第十一講蛋白質(zhì)的分離與純化(二)

1、第十一講第十一講 蛋白質(zhì)的分離與純化蛋白質(zhì)的分離與純化（二）（二）第一節(jié)第一節(jié) 分離純化概述分離純化概述第二節(jié)第二節(jié) 純化前處理純化前處理第三節(jié)第三節(jié) 初級分離初級分離第四節(jié)第四節(jié) 精制分離精制分離色譜技術(shù)色譜技術(shù)第五節(jié)第五節(jié) 分離方案和純度鑒定分離方案和純度鑒定一、問答題（每題一、問答題（每題5 5分共分共3030分）：分）：1.1. 蛋白質(zhì)工程的基本途徑或主要步驟蛋白質(zhì)工程的基本途徑或主要步驟2.2. 什么是構(gòu)型、構(gòu)型，二者的主要差別。什么是構(gòu)型、構(gòu)型，二者的主要差別。3.3. AnfinsenAnfinsen原理及其意義。原理及其意義。4.4. 紫外可見吸收光譜和熒光光譜。紫外可見吸收光

2、譜和熒光光譜。5.5. 什么是核磁共振（什么是核磁共振（NMRNMR）？實現(xiàn)核磁共振的兩種方法是什么？）？實現(xiàn)核磁共振的兩種方法是什么？6.6. 什么是化學位移？什么是化學位移？19701970年年IUPACIUPAC規(guī)定，衡量化學位移的相對標準是什么？規(guī)定，衡量化學位移的相對標準是什么？規(guī)定其化學位移常數(shù)是多少？表示化學位移物理量的符號和單位的符號規(guī)定其化學位移常數(shù)是多少？表示化學位移物理量的符號和單位的符號各是什么？各是什么？蛋白質(zhì)工程期中考試（蛋白質(zhì)工程期中考試（20140514）分析）分析二、簡述題（每題二、簡述題（每題1010分共分共4040分）分）1.1.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、

3、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和三級結(jié)構(gòu)及其主要作用力？它們之間的相互關(guān)系怎樣？主要作用力？它們之間的相互關(guān)系怎樣？2.2.如何理解蛋白質(zhì)工程的含義（狹義和廣義理解），其主線是什么？如何理解蛋白質(zhì)工程的含義（狹義和廣義理解），其主線是什么？3.3.什么是基因突變技術(shù)，包括哪兩大類技術(shù)？舉例說明這兩大類技術(shù)什么是基因突變技術(shù)，包括哪兩大類技術(shù)？舉例說明這兩大類技術(shù)包括哪些方法。包括哪些方法。4.4.預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的方法有哪些？描述一種你熟悉的蛋白質(zhì)高級預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的方法有哪些？描述一種你熟悉的蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預測方法的操作流程。結(jié)構(gòu)預測方法的

4、操作流程。某種微生物合成的蛋白酶與人體消化液中的蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能很相某種微生物合成的蛋白酶與人體消化液中的蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能很相似，但對似，但對熱穩(wěn)定性較差熱穩(wěn)定性較差，進入人體后容易失效，現(xiàn)要將此酶開發(fā)成一，進入人體后容易失效，現(xiàn)要將此酶開發(fā)成一種片劑，臨床治療消化不良，通過蛋白質(zhì)工程手段種片劑，臨床治療消化不良，通過蛋白質(zhì)工程手段能否能否提高蛋白質(zhì)的提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性穩(wěn)定性，請您試設(shè)計兩套改造方案，請您試設(shè)計兩套改造方案，簡述改造方案依據(jù)的原理簡述改造方案依據(jù)的原理。提示和要求：一套方案采用分子生物學修飾，另一套采用化學修飾。提示和要求：一套方案采用分子生物學修飾，另一套采用化學修飾。四

5、、論述題（四、論述題（20分）：分）：論述蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的論述蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的基本程序基本程序以及以及主要方法主要方法和和原理原理。 概述概述 常見色譜技術(shù)介紹常見色譜技術(shù)介紹第四節(jié)第四節(jié) 精制分離精制分離液相色譜技術(shù)液相色譜技術(shù)1、液相色譜（、液相色譜（Liquid chromatography）？）？l利用不同物質(zhì)在利用不同物質(zhì)在固定性和流動相固定性和流動相中的中的分配特性分配特性不同，對物質(zhì)的分離的技不同，對物質(zhì)的分離的技術(shù)。術(shù)。（理解）（理解） 依據(jù)物質(zhì)的依據(jù)物質(zhì)的理化特性理化特性（如：分子大小、形狀、分子極性、電荷等）（如：分子大小、形狀、分子極性、電荷等）不同，不同， 在在

6、固定性固定性和和流動相流動相中的中的分配系數(shù)不同分配系數(shù)不同 流動相為流動相為平推流平推流 流動相流過固定相時，兩相之間流動相流過固定相時，兩相之間分配平衡分配平衡很快很快 不同物質(zhì)的不同物質(zhì)的流動速度流動速度不同不同而實現(xiàn)分離。而實現(xiàn)分離。 又稱為層析（平推流）又稱為層析（平推流）l特點特點（四高）（四高）高效率、高純度、高精度、高自動化程度高效率、高純度、高精度、高自動化程度現(xiàn)代化色譜技術(shù)現(xiàn)代化色譜技術(shù)高效液相色譜高效液相色譜一、概述一、概述 1850年，年，德國化學家德國化學家Runge將古羅馬時期分析將古羅馬時期分析染料與色素染料與色素的方法進行改進的方法進行改進，發(fā)展成為發(fā)展成為紙色

7、譜紙色譜。 1903年，年，俄國植物學家俄國植物學家 Tsweet 在在華沙生物學會議華沙生物學會議上上發(fā)表發(fā)表分離分離植物色素植物色素的論文，的論文， 1906年，年，Tsweet首次首次“色譜法色譜法” 和和“ 色譜圖色譜圖”的的概念。概念?！吧V法色譜法”（Chromotography） “ 色譜圖色譜圖” （Chromatogram） 1941年，年，英國英國生物化學家生物化學家Martin與與英國英國化學家化學家Synge （獲諾貝爾獎）創(chuàng)立（獲諾貝爾獎）創(chuàng)立液液分配色液液分配色譜譜，以水份飽和硅膠為固定相，含乙醇的氯仿為流動相以水份飽和硅膠為固定相，含乙醇的氯仿為流動相分離分離乙酰

8、氨基酸乙酰氨基酸。 1970年中期，年中期，微處理機技術(shù)微處理機技術(shù)用于液相色譜，提高了液相色譜的用于液相色譜，提高了液相色譜的自動化水平和分析自動化水平和分析精度精度。 80年代，年代，色譜聯(lián)用技術(shù)色譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速，逐漸出現(xiàn)了發(fā)展迅速，逐漸出現(xiàn)了色譜色譜光譜光譜聯(lián)用、聯(lián)用、色譜色譜質(zhì)譜質(zhì)譜聯(lián)用、聯(lián)用、二維色譜二維色譜（色譜（色譜色譜）等技術(shù)。色譜）等技術(shù)。 1990年以后，生物工程和生命科學的迅速發(fā)展，為年以后，生物工程和生命科學的迅速發(fā)展，為高效液相色譜高效液相色譜技術(shù)技術(shù)提出提出了更多、了更多、更新的分離、純化、制備的更新的分離、純化、制備的課題課題，促進了促進了高效液相色譜技術(shù)的發(fā)

9、展。高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展。 2、 液相色譜法的發(fā)展液相色譜法的發(fā)展在色譜技術(shù)中，液相色譜（在色譜技術(shù)中，液相色譜（Liquid chromatographyLiquid chromatography）是最早（）是最早（19031903年）發(fā)年）發(fā)明的，但其初期發(fā)展明的，但其初期發(fā)展比較慢比較慢。液相色譜普及之前，液相色譜普及之前，紙色譜紙色譜、氣相色譜氣相色譜和和薄層色譜薄層色譜是是色譜分析色譜分析的主流。的主流。2020thth60S60S，將較為成熟的，將較為成熟的氣相色譜氣相色譜 理論與技術(shù)理論與技術(shù)應用于液相色譜，使液相色譜應用于液相色譜，使液相色譜迅速發(fā)展。迅速發(fā)展。特別是特別是（

10、色譜柱）（色譜柱）制備技術(shù)、制備技術(shù)、技術(shù)技術(shù)和和性能的不斷改進，使性能的不斷改進，使液相色譜分析實現(xiàn)了液相色譜分析實現(xiàn)了高效化和高速化高效化和高速化。19691969年，液相色譜儀年，液相色譜儀商品化商品化。從此，這種分離效率高、分析速度快的液相色。從此，這種分離效率高、分析速度快的液相色譜被稱為譜被稱為高效液相色譜法高效液相色譜法（HPLCHPLC）更加更加 微量、快速、高效、廣泛。微量、快速、高效、廣泛。新進展：新進展：微柱微柱HPLCHPLC、無孔色譜短柱、無孔色譜短柱HPLCHPLC、毛細管、毛細管HPLCHPLC2、液相色譜的發(fā)展、液相色譜的發(fā)展1.吸附層析吸附層析 adsorpt

11、ion chromatography2.分子篩層析分子篩層析 molecular sieve chromatography3.離子交換層析離子交換層析 ion exchange chromatography4.親和層析親和層析 affinity chromatography5.分配色譜分配色譜液液-液色譜液色譜6.疏水色譜疏水色譜疏水作用疏水作用7.等電點聚焦色譜等電點聚焦色譜pI3、液相色譜的類型、液相色譜的類型1 1、吸附分離色譜？、吸附分離色譜？（1 1）概念：）概念：利用利用固相吸附劑固相吸附劑對不同物質(zhì)的對不同物質(zhì)的吸附力吸附力不同，進行物質(zhì)分離的不同，進行物質(zhì)分離的液相色譜技術(shù)液相

12、色譜技術(shù)。（2 2）原理：）原理：通過通過范德華力范德華力，流動相流動相中的分子與固定相（吸附劑）吸附、再解吸附進中的分子與固定相（吸附劑）吸附、再解吸附進入流動相（洗脫劑）。入流動相（洗脫劑）。不同物質(zhì)在不同物質(zhì)在固相固相和和液相液相之間之間分配系數(shù)分配系數(shù)或或解離平衡解離平衡不同。不同。通過連續(xù)的通過連續(xù)的吸附吸附解吸附解吸附再吸附再吸附過程將物質(zhì)分離。過程將物質(zhì)分離。 二、常見色譜介紹二、常見色譜介紹（3）影響因素？）影響因素？吸附劑、溶劑、被分離物質(zhì)的性質(zhì)吸附劑、溶劑、被分離物質(zhì)的性質(zhì)“三方面三方面”l吸附劑：凡能對其它物質(zhì)具有吸附劑：凡能對其它物質(zhì)具有吸附作用吸附作用的固體物質(zhì)。的固

13、體物質(zhì)。l吸附劑選擇原則：吸附劑選擇原則：l根據(jù)：根據(jù)：吸附劑吸附劑性質(zhì)、性質(zhì)、溶劑溶劑的性質(zhì)、被的性質(zhì)、被分離對象分離對象的性質(zhì)的性質(zhì)選擇選擇。l表面積大、顆粒均勻、表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性吸附選擇性好、穩(wěn)定性強、成本低廉。好、穩(wěn)定性強、成本低廉。l如何理解如何理解選擇原則？（三者之間相互影響關(guān)系）：選擇原則？（三者之間相互影響關(guān)系）：l極性強極性強的吸附劑易吸附的吸附劑易吸附極性強極性強的物質(zhì)，的物質(zhì)，非極性強非極性強的吸附劑易吸附的吸附劑易吸附非極性強非極性強的物質(zhì)。的物質(zhì)。l為了便于為了便于解吸附解吸附，對于，對于極性大極性大的分離物，選擇的分離物，選擇極性較小極性較小的的吸附劑

14、吸附劑，反之亦然，反之亦然 。l極性吸附劑、分離極性吸附劑、分離弱極性弱極性物質(zhì)、弱極性溶劑洗脫；分離物質(zhì)、弱極性溶劑洗脫；分離強極性強極性物質(zhì)、用物質(zhì)、用強極性強極性溶劑溶劑l理想吸附劑理想吸附劑和和溶劑溶劑的選擇：依據(jù)原則，依靠的選擇：依據(jù)原則，依靠經(jīng)驗經(jīng)驗和和多次試驗多次試驗。l常用吸附劑：常用吸附劑：l硅膠、氧化鋁硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土、羥基磷灰石羥基磷灰石等等l硅膠的硅醇基（分離中性和酸性成分）硅膠的硅醇基（分離中性和酸性成分）l氧化鋁：多孔氧化鋁：多孔Al2O3，分三種：酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁，分三種：酸性氧化鋁、中

15、性氧化鋁、堿性氧化鋁l活性炭：非極性吸附劑、常用于活性炭：非極性吸附劑、常用于脫色和脫臭脫色和脫臭等吸附過程等吸附過程l層析方式（層析方式（2 2種）：種）： ：羥基磷灰石（羥基磷灰石（HAHA），），CaCa3 3(PO(PO4 4) )3 3OHOH2 2 ，酸性蛋白質(zhì)、酶、核酸、病酸性蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒等生命大分子毒等生命大分子。硅膠硅膠：含硅醇基團（含硅醇基團（-Si-OH-Si-OH），氨基酸、甾體激素、皂苷類、），氨基酸、甾體激素、皂苷類、類脂和色素等等。（分離并洗脫）類脂和色素等等。（分離并洗脫）：（只分離不洗脫），（只分離不洗脫），例如：例如：硅膠硅膠薄層層析和薄層層析和聚

16、酰胺薄膜聚酰胺薄膜薄層層析薄層層析u 硅膠薄層層析硅膠薄層層析：硅膠板分類（硅膠板分類（4 4類）類），硅膠硅膠H H（純硅膠），能用腐蝕性強的顯色劑；（純硅膠），能用腐蝕性強的顯色劑；硅膠硅膠G G（10%-15%10%-15%煅石膏和煅石膏和5%5%淀粉的硅膠）淀粉的硅膠）；硅膠硅膠CMCCMC（含羧甲基纖維素）（含羧甲基纖維素）；硅膠硅膠HF254HF254( (含熒光劑的硅膠含熒光劑的硅膠H)H)。 硅膠板的制備硅膠板的制備：玻璃板玻璃板，硅膠制備硅膠制備（加溶劑碾磨），（加溶劑碾磨），鋪板鋪板，活化活化和和合格檢查：合格檢查：約約1mg1mg蘇丹黃蘇丹黃、蘇丹紅蘇丹紅和和靛酚藍靛酚藍

17、混合物乙酸乙酯溶液點樣，混合物乙酸乙酯溶液點樣，苯：苯：展層劑展層劑，RfRf：蘇丹黃蘇丹黃 蘇丹紅蘇丹紅 靛酚藍，蘇丹黃靛酚藍，蘇丹黃RfRf約約0.50.5，蘇丹紅和靛酚藍，蘇丹紅和靛酚藍RfRf之差在之差在0.10.20.10.2。 分析程序：點樣，展層，顯色。分析程序：點樣，展層，顯色。u聚酰胺薄膜薄層層析：聚酰胺薄膜薄層層析： 如：如：DNS氨基酸分析，氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），靈敏度（二甲氨基萘磺酰氯），靈敏度10-910-10mol/L。 DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定條件下反應。和氨基酸或多肽在特定條件下反應。 DABTH-氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。

18、氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。 Edman降解試劑降解試劑DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯二甲氨基偶氮苯-4-異硫氰酸酯）異硫氰酸酯）進行微量蛋白質(zhì)序列分析（進行微量蛋白質(zhì)序列分析（210 nmol肽樣品）。肽樣品）。單向紙層析單向紙層析 雙向紙層析雙向紙層析 薄層層析薄層層析硅膠硅膠G板薄層層析板薄層層析2、凝膠色譜凝膠色譜：凝膠凝膠過濾、過濾、排阻色譜或分子篩層析排阻色譜或分子篩層析以具有以具有篩孔篩孔的介質(zhì)為固定相，依據(jù)的介質(zhì)為固定相，依據(jù)分子大小分子大小進行物質(zhì)分離的進行物質(zhì)分離的液相色譜技術(shù)。液相色譜技術(shù)。 原理：原理：分子在固相分子在固相篩孔篩孔中自由擴散、滲透，中自由擴

19、散、滲透，不同尺寸的分子不同尺寸的分子在篩孔中的在篩孔中的分配系數(shù)分配系數(shù)不同，導致分子流動速度不同。不同，導致分子流動速度不同。流動相流動過程中，物質(zhì)在凝膠內(nèi)和凝膠外很快達到分配平衡。流動相流動過程中，物質(zhì)在凝膠內(nèi)和凝膠外很快達到分配平衡。分子量分子量大，大，排阻大，分子量小，排阻小，物質(zhì)按分子量的大小流出分離柱。排阻大，分子量小，排阻小，物質(zhì)按分子量的大小流出分離柱。分子排阻范圍為：分子排阻范圍為：0100%。（排阻率為。（排阻率為0和和100的物質(zhì)不能分離。的物質(zhì)不能分離。Why？）？）u如何理解？如何理解？凝膠色譜示意圖凝膠色譜示意圖0100200020406080elution vo

20、lume/mlAbsorbance/mAU UV280LH3LH2 分配系數(shù)分配系數(shù)（ Kav ）：）：l 分離組分在凝膠分離組分在凝膠內(nèi)水內(nèi)水和和外水外水體積中的比例關(guān)系。體積中的比例關(guān)系。l Kav=(Ve-V0)/Vi Vt=Vo+Vi+Vg， Vt、Vo、Vi和和Vg分別為：分別為：床體積床體積、外水體外水體積、積、內(nèi)水體積內(nèi)水體積和介質(zhì)的體積。和介質(zhì)的體積。 Ve：分離組分流出的體積。：分離組分流出的體積。 分離物質(zhì)的大小，分離物質(zhì)的大小，0 Kav 1， Kav=0或或 Kav=1，不能分離。，不能分離。凝膠種類和性質(zhì)：凝膠種類和性質(zhì)：l種類：浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰

21、胺、葡聚糖凝膠等：種類：浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等：l常用種類和商品名稱常用種類和商品名稱（根據(jù)分類對象選擇凝膠材料）（根據(jù)分類對象選擇凝膠材料）u交聯(lián)交聯(lián)葡聚糖葡聚糖（Sephadex G10G200）；）； Amersham Biosciencesu交聯(lián)交聯(lián)瓊脂糖瓊脂糖（Sepharose CL-4B,CL-6B）uSephacryl S 系列（聚丙烯酰胺系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）葡聚糖）uSuperdes 系列系列 （高交聯(lián)瓊脂糖（高交聯(lián)瓊脂糖-葡聚糖）葡聚糖）uBio-Beads S-X系列系列 （苯乙烯（苯乙烯-二乙烯苯）二乙烯苯）uBio-Gel P系列

22、系列 （聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺） Bio-RaduBio-Gel A系列系列 （瓊脂糖）（瓊脂糖）uTSKgel SW 系列系列 （硅膠硅膠）uTSKgel Toyopearl HW 系列，親水性聚乙烯醇系列，親水性聚乙烯醇 Toyo Soda uTSKgel PW 系列系列 親水性親水性聚乙烯聚乙烯uTSKgel CW-35 纖維素纖維素uCellulofine 纖維素纖維素 Chisso操作程序：操作程序：l凝膠選擇和處理（型號和粒度、凝膠用量、凝膠處理）凝膠選擇和處理（型號和粒度、凝膠用量、凝膠處理）l凝膠柱的制備凝膠柱的制備（柱選擇：徑長比約為：（柱選擇：徑長比約為：1:251:100，

23、裝柱、柱鑒定），裝柱、柱鑒定）l平衡層析柱平衡層析柱l加樣和洗脫（加樣、洗脫、樣品收集，檢測）加樣和洗脫（加樣、洗脫、樣品收集，檢測）l凝膠柱的再生和保存凝膠柱的再生和保存應用：應用：l分離純化、脫鹽和濃縮、去熱源物質(zhì)分離純化、脫鹽和濃縮、去熱源物質(zhì)l分析檢測（定性、定量、分子量）。分析檢測（定性、定量、分子量）。Kav=-blgMr+c（3）離子交換色譜：）離子交換色譜：理解：理解：依據(jù)電荷大小依據(jù)電荷大小 進行物質(zhì)分離的進行物質(zhì)分離的液相色譜技術(shù)液相色譜技術(shù)。原理：原理：l固相介質(zhì)上結(jié)合有一定的固相介質(zhì)上結(jié)合有一定的離子基團離子基團。l結(jié)合結(jié)合陽離子基團陽離子基團，稱陰離子交換劑，其，稱陰

24、離子交換劑，其反離子反離子為陰離子（如：為陰離子（如：Cl-）。）。l在適當?shù)臈l件下，反離子與分離物中的陰離子交換。在適當?shù)臈l件下，反離子與分離物中的陰離子交換。l在不同鹽濃度或在不同鹽濃度或pH值下，將帶不同電荷的物質(zhì)洗脫下來。值下，將帶不同電荷的物質(zhì)洗脫下來。洗脫方式：洗脫方式：l洗脫劑分類：鹽梯度洗脫；洗脫劑分類：鹽梯度洗脫；pH梯度洗脫。梯度洗脫。l洗脫梯度分類：連續(xù)梯度；不連續(xù)梯度。洗脫梯度分類：連續(xù)梯度；不連續(xù)梯度。01503000100200300 UV280 CNaclConcentration of Nacl/10-3mol*l-1Absorbance at 280nm/mA

25、Uelution volume/ml50%sampleRC-LH1LH20150300020 離子交換劑分類（離子交換劑分類（2種）種）l交換劑分類交換劑分類I（根據(jù)交換劑所帶電荷：根據(jù)交換劑所帶電荷：2大類）大類）陽離子陽離子交換劑：交聯(lián)交換劑：交聯(lián)陰陰離子基團，與陽離子交換。如：離子基團，與陽離子交換。如：羧甲基羧甲基（-O-CH2-COO-）陰離子陰離子交換劑：交聯(lián)交換劑：交聯(lián)陽陽離子基團，與陰離子交換。如：離子基團，與陰離子交換。如：氨基乙基氨基乙基（-O(CH2)2-NH3+）l交換劑分類交換劑分類II（根據(jù)（根據(jù)基質(zhì)的組成基質(zhì)的組成和性質(zhì)：和性質(zhì)：2大類）大類）u疏水性疏水性離子交

26、換劑離子交換劑（親水性較小的合成樹脂，如苯乙烯與二乙烯苯的聚合物）親水性較小的合成樹脂，如苯乙烯與二乙烯苯的聚合物）陽離子交換劑陽離子交換劑帶負電荷，電荷強弱（強酸型、中強型和弱酸型），反離子為正電荷離子帶負電荷，電荷強弱（強酸型、中強型和弱酸型），反離子為正電荷離子陰離子交換劑陰離子交換劑帶正電荷，電荷強弱（強陰性、中陰性和弱陰性），反離子為負電荷離子帶正電荷，電荷強弱（強陰性、中陰性和弱陰性），反離子為負電荷離子螯合離子交換劑螯合離子交換劑具有絡合一些金屬離子、排斥另外一些離子的能力，選擇性更高具有絡合一些金屬離子、排斥另外一些離子的能力，選擇性更高u親水性親水性離子交換劑離子交換劑（親水

27、性較大的合成物質(zhì)，纖維素、葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖等）親水性較大的合成物質(zhì)，纖維素、葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖等）陽離子交換劑陽離子交換劑陰離子交換劑陰離子交換劑常用固定相介質(zhì)常用固定相介質(zhì) DEAE（二乙基胺基乙基）（二乙基胺基乙基） Cellulose DE-32 DEAECellulose DE-52 DEAE- Sephadex A-50（25） DEAE-Sepharos CL-6b DEAE-Bio-Gel A CM（羧甲基）（羧甲基）- Cellulose DE-52 CM- Cellulose CM- Sephadex C-25(50)離子交換劑的選擇依據(jù)離子交換劑的選擇依據(jù) 物質(zhì)在溶液中的

28、電荷性質(zhì)物質(zhì)在溶液中的電荷性質(zhì) 物質(zhì)的吸附特性（疏水、親水）物質(zhì)的吸附特性（疏水、親水） 實踐和經(jīng)驗實踐和經(jīng)驗蛋白質(zhì)分離 離子交換色譜操作程序離子交換色譜操作程序 洗脫方式：梯度洗脫洗脫方式：梯度洗脫連續(xù)梯度和非連續(xù)梯度洗脫連續(xù)梯度和非連續(xù)梯度洗脫 應用：物質(zhì)分離、測定等電點（應用：物質(zhì)分離、測定等電點（PIPI）凝膠預處理凝膠預處理裝住裝住平衡平衡上樣上樣洗脫洗脫再生再生（4 4）親和層析）親和層析利用分子間利用分子間特異性可逆特異性可逆結(jié)合對物質(zhì)進行結(jié)合對物質(zhì)進行特異性分離特異性分離的的液相色譜技術(shù)液相色譜技術(shù)。 原理：原理：l具有具有特異性親和力特異性親和力的的兩個分子兩個分子中，一個固

29、定在中，一個固定在不溶性的基質(zhì)不溶性的基質(zhì)上，對另一個分子進上，對另一個分子進行分離。（次級作用力相互作用的分子）行分離。（次級作用力相互作用的分子）l固定在基質(zhì)上的分子稱固定在基質(zhì)上的分子稱配體配體，共價鍵與基質(zhì)相連，構(gòu)成，共價鍵與基質(zhì)相連，構(gòu)成固定相固定相。l流動相中的分子被特異性地與固定相吸附，使物質(zhì)彼此分離。流動相中的分子被特異性地與固定相吸附，使物質(zhì)彼此分離。l如：如：酶酶抑制劑、抗原抑制劑、抗原抗體、抗體、A A蛋白蛋白AgAg、配體、配體配基、過渡金屬離子（配基、過渡金屬離子（CuCu、NiNi、ZnZn、CoCo等）與等）與O O、S S、N N等供電子基團形成配位鍵，可與蛋白

30、質(zhì)表面組氨酸的等供電子基團形成配位鍵，可與蛋白質(zhì)表面組氨酸的咪唑基咪唑基、半胱氨酸的、半胱氨酸的巰基巰基、色氨酸的、色氨酸的吲哚吲哚基發(fā)生親和基發(fā)生親和作用。如作用。如NiNi柱柱分離帶有分離帶有組氨酸標簽組氨酸標簽的工程蛋白的工程蛋白。 操作程序：操作程序：l制備固相吸附劑制備固相吸附劑（選擇凝膠、專一性合成、分析鑒定）（選擇凝膠、專一性合成、分析鑒定）裝柱裝柱平衡平衡上樣吸附上樣吸附清洗清洗解解析分離析分離柱再生柱再生平衡平衡l解析劑：低解析劑：低pH pH 、高鹽、競爭性洗脫劑、鹽酸胍、高鹽、競爭性洗脫劑、鹽酸胍、 尿素等變性劑等。（尿素等變性劑等。（次級鍵次級鍵）l柱再生：高濃度鹽、尿

31、素等溶液等柱再生：高濃度鹽、尿素等溶液等l應用：物質(zhì)分離、測定活性應用：物質(zhì)分離、測定活性親和層析原理和程序親和層析原理和程序理解理解（5）疏水性相互作用色譜）疏水性相互作用色譜利用利用疏水作用疏水作用將不同物質(zhì)分離的將不同物質(zhì)分離的液相色譜技術(shù)液相色譜技術(shù)。u原理：原理：利用表面偶聯(lián)利用表面偶聯(lián)疏水性基團疏水性基團的基質(zhì)作為固相的基質(zhì)作為固相疏水吸附劑，疏水吸附劑，流動相中蛋白質(zhì)等大分子組分與疏水固定相發(fā)生疏水作用，流動相中蛋白質(zhì)等大分子組分與疏水固定相發(fā)生疏水作用，依據(jù)分離物組分與固相吸附劑疏水作用的差異。依據(jù)分離物組分與固相吸附劑疏水作用的差異。分離物質(zhì)分離物質(zhì)按疏水作用按疏水作用由小到

32、大的順序分離開來。由小到大的順序分離開來。u特點：特點：疏水吸附劑：含有苯基、辛基、丁基、醚基等疏水基團。疏水吸附劑：含有苯基、辛基、丁基、醚基等疏水基團。高鹽溶液中，蛋白吸附能力強，高鹽溶液中，蛋白吸附能力強，高鹽上樣，高鹽上樣，降低鹽度將蛋白洗脫分離。降低鹽度將蛋白洗脫分離。成本高，僅用于實驗室小規(guī)模分離。成本高，僅用于實驗室小規(guī)模分離。（6）反向色譜：）反向色譜： 利用表面利用表面非極性非極性的基質(zhì)為固定相，的基質(zhì)為固定相，極性極性有機溶劑（包括水）為有機溶劑（包括水）為流動相流動相，進行，進行物質(zhì)分離的色譜技術(shù)。物質(zhì)分離的色譜技術(shù)。 特點：特點：l固定相表面完全被固定相表面完全被非極性

33、基團非極性基團覆蓋，具有強的覆蓋，具有強的疏水性疏水性。l固定相吸附劑：如：以硅膠為載體，硅烷化連接固定相吸附劑：如：以硅膠為載體，硅烷化連接C4、C8、C18烷基或苯基。烷基或苯基。 l典型代表：典型代表：反相反相C18柱柱常用常用C18硅烷化的硅烷化的硅膠硅膠為吸附劑，極性很小。為吸附劑，極性很小。l極性流動相：其典型代表：甲醇和乙腈。極性流動相：其典型代表：甲醇和乙腈。 類別：制備型色譜和分析型色譜類別：制備型色譜和分析型色譜 應用：物質(zhì)的分離和檢測（定性和定量分析）應用：物質(zhì)的分離和檢測（定性和定量分析）l當今液相色譜最當今液相色譜最主流的分離模式主流的分離模式l適于適于所有能夠所有能

34、夠溶于溶于極性或弱極性溶劑極性或弱極性溶劑中的有機物質(zhì)的分離。中的有機物質(zhì)的分離。（7）分配色譜）分配色譜（也稱液（也稱液液色譜）液色譜）利用分離組分在利用分離組分在固定相固定相與與流動相流動相之間之間溶解度溶解度的差異來的差異來實現(xiàn)分離實現(xiàn)分離的的色譜技術(shù)色譜技術(shù)。u原理：原理：分配色譜的固定相是分配色譜的固定相是液相溶劑液相溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者載體表面?；蛘咻d體表面。本質(zhì)上是組分分子在本質(zhì)上是組分分子在固定相固定相和和流動相流動相之間不斷達到之間不斷達到溶解平衡溶解平衡的過程。的過程。依據(jù)溶解度的不同，將組分分離。依據(jù)溶解

35、度的不同，將組分分離。u分類：分類：u正相色譜正相色譜（normal phase）：）： 是由是由極性固定相極性固定相和和非極性非極性（或弱極性）（或弱極性）流動相流動相所組成的液相色譜體系所組成的液相色譜體系 。吸附色譜也屬正相色譜。吸附色譜也屬正相色譜。極性鍵合固定相：極性鍵合固定相： 鍵合具有二醇基、醚基、氰基、氨基等鍵合具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團極性基團分子的載體。分子的載體。u反相色譜反相色譜（reversed phase）： 由由非極性固定相非極性固定相和和極性流動相極性流動相所組成的液相色所組成的液相色譜體系，與正相體系的譜體系，與正相體系的極性極性正好相反。正好相反

36、。非極性鍵合固定相：非極性鍵合固定相： 鍵合烷基、苯基等非極性有機分子。鍵合烷基、苯基等非極性有機分子。（8 8） 高效液相色譜高效液相色譜 高效液相色譜高效液相色譜是是色譜色譜的一個重要分支，的一個重要分支，l以以，采用，采用，將，將的單一溶劑或不同的單一溶劑或不同比例的混合溶劑或緩沖液等比例的混合溶劑或緩沖液等泵入裝有固定相的泵入裝有固定相的，l在層析柱內(nèi)各組分彼此分離，依次進入在層析柱內(nèi)各組分彼此分離，依次進入進行檢測，從而實現(xiàn)對進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣進行試樣進行分析和制備分析和制備的色譜技術(shù)。的色譜技術(shù)。特點：特點： 高柱效、高精度、高靈敏度（微量）、高分辨率高柱效、高精度、高靈敏度

37、（微量）、高分辨率快速全自動分析快速全自動分析 主要由主要由組成：組成：。 其它其它輔助裝置輔助裝置：如梯度洗脫，脫氣、自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。：如梯度洗脫，脫氣、自動進樣及數(shù)據(jù)處理等。根據(jù)色譜柱和分離的原理不同，根據(jù)色譜柱和分離的原理不同，高效液相色譜分為多種類型高效液相色譜分為多種類型（8.18.1）液相色譜儀組成）液相色譜儀組成高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖 排阻色譜排阻色譜 離子交換色譜離子交換色譜 吸附層析吸附層析 親和層析親和層析 分配色譜分配色譜 疏水色譜疏水色譜 反向色譜反向色譜 聚焦色譜聚焦色譜1234 工作流程：工作流程：l高壓泵高壓泵將貯液器中將貯液器

38、中流動相溶劑流動相溶劑經(jīng)過經(jīng)過進進樣器樣器送入送入色譜柱色譜柱，通過，通過檢測器檢測器的出口的出口流出，流出，l注入欲分離樣品，流動相將注入欲分離樣品，流動相將樣品貯液樣品貯液器器（上樣環(huán)）的（上樣環(huán)）的樣品樣品帶入色譜柱帶入色譜柱進行進行分離，分離，l分離組分依先后順序進入分離組分依先后順序進入檢測器檢測器，記，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。由此得到液相色譜圖。 8.2 液相色譜儀工作流程液相色譜儀工作流程光合細菌色素光合細菌色素HPLCHPLC分析分析HPLC（USA，Angilent 1100）小結(jié)：要求掌握小結(jié)：要求掌握 液相色譜

39、概念、原理和基本操作流程液相色譜概念、原理和基本操作流程 高效液相色譜的原理和操作流程高效液相色譜的原理和操作流程 排阻色譜排阻色譜 離子交換色譜離子交換色譜 吸附層析吸附層析 親和層析親和層析 分配色譜分配色譜 疏水色譜疏水色譜 反向色譜反向色譜 聚焦色譜聚焦色譜1、純化方案的設(shè)計、純化方案的設(shè)計（1）目的：從混合組分中提取純化）目的：從混合組分中提取純化目的組分目的組分，設(shè)計方案，指導分離過程進行。，設(shè)計方案，指導分離過程進行。（2）依據(jù)：分離）依據(jù)：分離物質(zhì)物質(zhì)的性質(zhì)和特點，結(jié)合分離純化的性質(zhì)和特點，結(jié)合分離純化方法方法的特點，對分離方法進的特點，對分離方法進行比較分析，選擇出行比較分析

40、，選擇出一種或幾種一種或幾種方法的方法的組合組合。（3）原則：）原則： 各種分離方法各有特色，操作程序簡繁不一；各種分離方法各有特色，操作程序簡繁不一； 考慮分離對象的特性和結(jié)構(gòu)，以及取材的特點；考慮分離對象的特性和結(jié)構(gòu)，以及取材的特點； 分離方案分離方案不是僵化不是僵化的，在實驗中，對方案進行的，在實驗中，對方案進行不斷修正、調(diào)節(jié)、完善不斷修正、調(diào)節(jié)、完善； 設(shè)計分離純化方案設(shè)計分離純化方案表格表格并進行試驗驗證并進行試驗驗證，獲得分離工藝，獲得分離工藝。第五節(jié)第五節(jié) 分離方案和純度鑒定分離方案和純度鑒定2、純化方法的評價、純化方法的評價u理論分析的局限性：只有通過理論分析的局限性：只有通過實踐檢驗實踐檢驗檢驗真理的唯一標準檢驗真理的唯一標準；u評價方法：對分離過程的每一步評價方法：對分離過程的每一步收集留份收集留份，進行分析檢測；，進行分析檢測；l測定指標測定指標：五個指標（測定五個指標（測定2個，計算個，計算3個）個）。l測定：含量和活性測定：含量和活性計算原樣品中的總含量、總活性計算原樣品中的總含量、總活性l計算：計算：比活力，純化倍數(shù)比活力，純化倍數(shù)（比活性（比活性/粗提液比活性）粗提液比活性），收率收率（總活性（總活性/粗提液總粗提液總活性）活性）；如：如：比活力比活力酶酶（酶活（酶活/酶量），酶量），胰島素胰島素（效價（效價/蛋白量）蛋白量）l判定標準判定標準：純化