微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)備課筆記發(fā)

1、實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的使用及微生物大小測(cè)定的方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。2、復(fù)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的功能和使用方法。3、學(xué)習(xí)并掌握用測(cè)微尺測(cè)定微生物大小的方法。4、增強(qiáng)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識(shí)。二、基本原理現(xiàn)代普通光學(xué)顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來(lái)放大成像，它們由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。物鏡的性能最為關(guān)鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。其中油鏡的放大倍數(shù)最大，對(duì)微生物學(xué)最為重要。微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類(lèi)鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測(cè)定，需要在顯微鏡下，借助于特殊的測(cè)量工具測(cè)微尺，包括目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺。其中鏡臺(tái)測(cè)微尺并不直接用

2、來(lái)測(cè)量細(xì)胞大小 ，而是用于校正目鏡測(cè)微尺每格的相對(duì)長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺每小格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度因顯微鏡的不同放大倍數(shù)而異，因此用目鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物大小時(shí)，必須先用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正，以求出該顯微鏡在一定放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每小格所代表的相對(duì)長(zhǎng)度，然后根據(jù)微生物細(xì)胞相當(dāng)于目鏡測(cè)微格數(shù)，即可計(jì)算出細(xì)胞的實(shí)際大小。三、實(shí)驗(yàn)器材及藥品大腸桿菌、金黃葡萄球菌、放線(xiàn)菌、曲霉等微生物染色標(biāo)本；香柏油，二甲苯，目鏡測(cè)微尺，鏡臺(tái)測(cè)微尺，顯微鏡，擦鏡紙等。四、操作步驟與方法(一)顯微鏡的使用(參見(jiàn)P17)1、觀察前的準(zhǔn)備(略)2、顯微觀察一般地，進(jìn)行顯微觀察時(shí)應(yīng)遵守從低倍鏡到高倍鏡再到油鏡的觀察程序，因?yàn)榈捅剁R視野

3、相對(duì)大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)及確定檢查的位置。1)低倍鏡觀察 2)高倍鏡觀察3)油鏡觀察 (二)微生物大小的測(cè)定1、裝目鏡測(cè)微尺(由教師操作并演示)2、校正目鏡測(cè)微尺1)放鏡臺(tái)測(cè)微尺 將鏡臺(tái)測(cè)微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺(tái)上。2)校正 先用低倍鏡觀察，將鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度的部分移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當(dāng)清晰地看到鏡臺(tái)測(cè)微的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測(cè)微尺的刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行。利用移動(dòng)器移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線(xiàn)完全重合，然后數(shù)出兩重合線(xiàn)之間鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺所占的格數(shù)。用同樣的方法換成高倍鏡和油鏡進(jìn)行校正，分別測(cè)出在高倍鏡和油鏡下，兩重合線(xiàn)之間兩尺分別所占的格數(shù)。3)計(jì)算 根據(jù)下列公式可計(jì)算

4、出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度 兩重合線(xiàn)間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)10目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度= 兩重合線(xiàn)間目鏡測(cè)微尺格數(shù)3、菌體大小測(cè)定取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上細(xì)菌染色制片，先用低倍鏡和高倍鏡找到標(biāo)本后，換油鏡測(cè)定金黃葡萄球菌的直徑和大腸桿菌的寬度和長(zhǎng)度各占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，最后再乘上該放大倍數(shù)下目鏡測(cè)微尺每格所代表的長(zhǎng)度，即為該菌的實(shí)際大小。4、測(cè)量完畢 取出目鏡測(cè)微尺后，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微尺分別用擦鏡紙擦拭干凈，放回盒內(nèi)保存。五、原始數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)處理1、原始數(shù)據(jù)記錄：包括微生物形態(tài)觀察和微生物個(gè)體的大小測(cè)定兩部分。每位同學(xué)觀察3種微生物染色標(biāo)本，其中大腸桿菌和金黃葡

5、萄球菌染色標(biāo)本必看，其它一種在青霉、曲霉、放線(xiàn)菌和酵母菌中任意選擇。每位同學(xué)均測(cè)定大腸桿菌和金黃葡萄球菌2種染色標(biāo)本中的微生物個(gè)體大小。記錄你所選擇的哪3種微生物染色標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)觀察的和大小測(cè)定的。2、數(shù)據(jù)處理：1) 形態(tài)觀察：要按從搜物鏡低倍鏡高倍鏡油鏡的順序畫(huà)圖描述(注意比例)觀察到的微生物群體或個(gè)體形態(tài)。2) 大小測(cè)定：A、將目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果埴入下表接物鏡接物鏡倍數(shù)目鏡測(cè)微尺格數(shù)鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度/um低倍鏡高倍鏡油鏡1040100接目鏡放大倍數(shù)： B、將各菌測(cè)定結(jié)果填入下表(單位：/m)微生物名稱(chēng)目鏡測(cè)微尺每格代表的長(zhǎng)度/um寬長(zhǎng)菌體大小范圍/um目鏡測(cè)微尺格數(shù)寬

6、度/um目鏡測(cè)微尺格數(shù)長(zhǎng)度/um大腸桿菌金黃色葡萄球菌六、思考題1、用油鏡觀察時(shí)應(yīng)注意哪些問(wèn)題？在載玻片和鏡頭之間加滴什么油？起什么作用？2、影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？3、為什么要換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)測(cè)微尺重新對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行校正？4、在不改變目鏡和目鏡測(cè)微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來(lái)測(cè)定同一微生物的大小時(shí)，其測(cè)定的結(jié)果是否相同？為什么？實(shí)驗(yàn)二顯微鏡直接計(jì)數(shù)法一、目的要求1、明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理。2、掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。二、基本原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱(chēng)計(jì)菌器），其優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速

7、、操作簡(jiǎn)單。目前國(guó)內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器及Hawksley計(jì)菌器等。利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法是將單細(xì)胞微生物的懸液或孢子懸液，注入血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中。在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)的，由于加蓋蓋玻片之后的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室的容積是一定的（0.1mm3，萬(wàn)分之一毫升），所以可根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目，包括死菌和活菌。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：釀酒酵母菌懸液2、儀器或其他用具：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無(wú)菌毛細(xì)滴管。四、操作步驟1、菌懸液制備以無(wú)菌生理鹽水將釀酒酵

8、母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?、鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。3、加樣品將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無(wú)菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿(mǎn)菌液。 取樣時(shí)要小心搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。4、顯微鏡計(jì)數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線(xiàn)的強(qiáng)弱適當(dāng)。一般地，在使用低倍物鏡時(shí)，應(yīng)盡量調(diào)弱光線(xiàn)，使視野變暗；使用高倍物鏡時(shí)，再將光線(xiàn)調(diào)亮些，但也應(yīng)盡量保證能看清視野中

9、計(jì)數(shù)板上的縱、橫格線(xiàn)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，則需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)，一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有510個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線(xiàn)上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線(xiàn)上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算樣品的含菌量。5、清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板使用完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行涼干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體后其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。五、原始數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)處理1、原始數(shù)據(jù)記

10、錄：每個(gè)班用同一濃度的酵母菌濃懸液，使用時(shí)由同學(xué)根據(jù)需要自行稀釋?zhuān)⒋_定稀釋倍數(shù)B值。每個(gè)同學(xué)計(jì)二個(gè)室（即1個(gè)計(jì)數(shù)板），每個(gè)室選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格這5個(gè)中格中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，讀出每個(gè)中格的16個(gè)小格中的菌體數(shù)（510），并將原始數(shù)據(jù)記錄下來(lái)。2、數(shù)據(jù)處理：將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個(gè)中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml12345第一室第二室每組同學(xué)可將各自測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并寫(xiě)在一個(gè)表格中，最后結(jié)果則為四個(gè)室的平均值。只需計(jì)算一次，不要分別計(jì)算二個(gè)室的平均值后再求平均值。六、思考題根據(jù)你的體會(huì)，說(shuō)明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來(lái)自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少

11、誤差，力求準(zhǔn)確？實(shí)驗(yàn)三微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用器皿的清洗、包裝與干熱滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的器皿和工具的種類(lèi)、要求和應(yīng)用。2、掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用的玻璃器皿的清洗及包裝方法。3、了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。4、掌握干熱滅菌的操作技術(shù)。二、基本原理微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的器皿，大多要進(jìn)行消毒、滅菌和用來(lái)培養(yǎng)微生物，因此對(duì)其質(zhì)量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。玻璃器皿的形狀和包裝方法要求能防止污染雜菌為準(zhǔn)；玻璃器皿的洗滌方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、器皿的種類(lèi)、所盛的物品、洗滌劑的類(lèi)別和沾污程度等的不同而有所不同。清洗后的玻璃器皿、經(jīng)包裝后即可進(jìn)行干熱滅菌。干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種（P

12、59）?；鹧鏌茰缇m用于載玻片、試管口、玻棒、接種工具和金屬用具如鑷子等的滅菌。通常所說(shuō)的干熱滅菌是在電烘箱內(nèi)利用高溫干燥空氣使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。而細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固變?cè)娇?，反之反之。與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160170），時(shí)間長(zhǎng)（1-2h）.但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品、衣物等不能用干熱滅菌。三、實(shí)驗(yàn)器材微生物實(shí)驗(yàn)室常用的器皿、接種工具、電熱鼓風(fēng)干燥箱等四、操作

13、步驟1、微生物實(shí)驗(yàn)室常用的器皿簡(jiǎn)介（P26）試管、吸管、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、載玻片、蓋玻片、雙層瓶、滴瓶、接種工具等。2、微生物實(shí)驗(yàn)室常用的器皿清洗方法（P6）1）新玻璃器皿的洗滌方法（P6）；2）使用過(guò)的玻璃器皿的洗滌方法（P6）。3、空玻璃器皿的包裝（P78）1）培養(yǎng)皿的包裝；2）吸管的包裝；3）試管和三角燒瓶的包裝注意：做棉塞的方法（P5354）4、包裝過(guò)的玻璃器皿的干熱滅菌方法（P62-63）裝入待滅菌物品；升溫；恒溫；降溫；開(kāi)箱取物；無(wú)菌檢查。五、原始數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)處理1、原始數(shù)據(jù)記錄領(lǐng)用了哪些玻璃器皿、清洗了哪些玻璃器皿、包裝了哪些玻璃器皿。2、數(shù)據(jù)處理清洗效果、老師評(píng)價(jià)；包裝效果、

14、老師評(píng)價(jià)；干熱滅菌條件及結(jié)果。六、思考題（P63）1、 為什么在吸管的包裝時(shí)要在其粗端吸管口塞上一小段棉花？2、 在干熱滅菌操作過(guò)程中應(yīng)注意哪些問(wèn)題，為什么？3、 為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需要的溫度高，時(shí)間長(zhǎng)？實(shí)驗(yàn)四 培養(yǎng)基的制備及高壓蒸汽滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 明確培養(yǎng)基配制原理2、 通過(guò)對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。3、 了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍4、 學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法二、基本原理牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時(shí)又稱(chēng)為普通培養(yǎng)基。其配方為：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，水 1000ml，pH 7.47

15、.6。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供無(wú)機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時(shí)還要加入一定量的瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96時(shí)溶化，一般實(shí)際應(yīng)用時(shí)在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40時(shí)凝固，通常不被微生物分解利用。任何一種培養(yǎng)基，一經(jīng)制成就應(yīng)及時(shí)徹底滅菌，以備培養(yǎng)微生物使用，一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌法。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能逸出，滅菌鍋內(nèi)的壓力增加，使沸點(diǎn)增高

16、，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。三、實(shí)驗(yàn)器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂；1mol/L NaOH, 1mol/L HCl;試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.59.0）培養(yǎng)基分裝器，棉花，紗布，棉繩，牛皮紙，報(bào)紙，記號(hào)筆，試管架，剪刀等。四、操作步驟1、稱(chēng)量按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱(chēng)取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶化后倒入燒杯。蛋白胨很易吸潮，在稱(chēng)取時(shí)動(dòng)作要迅速。稱(chēng)藥品用的牛角匙不要混用，稱(chēng)完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。2、溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的水

17、量，用玻棒攪勻后在石棉網(wǎng)上加熱溶解。將稱(chēng)好的瓊脂放入已溶化的藥品中，再加熱溶化，且不斷攪拌，以防瓊脂糊底使燒杯破裂。最后補(bǔ)足水分到所需的總體積。3、調(diào)pH值在未調(diào)前，先用精密pH試紙測(cè)量培養(yǎng)基的原始pH值，如偏酸加適量NaOH,偏堿加適量HCl，直至達(dá)到要求。注意pH值不要調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4、分裝按要求可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)。5、加塞在試管口或三角燒瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性。6、包扎加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙或二層報(bào)紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。注明

18、培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、配制日期。7、滅菌（1）加水：打開(kāi)滅菌鍋蓋，取出內(nèi)桶，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水位與三角擱架相平為宜。（2）裝入待滅菌物品：放回滅菌桶，并裝入上述培養(yǎng)基，注意不要裝得太緊，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。關(guān)閉滅菌鍋蓋，采用對(duì)角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。（3）排氣：打開(kāi)排氣口（放氣閥）。用電加熱，待水煮沸后排除鍋內(nèi)的冷空氣，當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí)，維持5分鐘，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈，關(guān)上排氣閥。（4）升壓、保壓和降壓：關(guān)閉排所閥后，鍋內(nèi)壓力開(kāi)始上升。當(dāng)壓力升到所需壓力（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在12120分鐘）時(shí)，控制熱源，維持壓力到所需時(shí)間后，停止加熱，待

19、壓力降至接近”0”時(shí)，打開(kāi)排氣閥排氣。注意不能過(guò)急地排氣，否則會(huì)由于鍋內(nèi)壓力突然下降而造成鍋內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，和使棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。（5）無(wú)菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)2448小時(shí)，經(jīng)檢查無(wú)菌生長(zhǎng)，可保存?zhèn)溆谩Ｎ?、原始?shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)處理1、原始數(shù)據(jù)記錄記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱(chēng)、配方及數(shù)量。記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力等）。2、數(shù)據(jù)處理記錄無(wú)菌檢查結(jié)果。六、思考題1、培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基應(yīng)具備哪些條件？為什么？2、在配制培養(yǎng)基的操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題？3、培養(yǎng)基配制完后，為什么要及時(shí)滅菌？若不能及時(shí)滅菌，應(yīng)如何處理

20、？4、高壓蒸汽滅菌中為什么要把冷空氣排凈，為什么在滅菌后不能驟然快速降壓？實(shí)驗(yàn)五 微生物的無(wú)菌接種技術(shù)及培養(yǎng)特征一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、 學(xué)習(xí)掌握微生物的幾種接種技術(shù)。2、 學(xué)習(xí)掌握倒平板的方法。3、 建立無(wú)菌操作的概念，掌握無(wú)菌操作的基本環(huán)節(jié)。4、 了解不同的微生物在斜面上平板上的生長(zhǎng)特征。二、基本原理將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱(chēng)為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。無(wú)論微生物的分離、培養(yǎng)、純化或鑒定經(jīng)及有關(guān)微生物的形態(tài)觀察及生理研究都必須進(jìn)行接種。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無(wú)菌操作，如操作不慎引起污染，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果就不可靠。影響下一步工作的進(jìn)行。微

21、生物的培養(yǎng)特征是指微生物在固體、半固體和液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)后所表現(xiàn)出的群體生長(zhǎng)特征。不同的微生物有其固有的培養(yǎng)特征，這些特征可以作為不同種類(lèi)微生物的鑒別特征之一，并能為識(shí)別純培養(yǎng)是否被污染作為參考。了解它們的培養(yǎng)特征、掌握其生長(zhǎng)規(guī)律對(duì)識(shí)別、控制和利用微生物具有重要價(jià)值。固體培養(yǎng)基又分平板和斜面兩種形式。在平板上主要觀察菌落表面結(jié)構(gòu)、形態(tài)及邊緣狀況（如P75圖C）斜面上主要觀察菌苔的形態(tài)。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種和培養(yǎng)基菌種：大腸桿菌和金黃葡萄球菌平板培養(yǎng)物培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（已滅菌）2、儀器或其他用具酒精燈（芯）、火柴、標(biāo)簽紙、工業(yè)乙醇、無(wú)菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)（針）、記號(hào)筆、微波爐或加熱裝置（電

22、爐、石棉網(wǎng)和升降臺(tái)）、生化培養(yǎng)箱。四、操作步驟1、寫(xiě)標(biāo)簽（P10）任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)手操作前均需首先將器皿(培養(yǎng)皿或試管)用記號(hào)筆做上記號(hào)，寫(xiě)上班級(jí)、姓名、日期、樣品類(lèi)別及來(lái)源，字盡量小些。寫(xiě)在皿底的一邊，不要寫(xiě)在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。注意：培養(yǎng)皿的記號(hào)一般寫(xiě)在皿底上。如果寫(xiě)在皿蓋上，同時(shí)觀察兩個(gè)以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開(kāi)皿蓋時(shí)容易混淆。2、倒平板（P70）將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基用微波爐或電爐加熱融溶，混合均勻后分別倒平板，每位同學(xué)倒2皿。倒平板的方法：右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角瓶置火焰旁邊用左手將試管賽或瓶賽輕輕地?fù)艹?，試管或瓶口保持?duì)著火焰，然后用右手手撐邊緣或小指夾住管（瓶）塞（若試管內(nèi)

23、或三角瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中）。左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15m L，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即為平板。3、接種1）斜面接種法(參見(jiàn)P76)2）平板接種法(參見(jiàn)P72)A、點(diǎn)燃酒精燈。B、挑菌落：右手持接種針柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒滅菌后，用左手將菌種平板培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)菌種板）將皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，以殺滅可能玷污的微生物。將灼燒的滅菌的接種針伸入菌種板內(nèi)，先接觸無(wú)菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，待冷卻后再?gòu)钠桨迳瞎稳∩僭S菌苔取出。C、接種：1）接種平板：左手迅速放下菌種板，在火焰附近迅速拿起

24、待接種的新鮮平板培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)接種板）。右手中接種環(huán)不能通過(guò)火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種板。用接種針在平板上自平板底部向上端輕輕地作“之”字劃線(xiàn)：先在平板培養(yǎng)基的1/2的一邊做第一次劃線(xiàn)，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，在1/4的一邊做第二次劃線(xiàn)，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，在剩下的1/4的一邊做第三次劃線(xiàn)。（或每次作“平行”劃線(xiàn)3或4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70度，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線(xiàn)部分做第二次平等劃線(xiàn)，再用同樣的方法通過(guò)第二次劃線(xiàn)部分做第三次平等劃線(xiàn)和通過(guò)第三次劃線(xiàn)部分做第四次平等劃線(xiàn)（見(jiàn)P73圖6），此法在實(shí)際操作上不易把握，易出現(xiàn)接種不到微生物的可能，故推薦同學(xué)統(tǒng)一劃“之”字形）接種完畢，接種針應(yīng)

25、通過(guò)火焰抽出平板，并迅速蓋上皿蓋。再重新仔細(xì)灼燒接種針后，放回原處。將接種板放入培養(yǎng)箱中置于37 培養(yǎng)24-48小時(shí)。注意：為了盡可能多地得到單個(gè)菌落，在挑菌落時(shí)一定要盡量少挑，同時(shí)在劃線(xiàn)時(shí)要盡量劃得長(zhǎng)些、多些。每次轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿時(shí)都要在火焰附近，且不要將接種針拿出培養(yǎng)皿外。2）接種斜面：左手迅速放下菌種板，在火焰附近迅速拿起待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)接種管）并松開(kāi)管帽或拔下棉塞，注意保持斜面向上并使管口略向下傾斜。右手中接種環(huán)不能通過(guò)火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管中。用環(huán)在斜面上自試管底部向上端輕輕地劃一直線(xiàn)。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過(guò)火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞（或蓋上管帽）。再重新仔細(xì)灼燒接種

26、環(huán)后，放回原處。將接種管放入試管架后置于37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。注意：所劃直線(xiàn)盡可能的直，切莫?jiǎng)潕讞l線(xiàn)或蛇形，不要將培養(yǎng)基劃破，也不要使接種環(huán)接觸管壁或管口。3）液體接種法（略講，學(xué)生不做）4）穿刺接種法（略講，學(xué)生不做）4、培養(yǎng)與觀察將上述已接種的平板和斜面放置于37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-2d后取出對(duì)照P75細(xì)菌的培養(yǎng)特征圖進(jìn)行觀察。五、原始數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)處理1、原始數(shù)據(jù)記錄：所接種的兩種微生物：大腸桿菌和金黃葡萄球菌的平板培養(yǎng)物。每位學(xué)生的接種要求：兩種微生物各接種一皿。2、數(shù)據(jù)處理：平板上樣品名稱(chēng)菌落特 征 描 寫(xiě)大小形態(tài)干濕高度透明度顏色邊緣大腸桿菌12金黃色葡萄球菌12在斜面上樣品名稱(chēng)菌苔特

27、征 描 寫(xiě)形態(tài)透明度顏色大腸桿菌12金黃色葡萄球菌12六、思考題1、 用斜面檢測(cè)微生物的培養(yǎng)特征接種時(shí)，為什么不要?jiǎng)澏鄺l線(xiàn)或蛇形，而只要?jiǎng)澮粭l直線(xiàn)？2、 接種環(huán)(針)接種前后灼燒的目的是什么？為什么在接種前一定要將其冷卻？如何判斷燒過(guò)的接種環(huán)已冷卻？3、 試述如何在操作中貫徹?zé)o菌操作的原則？實(shí)驗(yàn)六革蘭氏染色法一、目的要求1、學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法。2、了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類(lèi)鑒定中的重要性。二、基本原理革蘭氏染色將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性，是由這兩類(lèi)細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類(lèi)脂質(zhì)量低，用乙醇脫色時(shí)細(xì)胞壁脫

28、水，使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性不同，由于細(xì)胞壁肽聚糖層較薄，類(lèi)脂含量高。所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類(lèi)脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫碘的復(fù)合物比較容易被洗脫，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌重要的鑒別特征，為保證染色結(jié)果的正確性，采用規(guī)范的染色方法是十分重要的。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：大腸桿菌約24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌約24h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2、試劑：革蘭氏染色液，95%的乙醇，滅菌蒸餾水（生理鹽水）3、儀器或其他用具酒精燈（芯）、火柴、接種

29、環(huán)（針）、圓頭鑷子、滴管、記號(hào)筆、載玻片、吸水紙、洗瓶、顯微鏡、香柏油、擦鏡紙、小標(biāo)簽四、操作步驟1、制片（1） 涂片取兩片載玻片，各滴一小滴生理鹽水于玻片中央，用接環(huán)以無(wú)菌操作分別從枯草桿菌和大腸桿菌的斜面上挑取少許菌苔于水滴中混勻并涂成薄膜。若用菌懸液涂片，可用接種環(huán)挑取23環(huán)直接涂于載玻片上。要用活躍生長(zhǎng)期的幼培養(yǎng)物作革蘭氏染色；涂片不宜過(guò)厚，以免脫色不完全造成假陽(yáng)性（2）干燥室溫下自然干燥（3）固定涂面朝上，通過(guò)火焰23次。此操作過(guò)程稱(chēng)熱固定，其目的是使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，病使之牢固附著在載玻片上。熱固定溫度不宜過(guò)高（以玻片背面不燙手為宜），否則會(huì)改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。2、初染

30、滴加結(jié)晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）染色12min，水洗。3、媒染用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。4、脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無(wú)紫色時(shí)，立即水洗。革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，脫色不足，陰性菌被誤染成陽(yáng)性菌，脫色過(guò)度，陽(yáng)性菌被誤染成陰性菌，脫色時(shí)間一般約2030s。5、復(fù)染用番紅液復(fù)染約2min，水洗6、鏡檢干燥后，用油鏡觀察。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽(yáng)性菌，被染成紅色的是革蘭氏陰性菌。7、混合涂片染色按上述方法，在同一載玻片上，以大腸桿菌和蠟樣芽孢桿菌或大腸桿菌和金黃色葡萄菌作

31、混合涂片、染色、鏡檢進(jìn)行比較。五、原始數(shù)據(jù)記錄與數(shù)據(jù)處理1、原始數(shù)據(jù)記錄：進(jìn)行革蘭氏染色的微生物菌種：大腸桿菌和金黃葡萄球菌的新鮮斜面培養(yǎng)物。每組同學(xué)的染色要求：?jiǎn)我晃⑸锶旧突旌衔⑸锶旧饕黄谟顽R下觀察，繪圖并記錄微生物的形態(tài)和顏色。2、數(shù)據(jù)處理：根據(jù)所觀察到的染色結(jié)果，說(shuō)明兩種微生物分別是何種革蘭氏染色反應(yīng)。六、思考題1、你認(rèn)為哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？2、你的染色結(jié)果是否正確？如果不正確，請(qǐng)說(shuō)明原因。3、革蘭氏染色時(shí)，初染前加碘液?jiǎn)?？乙醇脫色后?fù)染之前，革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色？實(shí)驗(yàn)七用菌落計(jì)數(shù)法測(cè)水中細(xì)菌總數(shù)一、目的要求1、

32、學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的方法。2、了解源水的平板菌落計(jì)數(shù)的原則。二、基本原理平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。（平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于其最大的優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以廣泛應(yīng)用于生物制品檢測(cè)，食品、飲料和水等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)）本實(shí)驗(yàn)是用源水的平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌

33、總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類(lèi)繁多，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和其他生長(zhǎng)條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長(zhǎng)繁殖，因此，以一定的培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，計(jì)算出來(lái)的水中細(xì)菌總數(shù)僅是一種近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。三、實(shí)驗(yàn)器材1、水源水（河水），滅菌蒸餾水，工業(yè)酒精。2、培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。 3、儀器或其他用具：酒精燈（芯）、火柴、滅菌的帶玻璃塞的三角瓶，滅菌培養(yǎng)皿，滅菌吸管（10ml,1ml），滅菌試管、試管架、生化培養(yǎng)箱等。四、操作步驟1、水樣的采取水源為鹽城工學(xué)院化工樓西側(cè)河水，采取方法：應(yīng)去距水面1015cm 的深層水樣，先將滅菌的帶塞

34、三角燒瓶瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿(mǎn)后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕?，最好立即檢查，否則需放入冰箱中保存。2、細(xì)菌總數(shù)測(cè)定寫(xiě)標(biāo)簽：每組同學(xué)取6套滅菌培養(yǎng)皿和4個(gè)滅菌試管分別寫(xiě)標(biāo)簽（試管為1組，分別編號(hào)為10-1，10-2，10-3，10-4，培養(yǎng)皿分2組，分別對(duì)應(yīng)編號(hào)為10-2，10-3，10-4）水樣的稀釋與接種 取4個(gè)滅菌試管，分別用10ml的滅菌吸管加入9ml滅菌水。用1號(hào)1ml滅菌吸管取1ml水樣注入第一管9ml滅菌水內(nèi)、搖勻，再用2號(hào)1ml滅菌吸管自第一管取1ml至下一管滅菌水內(nèi)，搖勻，并立即取1ml稀釋水加入空的對(duì)應(yīng)編號(hào)的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做兩個(gè)

35、培養(yǎng)皿。如此稀釋到第三管、第四管（稀釋度分別到0.1、0.01、0.001、0.0001），并接種到對(duì)應(yīng)編號(hào)的滅菌培養(yǎng)皿中，每一稀釋度做兩個(gè)培養(yǎng)皿。稀釋倍數(shù)看水樣渾濁程度而定，以培養(yǎng)后平板的菌落數(shù)在30300個(gè)之間的稀釋度最為合適，若三個(gè)稀釋度的菌數(shù)均多到無(wú)法計(jì)算或少到無(wú)法計(jì)算，則需繼續(xù)稀釋或減少稀釋倍數(shù)。一般中等污穢水樣，取0.1、0.01、0.001三個(gè)連續(xù)稀釋度，污穢嚴(yán)重的取0.01、0.001、0.0001三個(gè)連續(xù)稀釋度（根據(jù)試做實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)取0.1、0.01、0.001這三個(gè)稀釋度為宜）。向每個(gè)培養(yǎng)皿中各傾約15ml已溶化并冷卻至45左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，立即放在桌子上搖勻。

36、凝固后倒置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。3、菌落計(jì)數(shù)方法（1）先計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)。若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長(zhǎng)時(shí)，則不應(yīng)采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，則可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)，然后再計(jì)算該稀釋度的平均菌落數(shù)。（2）首先選擇平均菌落數(shù)在30300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)即為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。（3） 若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30300之間，則兩者菌落總數(shù)之比值來(lái)決定。若其比值小于2，應(yīng)采取兩者的平均數(shù)；若大于2，則去其中較小的菌落總數(shù)。（4）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（5）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。（6）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)（個(gè)/ml）備注0.10.010.00111 3651642016 400或1.6104兩位以后的數(shù)字采取四舍五入的方法去掉22 7602954