多倍體水稻加倍方法

1、水稻基因組間雜種水稻基因組間雜種ACD,AACD的的多倍化及比較研究多倍化及比較研究碩士研究生：廖聲容指導(dǎo)老師 ：蔡得田 教授目錄研究背景及意義實(shí)驗(yàn)材料和內(nèi)容實(shí)驗(yàn)結(jié)果小結(jié)一、研究背景及意義1、研究背景 水稻是世界重要的糧食作物之一，倍受人們關(guān)注。 水稻育種工作在經(jīng)歷了高稈變矮稈、常規(guī)稻變雜交稻兩次巨大飛躍之后，其產(chǎn)量已經(jīng)長期處于徘徊不前的局面。 原因：傳統(tǒng)的雜交水稻育種多是同一基因組栽培稻種內(nèi)優(yōu)良基因的利用。而栽培稻種的有利基因貧乏，雜交親本間多樣性太少。 野生稻經(jīng)長期自然環(huán)境的選擇保留了很多優(yōu)良性狀（如抗蟲，抗逆）和栽培稻所不具有或已消失了的遺傳基因，已知野生稻有23種，所具有的有利基因有待

2、更多的開發(fā)與利用。 多倍體植物一般生活能力強(qiáng)，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，具有抗旱、抗寒、抗病蟲害等優(yōu)勢。 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種雜交存在雜交不親和、雜種難以成活和雜種不育等障礙，雜種的多倍體化可以提高雜種的育性 需要進(jìn)行栽野雜交和多倍體化整體基因組轉(zhuǎn)移，創(chuàng)建異源多倍體材料。2、本研究的目的與意義 有效的從遠(yuǎn)緣野生稻物種中轉(zhuǎn)移有利基因，創(chuàng)建異源雜種及其多倍體；為人工創(chuàng)造同源異源多倍體提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；為更好的利用基因組間多倍體雜種優(yōu)勢實(shí)現(xiàn)異源多倍體超級(jí)稻育種目標(biāo)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)；二、實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)材料亞洲栽培稻（O.sativa L.,AA）品種DTS137；高稈野生稻(O.alta )RW147

3、（CCDD）；具高結(jié)實(shí)特點(diǎn)的品系HN2026（ApAp）；以上品種雜交形成的雜種CW026-3x（ACD）、CW026-6x（AACCDD）；回交雜種AACD和本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)形成AAAACCDD；個(gè)材料之間的親緣關(guān)系：2.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 (1)同源異源八倍體材料（AAAACCDD）的創(chuàng)建 誘導(dǎo)AACD生長旺盛的愈傷組織，并用6種不同處理方式進(jìn)行染色體加倍第一種方法：誘導(dǎo)培養(yǎng)基（ 秋水仙素0.2g/L ，20天），轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基。第二種方法：加倍液（秋水仙素0.5g/L， 48h ），誘導(dǎo)培養(yǎng)基（10天），轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基。第三種方法：加倍液（秋水仙素0.5g/L，48h

4、），轉(zhuǎn)二級(jí)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含秋水仙素0.2g/L，10天），再轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基，最后轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)基。第四種方法：加倍液（秋水仙素0.5g/L和8-羥基喹啉1g/L，12h），轉(zhuǎn)誘導(dǎo)培養(yǎng)基（25天），再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)生根培養(yǎng)基。第五種方法：第二種途徑得到的綠色小芽點(diǎn)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（ 秋水仙素0.2g/L ），待長出幼苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基。第六種方法：加倍液（秋水仙素0.5g/L，48h），轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基（20天），再用加倍液處理一次后轉(zhuǎn)分化培養(yǎng)基，最后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基。（2）水稻根尖染色體的觀察，及倍性鑒定（3）觀察比較不同倍性材料的外部形態(tài)（4）各材料花粉育性與活性的觀察（5）水稻花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂

5、的觀察（6）SSR分子標(biāo)記的鑒定三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、同源異源八倍體（AAAACCDD）創(chuàng)建a.愈傷組織b.愈傷組織分化出苗c.幼苗在生根培養(yǎng)基中成長方式愈傷（5-6個(gè)/瓶）出苗數(shù)目多倍體苗數(shù)目加倍成功率14瓶354548.9%11.4%26瓶15018084.4%5.3%34瓶273023.3%3.7%44瓶283512.8%3.5%54瓶303538.6%10%66瓶1301402819.3%20.8%AACD染色體加倍結(jié)果：結(jié)果說明栽培稻/野生稻加倍獲得多倍體是相當(dāng)困難的，與栽培稻品種或亞種間雜種加倍頻率達(dá)46.7%比較，獲得異源多倍體材料是寶貴的，進(jìn)一步提高誘導(dǎo)頻率研究也是必要的。 2、根尖

6、染色體的計(jì)數(shù)ABCD圖A：CW026-3x(36) 圖C：CW026-6x(72)圖B：AACD (48) 圖D：AAAACCDD(96)3、親本，雜種及雜種多倍體材料的形態(tài)學(xué)比較觀察項(xiàng)ApApCCDDACDAACCDDAACDAAAACCDD株高cm91.2168.3120.712197.525.7分蘗數(shù)710510121571091226穗長cm19.826.222.525.723.5芒長cm無6.58.79.110.40.9粒長mm6.50.80.70.80.750.7粒寬mm2.70.280.250.350.30.3粒數(shù)12300000芒色無白紅紅紅紅柱頭顏色白白白白白白劍葉長cm11

7、.819.529.732.237.516.7劍葉寬cm2.42.73.12.82.60.45結(jié)實(shí)率%98/12300000落粒性否落落落落落谷粒顏色黃褐AAAACCDD雜種ACD生長旺盛、莖稈粗壯。株高、穗長、芒長都顯示其雜合性。其遺傳性狀基本介于雙親之間，但受野生稻的影響更強(qiáng)。其染色體加倍后的AACCDD植株整體更高大、葉片變寬、穗粒變長變寬變大，芒也變長 ，且它的雌性育性恢復(fù)了。AACD的株高、穗長、芒長都介于兩親本之間，但穗粒的粒長明顯比雙親長，粒寬也稍比雙親寬，且不易落粒顯示出良好的傾栽培性和雜優(yōu)性，它染色體加倍后的八倍體（AAAACCDD）植株則表現(xiàn)生長發(fā)育遲緩，矮小，葉色更深更綠，

8、而且分蘗少，存活困難，處于一種“病態(tài)”狀 。 4、花粉育性和活性A,B,E圖為AA材料C,D,F圖為CCDD材料AACD材料花粉育性的觀察5、花粉減數(shù)分裂觀察結(jié)果HN2026花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程A：細(xì)線期IB：粗線期IC：終變期ID：中期IE：后期IF：末期IG：前期H：末期I：四分體時(shí)期RW147花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程A：細(xì)線期IB：終變期IC：中期ID：后期IE：末期IF：中期G：后期H：末期I：四分體時(shí)期A、B：ACD減數(shù)分裂時(shí)期C、D、F：AACCDD減數(shù)分裂時(shí)期G：末期I； H：中期 I：后期； A：雙線期I； B：細(xì)線期I； C：終變期I； D：中期I； E：中期I； F：后期

9、I； J：后期；K：末期； L：末期；AACD花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程：6、異源多倍體水稻SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果左圖：RM598座位上的擴(kuò)增圖 右圖： RM3513座位上的擴(kuò)增圖圖A中泳道1：DL2000 泳道2：HN2026； 泳道3：RW147； 泳道4：CW026-3x ； 泳道5：AACD ； 泳道6：AAAACCDD 圖B中泳道11:DL2000； 泳道1：HN2026； 泳道2：RW147； 泳道3：CW026-3x ； 泳道4：AACD ； 泳道5：AAAACCDD； 泳道6：HN2026 泳道7：RW147；泳道8：CW026-3x； 泳道9：AACD； 泳道10：AAAACCDDAB四、小結(jié)1、通過不同的6種不同處理方法進(jìn)行染色體加倍，成功獲得同源異源八倍體水稻AAAACCDD2、在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)上對(duì)雜種及雜種多倍體材料進(jìn)