和乙醇。在堿性溶液中很不穩(wěn)定，酸性溶液中較穩(wěn)定，耐熱。n展青霉素（展青霉素（Patulin, Pat)n n OH n結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) On O O展青霉素（展青霉素（Patulin, Pat)毒性毒性n3. 毒性作用 (1) 急性和亞急性毒性n嚙齒類動(dòng)物的急性毒性中毒：痙攣、肺出血、皮下組織水腫、無尿，死亡。 (2) 致癌、致畸和致突變性n皮下注射部位引起雄性大白鼠發(fā)生局部肉瘤，經(jīng)口服的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)致癌現(xiàn)象。Pat對(duì)大鼠和小鼠沒有

29、致畸作用，但對(duì)雞胚有明顯的致畸作用。展青霉素（展青霉素（Patulin, Pat)毒性毒性(3) 細(xì)胞毒性：Pat能改變細(xì)胞膜的通透性，更利于K+外流。(4) 對(duì)免疫系統(tǒng)的影響：亞致死劑量的Pat對(duì)小鼠和兔的免疫系統(tǒng)均有影響，Pat的免疫抑制作用是可逆的而且Pat對(duì)免疫球蛋白水平 的影響具有時(shí)間依賴性。展青霉素的污染展青霉素的污染 食品中的主要來源：是由蕁麻青素、擴(kuò)張青素和棒曲霉等霉菌代謝產(chǎn)生的，存在于腐爛水果及果汁制品中。品品 種種指標(biāo)指標(biāo)(g/Kg )半成品（原汁、原醬）半成品（原汁、原醬） 100原汁、果醬原汁、果醬 50果酒果酒 50罐頭罐頭 50山楂條（餅）山楂條（餅） 50 蘋果和

30、山楂制品中展青霉素限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)蘋果和山楂制品中展青霉素限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)4.2 雙向薄層掃描測(cè)定法雙向薄層掃描測(cè)定法n原理：用乙酸乙酯提取果汁，用1.5碳酸鈉凈化樣品。經(jīng)雙向薄層展開分離后，用薄層掃描儀進(jìn)行紫外反射光掃描定量。n樣品處理：鮮果、果醬加適量無水硫酸鈉研磨吸收多余水分，加乙酸乙酯震蕩提取過濾，濾液加稀碳酸鈉振搖去雜質(zhì)，乙酸乙酯在水浴上真空減壓濃縮近干，用少許三氯甲烷定容供TLC用。果汁、果酒直接提取。n測(cè)定：在薄板上滴加標(biāo)準(zhǔn)液、樣品液。在樣品點(diǎn)同一垂直線上距頂端2cm處點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)液，作為位置參考點(diǎn)。先用橫展劑三氯甲烷-丙酮橫向展開后再用甲苯-乙酸乙酯-甲酸縱向展開，254nm下觀察，若在Rf

31、 0.35處有黑色斑點(diǎn)需做確證實(shí)驗(yàn)。將薄板噴3-甲基，2-苯并噻唑酮腙鹽酸溶液，135烘烤15min，360nm下觀察，呈橙黃色斑點(diǎn)即可確認(rèn)。稀釋后點(diǎn)樣使其在線性范圍內(nèi)，雙向展開后進(jìn)行掃描定量。n最低檢出限3g/L。圖3.9 -(1,3)-D-葡聚糖水解產(chǎn)物的層析水解產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖溶液對(duì)照進(jìn)行薄板層析，展開劑為正丁醇：無水乙醇 （ 酸 ） ： 水 4:1:5（V/V，上層液），以苯胺鄰苯二甲酸為顯色劑，得到右圖。鐮刀菌毒素鐮刀菌毒素n1. 單端孢霉烯族類單端孢霉烯族類 （T-2毒素、脫氧雪腐鐮孢菌烯醇等）毒素、脫氧雪腐鐮孢菌烯醇等）n2. 玉米赤霉烯酮類玉米赤霉烯酮類n3.

32、 丁烯酸內(nèi)酯丁烯酸內(nèi)酯n4. 串珠鐮刀菌素串珠鐮刀菌素 單端孢霉烯族化合物單端孢霉烯族化合物1）主要產(chǎn)毒菌株：鐮刀菌屬）主要產(chǎn)毒菌株：鐮刀菌屬 2）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)基本結(jié)構(gòu)：倍半萜烯基本結(jié)構(gòu)：倍半萜烯 毒性化學(xué)結(jié)構(gòu)：毒性化學(xué)結(jié)構(gòu)：C12，C13環(huán)氧基環(huán)氧基3）性質(zhì)：穩(wěn)定、烹調(diào)過程不易破壞）性質(zhì)：穩(wěn)定、烹調(diào)過程不易破壞 堿性條件下次氯酸鈉可使之失去毒性。堿性條件下次氯酸鈉可使之失去毒性。 單端孢霉烯族化合物種類與毒性單端孢霉烯族化合物種類與毒性種類：種類：40余種余種毒性作用：毒性作用： 共同特點(diǎn)表現(xiàn)為較強(qiáng)的共同特點(diǎn)表現(xiàn)為較強(qiáng)的細(xì)胞毒性細(xì)胞毒性、免疫抑制、免疫抑制及致畸作用，部分有較弱的致

33、癌性，及致畸作用，部分有較弱的致癌性， 急性毒性急性毒性強(qiáng)強(qiáng)，可致人與動(dòng)物的嘔吐。，可致人與動(dòng)物的嘔吐。第五節(jié)第五節(jié) 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的檢驗(yàn)的檢驗(yàn)n5.1 概述概述n5.2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的薄層色譜測(cè)定法脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的薄層色譜測(cè)定法n5.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法n5.4 薄層色譜法（同時(shí)測(cè)定）薄層色譜法（同時(shí)測(cè)定）5.1概述概述n理化性質(zhì)：鐮刀菌屬產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物主要是單端孢霉素類，只含有C、H、O三種元素。谷物種天然污染的有A、B兩型，12、13碳原子上形成的環(huán)氧基可能為毒性的化學(xué)基礎(chǔ)。n脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（de

34、oxynivalenol，DON）和雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，NIV）屬B型結(jié)構(gòu)式，DON的結(jié)構(gòu)式中R1為-OH，R2為-H，R3、R4為-OH。分子式為C15H20O6，NIV分子式為C15H20O7，溶于甲醇、乙醇和水。n主要來源：主要是雪腐鐮刀菌污染谷物和飼料的代謝產(chǎn)物。n毒性與危害：主要為細(xì)胞毒性、免疫抑制和致畸、致癌。人中毒后易嘔吐，又稱嘔吐毒素（vomitoxin）。 NIV在急性毒性、皮膚毒性、細(xì)胞毒性和其他生物作用方面均比DON強(qiáng)。n衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：我國(guó)建議人食用谷物中DON 1mg/kg。n分析方法：我國(guó)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)為TLC和免疫測(cè)定法，其他有GC、HPLC和微柱法。品種指標(biāo)

35、(g/Kg )小麥小麥 1000面粉面粉 1000玉米玉米 1000玉米粉玉米粉 1000小麥、面粉、玉米及玉米粉中小麥、面粉、玉米及玉米粉中 DON 限量標(biāo)準(zhǔn)限量標(biāo)準(zhǔn)5.2 免疫親和層析凈化免疫親和層析凈化-高效液相色譜法高效液相色譜法n原理：樣品中的DON經(jīng)聚乙二醇提取后，濾液過免疫親和層析柱凈化，用高效液相色譜紫外檢測(cè)器檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。5.3 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的薄層色譜測(cè)定法脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的薄層色譜測(cè)定法n原理：谷物及其制品中的DON經(jīng)提取、凈化、濃縮后經(jīng)硅膠展開，加熱薄板。由于有三氯化鋁因此在365nm紫外光下顯藍(lán)色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。n樣品處理：提取，準(zhǔn)確稱取粉碎樣品加三氯

36、甲烷-無水乙醇（82）提取，過濾后水浴揮干；凈化，石油醚溶解殘?jiān)D(zhuǎn)入分液漏斗再用甲醇-水（41）分次洗滌，轉(zhuǎn)入同一漏斗振搖，DON留在甲醇-水層，油脂進(jìn)入石油醚層，將甲醇-水層加入裝有氧化鋁和活性炭的層析柱再用甲醇-水（41）洗脫；濃縮，洗脫液水浴揮干趁熱加入乙酸乙酯加熱至沸騰，將殘?jiān)蠨ON溶出，冷卻后轉(zhuǎn)入濃縮瓶濃縮定容。n測(cè)定方法：在硅膠板上點(diǎn)樣液，同時(shí)在板上端與樣品點(diǎn)相對(duì)位置上點(diǎn)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)作為定位參考，用乙醚-丙酮（955）或無水乙醚橫展使DON偏離原點(diǎn)，揮干后再點(diǎn)上2個(gè)等量標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，其中一個(gè)加上樣液。用縱展開劑三氯甲烷-丙酮-異丙醇（811）或三氯甲烷-丙酮-異丙醇-水（7510151）

37、展開。晾干后365nm下觀察，干擾點(diǎn)顯藍(lán)紫色熒光DON無熒光。將薄板130加熱后冷卻，再觀察，DON和干擾點(diǎn)均有熒光且斑點(diǎn)明顯分開。n橫展后DON移動(dòng)0.7-1.0cm。5.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法n原理：將已知抗原吸附在酶標(biāo)微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗體與待測(cè)樣品提取液的混合液，競(jìng)爭(zhēng)孵育后，在固相載體表面形成抗原抗體復(fù)合物，消除多余抗體成分，然后加入酶標(biāo)記的第二抗體，與吸附在固體表面的抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和樣品的吸光度值，計(jì)算樣品中的抗原含量。n樣品處理：同5.2，濃縮瓶95水浴揮干，用pH7

38、.4含20甲醇的碳酸鹽緩沖液定容，供檢測(cè)。n測(cè)定方法：同2.3，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm下測(cè)A值。5.5 薄層色譜法（同時(shí)測(cè)定）薄層色譜法（同時(shí)測(cè)定）n原理：同5.3n樣品處理：提取，準(zhǔn)確稱取粉碎樣品用甲醇-水（964）提取2次過濾。加石油醚洗滌取甲醇-水層，水浴濃縮；凈化，濃縮液加水稀釋后加入XAD-4樹脂，蒸餾水淋洗，用甲醇分次洗提毒素，水浴揮干用甲醇溶解n測(cè)定方法：取2塊板同5.2處理。DON用乙醚橫展NIV用三氯甲烷-丙酮-異丙醇-水（42.53.50.6）橫展。再分別用三氯甲烷-丙酮-異丙醇（811）展開DON，用三氯甲烷-丙酮-異丙醇-水（32.54.51.2）展開NIV。第六節(jié)第

39、六節(jié) T-2毒素的檢驗(yàn)毒素的檢驗(yàn)n6.1 概述概述n6.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（間接法）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（間接法）6.1 概述概述n理化性質(zhì)：T-2毒素（T-2 toxin）屬單端孢霉烯族化合物中的A型化合物，難溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯。 T-2毒素的三甲硅衍生物具有強(qiáng)的特征質(zhì)量碎片，可采用GC-質(zhì)譜聯(lián)用。n主要來源：三線鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌代謝產(chǎn)物。小麥、玉米、大麥和燕麥等。n毒性與危害：嚴(yán)重可引起死亡。n衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：我國(guó)小麥、玉米及制品低于1000ppb。n分析方法：ELISA、TLC、GC等。T-2毒素毒素6.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（間接法）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（間接法）n原

40、理：同2.3或5.3n樣品處理：同5.3n測(cè)定：同5.3第七節(jié)第七節(jié) 玉米赤霉烯酮的玉米赤霉烯酮的檢驗(yàn)檢驗(yàn)n7.1 概述概述n7.2 分析方法分析方法7.1 概述概述n理化性質(zhì)：玉米赤霉烯酮（zearalenone ，ZEN），又稱F-2毒素，ZEN白色結(jié)晶，溶于堿性水溶液、乙醚、苯、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈，不溶于水、二硫化碳，短波紫外光下呈綠色熒光。對(duì)熱穩(wěn)定。n毒性與危害：類雌激素有毒物質(zhì)。n衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：我國(guó)未制定。n分析方法：TLC、GC、ELISA、HPLC等。n主要來源：鐮刀菌，污染玉米、小麥、大麥、燕麥、小 米、芝麻、干草和青貯飼料等。7.2 免疫親和層析凈化免疫親和層析凈化-高效液相色譜