細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)

1、細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)細(xì)胞培養(yǎng)常用試劑細(xì)胞污染的鑒別及清除一、常用試劑培基血清Hanks液D-Hanks液PBSEDTA胰蛋白酶青霉素、鏈霉素培養(yǎng)基根據(jù)培養(yǎng)基的來(lái)源及成分的明確程度來(lái)劃分,其發(fā)展大致可分為三個(gè)階段:1、天然培養(yǎng)基階段(直接采用某些組織凝塊、生物性液體和組織提取液等作為細(xì)胞的培養(yǎng)基)2、合成培養(yǎng)基階段(如MEM、DMEM、RPMll640、F12等)3、無(wú)血清培養(yǎng)基階段血清何謂何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) ：胎牛血清，：胎牛血清，CS (calf serum) ：小牛血清。：小牛血清。HS (horseserum)：馬血清：

2、馬血清.1. 保存血清最好的方法保存血清最好的方法?建議血清應(yīng)保存在建議血清應(yīng)保存在-5至至-2O。然而，若存放于。然而，若存放于4時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)時(shí)，請(qǐng)勿超過(guò)一個(gè)月。若您一次無(wú)法用完一瓶，建議您無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，月。若您一次無(wú)法用完一瓶，建議您無(wú)菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。再放回冷凍。2. 如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過(guò)程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。溫下使之全融。但必須注意的是，融解過(guò)

3、程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。血清的主要作用在于向細(xì)胞提供激素(生化因子)、轉(zhuǎn)移蛋白和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理? 血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的原因是由于血清中脂蛋白的變性變性所造成，而血纖維蛋白所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會(huì)存在于在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可

4、但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi)，以以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾。我們不建議您以過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)內(nèi)一起過(guò)濾。我們不建議您以過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞您的過(guò)濾膜。阻塞您的過(guò)濾膜。4. 為什么要熱滅活血清為什么要熱滅活血清?加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫

5、學(xué)研究，培養(yǎng)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。Hanks液與D-Hanks液 BSS與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無(wú)菌狀態(tài)一致，且配方簡(jiǎn)單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細(xì)胞等，細(xì)胞在這種BSS中可生存幾個(gè)小時(shí)。 Hanks液是常見(jiàn)的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無(wú)鈣鎂離子的Hanks液（也有資料認(rèn)為除了不含鈣鎂離子之外也不含葡萄糖）。Hanks液配方Hanks液（原液）液（原液） 原液甲：原液甲： NaCl 160g K

6、Cl 8g MgSO47H2O 2g MgCl26H2O 2g 上述試劑加入上述試劑加入800ml雙蒸水。溶解。雙蒸水。溶解。 CaCl2 2.8g溶于溶于100ml雙蒸水雙蒸水 上述二液混合，加雙蒸水至上述二液混合，加雙蒸水至1000ml，再加，再加2ml氯仿防腐，氯仿防腐，4保存。保存。 原液乙：原液乙： Na2HPO412H2O 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖葡萄糖 20g 加入加入800ml雙蒸水，溶解。雙蒸水，溶解。 0.4%酚紅溶液酚紅溶液 100ml 上述二液混合，加雙蒸水至上述二液混合，加雙蒸水至1000ml，再加，再加2ml氯仿防腐，氯仿防腐，4保存。保存。 使用

7、時(shí)甲，乙原液按下列比例配成使用時(shí)甲，乙原液按下列比例配成 Hanks 液液 使用液：原液甲使用液：原液甲1份、原液乙份、原液乙1份、雙蒸水份、雙蒸水18份濾過(guò)，份濾過(guò)，20min滅菌，放滅菌，放4冰箱保冰箱保存，使用前用存，使用前用NaHCO3調(diào)整調(diào)整pH值。值。D-Hanks液配方 D-Hanks液 NaCl 4.5g KCl 0.2g NaHCO3 0.175g Na2HPO412H2O 0.076g KH2PO4 0.03g 葡萄糖 0.5g 0.4%酚紅 2.5ml 將上述成分依次溶解或加入到雙蒸水中，最后加雙蒸水定容至500ml，以5.6%NaHCO3調(diào)整 pH 值至7.4，4冰箱保

8、存?zhèn)溆谩?酚紅在低pH值時(shí)呈現(xiàn)黃色,在pH6.6至8.0間會(huì)呈現(xiàn)橙色，在高pH值時(shí)呈現(xiàn)紅色。 酚紅只是起指示酸堿度的作用，有酚紅較方便但沒(méi)有也無(wú)妨。有人主張最好不用酚紅，可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利，有時(shí)也會(huì)影響一些檢測(cè)結(jié)果。 此外酚紅有雌激素樣作用，所以如果做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)最好不加。 對(duì)于Hanks與D-hanks液的配制，不同的文獻(xiàn)有不同的配方 我們可以看到，兩者最主要的區(qū)別就是D-hanks液中沒(méi)有鈣鎂離子液中沒(méi)有鈣鎂離子。Hanks液與液與D-Hanks液液用途上的比較用途上的比較 Hanks液是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗滌組織、細(xì)胞等。細(xì)胞在Hanks液中可以在一段時(shí)間內(nèi)維

9、持一在一段時(shí)間內(nèi)維持一定的活力定的活力。另外Hanks液還可以用于終止EDTA的作用。 配制胰酶液或者是胰酶/EDTA的基礎(chǔ)液都是D-hanks 液，而不能使用Hanks液。 這是由這是由于鈣離子和鎂離子會(huì)影響胰蛋白酶的活性，于鈣離子和鎂離子會(huì)影響胰蛋白酶的活性，也會(huì)阻礙也會(huì)阻礙EDTA的作用。的作用。PBS與Hanks液的用途區(qū)別 PBS：磷酸緩沖鹽溶液具有pH緩沖作用的等滲鹽溶液。多用于非活體。 Hanks：平衡鹽溶液無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖濃度接近大部分動(dòng)物（植物）細(xì)胞的水平，可作為動(dòng)（植）物細(xì)胞短期培養(yǎng)（保存）。多用于活體。 Hanks液中鹽成分較PBS復(fù)雜，且有葡萄糖，可為細(xì)胞提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)，

10、而PSB中只有磷酸根，鈉，鉀，氯離子，只是最簡(jiǎn)單的鹽平衡緩沖液，不能為細(xì)胞提供暫時(shí)的營(yíng)養(yǎng)。 EDTA與胰蛋白酶 EDTA，常用的陽(yáng)離子螯合劑。 組織細(xì)胞間存在鈣黏蛋白（一類(lèi)Ca2+依賴的細(xì)胞黏著糖蛋白 ）。而EDTA可以通過(guò)螯合金屬離子，破壞Ca2+或Mg2+依賴性的細(xì)胞黏著。 胰蛋白酶 水解細(xì)胞間的蛋白質(zhì)，方便形成細(xì)胞懸液。 消化細(xì)胞時(shí)可以只使用胰蛋白酶，也可以胰蛋白酶與EDTA同時(shí)使用。 胰蛋白酶的消化作用可以通過(guò)加入血清終止。 EDTA的作用可以通過(guò)加入Hanks液終止。青霉素與鏈霉素 一般合稱雙抗。 青霉素主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效。 鏈霉素對(duì)許多革蘭陰性桿菌作用良好。細(xì)胞的污染及清除細(xì)胞

11、培養(yǎng)最怕污染，要控制細(xì)菌、霉菌污染，必須對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的每一個(gè)環(huán)節(jié)都認(rèn)真對(duì)待。對(duì)于細(xì)菌污染，常用的抗生素有慶大霉素、阿米卡星等，霉菌污染，則可用制霉菌素。細(xì)胞污染的鑒別及清除真菌污染真菌污染細(xì)菌污染細(xì)菌污染支原體污染支原體污染其他其他真菌污染煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等霉菌污染后培養(yǎng)液是清亮的，多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見(jiàn)，絲狀、管狀、及樹(shù)枝狀菌絲懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。預(yù)防：培養(yǎng)箱的托盤(pán)加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體；用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤(pán)里也加上飽和量的硫酸銅防治：可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；但細(xì)胞一

12、旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無(wú)補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。細(xì)菌污染 細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象。倒置顯微鏡下觀察，可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。 支原體污染支原體是牛血清中最常見(jiàn)的微生物之一，黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁。不能用過(guò)濾的辦法除去其他污染黑蛟蟲(chóng)：低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無(wú)須特殊處理。如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。污染的預(yù)防污染的預(yù)防從物品、用品消毒添加抗生素：聯(lián)合應(yīng)用比單用效果好從操作者做起抗生素抗生素抗菌譜抗菌譜濃度（量濃度（量/mL）細(xì)菌細(xì)菌真菌真菌支原體支原體青霉素青霉素G+G+10