第三章_微載體培養(yǎng)技術(shù)

1、一、何謂微載體？一、何謂微載體？指直徑指直徑60-250m60-250m，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。微珠。一般是由一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成成。第三章第三章 微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體培養(yǎng)技術(shù)（microcarrier culture techniquemicrocarrier culture technique） 最初采用在培養(yǎng)液中加入一定數(shù)量的小滾瓶，最初采用在培養(yǎng)液中加入一定數(shù)量的小滾瓶，增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積。增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積。此方法構(gòu)造簡(jiǎn)單，成本低，重復(fù)性好，放此方法構(gòu)造簡(jiǎn)單，成本低，重復(fù)性好，放大過(guò)程可依靠滾

2、瓶數(shù)量的增加。大過(guò)程可依靠滾瓶數(shù)量的增加。但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間大但產(chǎn)率低，勞動(dòng)強(qiáng)度大，占空間大。如何增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積？如何增加細(xì)胞生長(zhǎng)的貼壁面積？微載體系統(tǒng)微載體系統(tǒng) 19671967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。 兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。 現(xiàn)廣泛用于培養(yǎng)各類細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)現(xiàn)廣泛用于培養(yǎng)各類細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品。品。微載體培微載體培養(yǎng)系統(tǒng)養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)培養(yǎng)4h4h，微載體間的細(xì)，微載體間的細(xì)胞胞“橋聯(lián)橋聯(lián)” ” 200200 電鏡下串在一起的電鏡下串在一起的肝細(xì)胞微載體肝細(xì)胞微載體730

3、 730 由于肝細(xì)胞的粘附作用微載由于肝細(xì)胞的粘附作用微載體形成體形成“串珠串珠” ” 400400 脊髓灰質(zhì)炎、狂脊髓灰質(zhì)炎、狂犬和乙腦等疫苗犬和乙腦等疫苗二、微載體的商品類型二、微載體的商品類型第一種微載體第一種微載體： Van WezelVan Wezel用用DEAE-Sephadex A50DEAE-Sephadex A50研制而來(lái)研制而來(lái)市售（國(guó)際）種類有十幾種以上：市售（國(guó)際）種類有十幾種以上：液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMAPHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽

4、凝膠微載體以及磁性微載體等體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等常用商品化微載體有三種：常用商品化微載體有三種： Cytodex1 Cytodex1、2 2、3 3，CytoporeCytopore和和CytolineCytoline顯微鏡下的高密度微載體顯微鏡下的高密度微載體l優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性優(yōu)良的微載體應(yīng)具有的特性價(jià)廉價(jià)廉，能，能重復(fù)重復(fù)使用。使用。不含不含能能毒害毒害細(xì)胞細(xì)胞的的成分成分；微載體須微載體須與細(xì)胞有良好的相容性與細(xì)胞有良好的相容性；密度密度應(yīng)應(yīng)略大于培養(yǎng)基略大于培養(yǎng)基；粒徑粒徑在在4040120120m m范圍，生理鹽水溶脹后增大到范圍，生理鹽水溶脹后增大到60602

5、50 250 m m，粒度分布地均勻，徑差不大于，粒度分布地均勻，徑差不大于20202525m m；良好的良好的光學(xué)透明性光學(xué)透明性；能在能在PBSPBS中中耐耐120120125125、202030min30min高溫滅菌高溫滅菌；應(yīng)是應(yīng)是非剛性材料非剛性材料；不吸收不吸收培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分營(yíng)養(yǎng)成分；收獲收獲細(xì)胞或細(xì)胞制品細(xì)胞或細(xì)胞制品容易容易，不影響蛋白質(zhì)分離純化不影響蛋白質(zhì)分離純化；三、微載體培養(yǎng)原理與操作三、微載體培養(yǎng)原理與操作 1 1、原理：、原理：將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒微載體加入到培養(yǎng)容器的微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)培養(yǎng)液中，作為載體，使

6、細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。始終保持懸浮狀態(tài)。 絲網(wǎng)絲網(wǎng)微載體微載體通氣的培養(yǎng)基通氣的培養(yǎng)基鼓泡器鼓泡器攪拌葉輪攪拌葉輪微載體培養(yǎng)裝置圖微載體培養(yǎng)裝置圖微載體的大小微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內(nèi)表面積增大單位體積內(nèi)表面積（S/FS/F）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。使微載體直）對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在徑盡可能小，最好控制在100-200m100-200m之間。之間。 微載體的密度微載體的密度：一般為一般為1.03-1.05g/cm1.03-1.05g/cm2 2，隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密

7、度可逐漸增大。隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密度可逐漸增大。 微載體的表面電荷微載體的表面電荷：據(jù)研究，控制細(xì)胞據(jù)研究，控制細(xì)胞貼壁的基本因素貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過(guò)大，反而會(huì)產(chǎn)生密度過(guò)大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性毒性”效應(yīng)。效應(yīng)。 細(xì)胞能否黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的細(xì)胞能否黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接接觸概率和相融性觸概率和相融性。 細(xì)胞細(xì)胞增殖階段：增殖階段：黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層；黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層；貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上：貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上：貼附

8、是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵，貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵，主要是靠靜主要是靠靜電引力和范德華力；電引力和范德華力；VeroVero細(xì)胞在細(xì)胞在Cytodex-3Cytodex-3微載體表面粘附鋪展的形貌變化微載體表面粘附鋪展的形貌變化通常做法：通常做法：貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度，最大速度75r/min75r/min。 2 2、攪拌轉(zhuǎn)速：、攪拌轉(zhuǎn)速：動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪

9、切力敏感，動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，。攪拌速率越大，制得的微球越小，攪拌速率越大，制得的微球越小，聚合物濃度越大，制得的微球較大聚合物濃度越大，制得的微球較大以聚己內(nèi)酯（以聚己內(nèi)酯（PCLPCL）、聚左旋乳酸（）、聚左旋乳酸（PLLAPLLA）、聚乙醇酸）、聚乙醇酸聚乳酸共聚物（聚乳酸共聚物（PGLAPGLA）為基質(zhì)制備可生物降解微載體）為基質(zhì)制備可生物降解微載體 3 3、細(xì)胞與微載體的相融性：、細(xì)胞與微載體的相融性： 與與微載體表面理化性質(zhì)微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理在進(jìn)入生理pHpH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用載體帶

10、正電荷，則利用靜電引力靜電引力可加快細(xì)可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，因靜電胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。 (a)MCC(a)MCC細(xì)胞，未經(jīng)處理的細(xì)胞，未經(jīng)處理的Cytodex-3Cytodex-3表面；表面；(b)MCC(b)MCC細(xì)胞，用纖粘連蛋細(xì)胞，用纖粘連蛋白處理后的白處理后的Cytodex-3Cytodex-3表面表面 (c)Vero(c)Vero細(xì)胞，未經(jīng)處理的細(xì)

11、胞，未經(jīng)處理的Cytodex-3Cytodex-3表面；表面； (d) Vero(d) Vero細(xì)胞，用層粘連蛋白處理的細(xì)胞，用層粘連蛋白處理的Cytodex-3Cytodex-3表面表面(e) Vero(e) Vero細(xì)胞，細(xì)胞，用纖粘連蛋白處理的用纖粘連蛋白處理的Cytodex-3Cytodex-3表面表面細(xì)胞（細(xì)胞（VeroVero和和MCCMCC）在不同外源基質(zhì)處理的（）在不同外源基質(zhì)處理的（Cytodex-3Cytodex-3）微載體上貼附）微載體上貼附 4 4、細(xì)胞在微載體表面的生長(zhǎng)的影響因素、細(xì)胞在微載體表面的生長(zhǎng)的影響因素 l 細(xì)胞方面：細(xì)胞方面：細(xì)胞群體、狀態(tài)和類型。細(xì)胞群體

12、、狀態(tài)和類型。 l 微載體方面：微載體方面：微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。 l 培養(yǎng)環(huán)境中：培養(yǎng)環(huán)境中：培養(yǎng)基組成、溫度、培養(yǎng)基組成、溫度、pHpH、DODO以及代謝廢以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件最優(yōu)，則細(xì)胞生長(zhǎng)快；反之生長(zhǎng)速度慢。件最優(yōu)，則細(xì)胞生長(zhǎng)快；反之生長(zhǎng)速度慢。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟：微載體系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞的步驟：(1)(1)選擇合適的微載體類型選擇合適的微載體類型(2)(2)浸

13、泡水化及消毒浸泡水化及消毒(3)(3)接種接種 (4)(4)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞記數(shù)培養(yǎng)觀察與細(xì)胞記數(shù) (5)(5)消化消化(6)(6)分離細(xì)胞分離細(xì)胞(7)(7)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)微載體為基質(zhì)微載體纖維素為基質(zhì)微載體纖維素為基質(zhì)微載體蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體（蛋白質(zhì)為基質(zhì)微載體（變性膠原微變性膠原微載體載體: :蛋黃色，表面特性好，易與蛋黃色，表面特性好，易與細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞結(jié)合）高分子材料為基質(zhì)微載體高分子材料為基質(zhì)微載體無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì)微載體無(wú)機(jī)玻璃基質(zhì)微載體 微載體基質(zhì)微載體基質(zhì)PCLPCL微球表面多皺，微球表面多皺，PLLAPLLA微球表面布滿坑洞，微球表面布滿坑洞，PGLAPG

14、LA微球表面光滑微球表面光滑不同種類聚酯的微球表面形貌差異不同種類聚酯的微球表面形貌差異多孔載體培養(yǎng)多孔載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): :降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。生長(zhǎng)空間大，降低血清用量，增加細(xì)胞固定性。生長(zhǎng)空間大，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，免受機(jī)械損傷，可以提高攪拌強(qiáng)度和通氣量，強(qiáng)化傳質(zhì)；強(qiáng)化傳質(zhì)；多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適合懸浮細(xì)多孔載體不僅能培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，也適合懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)；胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)；多孔載體固定細(xì)胞過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害和多孔載體固定細(xì)胞過(guò)程簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害和損傷，細(xì)胞可從長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移損傷，細(xì)胞可從長(zhǎng)滿細(xì)胞的微載體中自動(dòng)轉(zhuǎn)移到

15、未長(zhǎng)細(xì)胞的新載體上生長(zhǎng)，接種方便，培養(yǎng)到未長(zhǎng)細(xì)胞的新載體上生長(zhǎng)，接種方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，特別適合于反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。簡(jiǎn)單，特別適合于反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)。多孔載體制備的材料選擇多孔載體制備的材料選擇(1(1) )生物相容性生物相容性：材料對(duì)細(xì)胞必須無(wú)毒害，對(duì)貼壁：材料對(duì)細(xì)胞必須無(wú)毒害，對(duì)貼壁細(xì)胞有良好的黏附作用；細(xì)胞有良好的黏附作用；(2)(2)機(jī)械穩(wěn)定性：機(jī)械穩(wěn)定性：微載體在長(zhǎng)時(shí)間攪拌狀態(tài)下不破微載體在長(zhǎng)時(shí)間攪拌狀態(tài)下不破碎；同時(shí)滿足微載體清洗處理、碎；同時(shí)滿足微載體清洗處理、回收利用的要求。回收利用的要求。(3)(3)熱穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性：在在121 121 、蒸汽滅菌下不分解、蒸汽滅菌下不分解、不

16、破碎、不軟化。不破碎、不軟化。主要考慮生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性主要考慮生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性5 5、微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)、微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn) 培養(yǎng)初期培養(yǎng)初期：u保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的pHpH與溫度水平與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）至終體積接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）至終體積1/31/3的培養(yǎng)液的培養(yǎng)液中，以中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。u不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度不同，不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度不同，常使用常使用2-3g/L2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃的微載體含量，更高的微載體濃度需要控

17、制環(huán)境或經(jīng)常換液。度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。 l貼壁階段貼壁階段（3-8d3-8d）后）后，緩慢加入培養(yǎng)液，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度至工作體積，并且增加攪拌速度保證完保證完全均質(zhì)混合全均質(zhì)混合。 培養(yǎng)維持期培養(yǎng)維持期：u進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢；及細(xì)胞形態(tài)鏡檢；u隨著細(xì)胞增殖，微球變得越來(lái)越重，需隨著細(xì)胞增殖，微球變得越來(lái)越重，需增增加攪拌速率加攪拌速率；u經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)3d3d左右，培養(yǎng)液開(kāi)始呈酸性，需左右，培養(yǎng)液開(kāi)始呈酸性，需換液換液：停止攪拌，讓微珠沉淀停止攪拌，讓微珠沉淀5min5min，棄掉適宜體，棄掉適宜體積

18、的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（3737），重新開(kāi)始攪拌。），重新開(kāi)始攪拌。 收獲細(xì)胞收獲細(xì)胞：首先首先排干排干培養(yǎng)液，至少用培養(yǎng)液，至少用緩沖液緩沖液漂洗漂洗1 1遍，然后遍，然后加入加入相應(yīng)的相應(yīng)的酶酶，快，快速速攪拌攪拌（75-125r/min75-125r/min）20-30min20-30min。然后。然后解離收集解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品細(xì)胞及其產(chǎn)品。 微載體培養(yǎng)的放大微載體培養(yǎng)的放大：可以通過(guò)：可以通過(guò)增加微載增加微載體的含量或培養(yǎng)體積體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異進(jìn)行放大。使用異倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已

19、被放大至已被放大至4000L4000L以上。以上。 細(xì)胞形態(tài)飽滿、細(xì)胞形態(tài)飽滿、生長(zhǎng)良好生長(zhǎng)良好細(xì)胞形態(tài)更加立體，輪廓清晰，細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞形態(tài)更加立體，輪廓清晰，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，少量微載體上細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿明顯增加，少量微載體上細(xì)胞幾乎長(zhǎng)滿微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)微載體上細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，細(xì)胞形態(tài)健康滿，細(xì)胞形態(tài)健康微載體上細(xì)胞更加致密，細(xì)胞微載體上細(xì)胞更加致密，細(xì)胞密度達(dá)到密度達(dá)到5106個(gè)個(gè)/ml以上以上微載體上細(xì)胞依然良好，微載體上細(xì)胞依然良好，沒(méi)有明顯細(xì)胞脫落現(xiàn)象沒(méi)有明顯細(xì)胞脫落現(xiàn)象Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第細(xì)胞微載體培養(yǎng)第1天天Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第細(xì)胞微載體培養(yǎng)第2天天Marc145

20、細(xì)胞微載體培養(yǎng)第細(xì)胞微載體培養(yǎng)第3天天Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第細(xì)胞微載體培養(yǎng)第4天天Marc145細(xì)胞微載體培養(yǎng)第細(xì)胞微載體培養(yǎng)第10天天四、微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)四、微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn) 培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。 表面積表面積/ /體積大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；體積大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高； 把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)； 可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長(zhǎng)情況；可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長(zhǎng)情況；簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，重現(xiàn)性好簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素

21、的檢測(cè)和控制，重現(xiàn)性好； 培養(yǎng)基利用率較高；培養(yǎng)基利用率較高； 放大容易；放大容易； 細(xì)胞收獲過(guò)程不復(fù)雜；細(xì)胞收獲過(guò)程不復(fù)雜； 勞動(dòng)強(qiáng)度??；勞動(dòng)強(qiáng)度小； 傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)方法疫苗生產(chǎn)的流感病毒在雞胚內(nèi)培養(yǎng)疫苗生產(chǎn)的流感病毒在雞胚內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)過(guò)程：對(duì)幾百萬(wàn)個(gè)蛋胚逐一接種和收獲，很難自動(dòng)化、生產(chǎn)過(guò)程：對(duì)幾百萬(wàn)個(gè)蛋胚逐一接種和收獲，很難自動(dòng)化、勞動(dòng)強(qiáng)度大、時(shí)間消耗多，且有污染的可能。勞動(dòng)強(qiáng)度大、時(shí)間消耗多，且有污染的可能。Baxter Biomedical研究中心，研究中心， 奧地利奧地利如今如今大規(guī)模微載體培養(yǎng)大規(guī)模微載體培養(yǎng)VeroVero細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗成為可能細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗成為可能馴化馴化Ver

22、oVero細(xì)胞適應(yīng)在用于大規(guī)模生產(chǎn)的無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)細(xì)胞適應(yīng)在用于大規(guī)模生產(chǎn)的無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)。中試生產(chǎn)中最終的生物反應(yīng)器規(guī)模是基內(nèi)生長(zhǎng)。中試生產(chǎn)中最終的生物反應(yīng)器規(guī)模是12001200升。升。包括工藝設(shè)計(jì)，特殊的通氣和攪拌裝置，可以進(jìn)一步放大包括工藝設(shè)計(jì)，特殊的通氣和攪拌裝置，可以進(jìn)一步放大到生產(chǎn)體積為到生產(chǎn)體積為60006000升。升。關(guān)于關(guān)于H1N1H1N1疫苗生產(chǎn)疫苗生產(chǎn)流感疫苗生產(chǎn)的大規(guī)模生產(chǎn)區(qū)域流感疫苗生產(chǎn)的大規(guī)模生產(chǎn)區(qū)域(A) (A) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) (B) (B) 離心分離離心分離(C) (C) 超濾、洗濾。超濾、洗濾。VeroVero細(xì)胞流感疫苗生產(chǎn)圖細(xì)胞流感疫苗生

23、產(chǎn)圖 (A) (A) 未感染的細(xì)胞未感染的細(xì)胞 (B) (B) 早期細(xì)胞病變?cè)缙诩?xì)胞病變影響影響 (C) (C) 收獲前的晚期細(xì)胞病變收獲前的晚期細(xì)胞病變大規(guī)模流感病毒生產(chǎn)中細(xì)胞病變影響圖片大規(guī)模流感病毒生產(chǎn)中細(xì)胞病變影響圖片本章講授到此，謝謝！本章講授到此，謝謝！何謂微載體？何謂微載體？ 指直徑在指直徑在60-250m60-250m，能適用于貼壁細(xì)胞，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。合成的聚合物組成。原理：原理： 將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆粒- -微載體加入到培養(yǎng)微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使

24、細(xì)胞在微載容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過(guò)持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。體始終保持懸浮狀態(tài)。回想一下：回想一下： 一、微囊法一、微囊法（microencapsulationmicroencapsulation）: : 用一層用一層親水的半透膜親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及的微囊里，細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜；囊內(nèi)是種微小培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞

25、生長(zhǎng)好、密度高。受損傷，故細(xì)胞生長(zhǎng)好、密度高。第四章第四章 動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微囊化培養(yǎng)圖圖4 41 1 微膠囊示意圖微膠囊示意圖微膠囊膜微膠囊膜生物大分子生物大分子代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物細(xì)胞細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)二、研究發(fā)展歷程二、研究發(fā)展歷程1 1、首次報(bào)道生物活性物質(zhì)的微囊化研究首次報(bào)道生物活性物質(zhì)的微囊化研究（19571957）： 將將，形成球狀微膠囊，形成球狀微膠囊, , 稱之為稱之為“生物微膠囊生物微膠囊”。通過(guò)微膠囊膜的選擇透過(guò)作。通過(guò)微膠囊膜的選擇透過(guò)作用用, , 使囊外大于某一分子量的物質(zhì)不能擴(kuò)散進(jìn)使囊外大于某一分子量的物質(zhì)不能擴(kuò)散進(jìn)入入, , 而生物環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分和囊

26、內(nèi)生物活性而生物環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分和囊內(nèi)生物活性物質(zhì)或細(xì)胞分泌的小分子產(chǎn)物可以自由出入微物質(zhì)或細(xì)胞分泌的小分子產(chǎn)物可以自由出入微膠囊膠囊, , 從而達(dá)到從而達(dá)到免疫隔離免疫隔離目的。目的。2 2、“人工細(xì)胞人工細(xì)胞”“人工胰腺人工胰腺” 80 80年代初年代初, Lim, Lim等人等人將微囊化技術(shù)與組織細(xì)胞將微囊化技術(shù)與組織細(xì)胞移植相結(jié)合移植相結(jié)合, , 制備了制備了海藻酸鈉海藻酸鈉/ /聚賴氨酸聚賴氨酸(APA)(APA)微膠微膠囊囊, , 形成形成“人工細(xì)胞人工細(xì)胞”, , 并移植入并移植入糖尿病大鼠體內(nèi)糖尿病大鼠體內(nèi), , 結(jié)果成功地調(diào)節(jié)了血糖水平結(jié)果成功地調(diào)節(jié)了血糖水平, , 代代行了

27、大鼠胰腺功能行了大鼠胰腺功能, , 因而被稱為因而被稱為“人工胰腺人工胰腺”。該。該成果較好地解決了組織細(xì)胞移植過(guò)程的成果較好地解決了組織細(xì)胞移植過(guò)程的免疫排斥問(wèn)免疫排斥問(wèn)題題, , 避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用避免或減少了昂貴的免疫抑制劑的使用, , 為組為組織細(xì)胞移植治療神經(jīng)織細(xì)胞移植治療神經(jīng)/ /內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病提供了新思內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病提供了新思路。路。3 3、9090年代以來(lái)年代以來(lái), , 醫(yī)學(xué)界開(kāi)始嘗試以微膠囊作為基醫(yī)學(xué)界開(kāi)始嘗試以微膠囊作為基因重組細(xì)胞的因重組細(xì)胞的免疫隔離和運(yùn)載工具免疫隔離和運(yùn)載工具, , 利用重組細(xì)利用重組細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生

28、理功能, , 治療相關(guān)疾病。治療相關(guān)疾病。 微囊化人胰島微囊化人胰島 培養(yǎng)培養(yǎng)15d15d微囊化小牛腎上腺微囊化小牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞嗜鉻細(xì)胞 培養(yǎng)培養(yǎng)10d微囊化肝癌細(xì)胞微囊化肝癌細(xì)胞 培養(yǎng)培養(yǎng)40d40d4 4、目前、目前，微膠囊的應(yīng)用研究涉及藥物控制釋放、，微膠囊的應(yīng)用研究涉及藥物控制釋放、 動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞和酶的固定化以及生化動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞和酶的固定化以及生化物質(zhì)分離等領(lǐng)域物質(zhì)分離等領(lǐng)域, , 已經(jīng)成為已經(jīng)成為材料、化學(xué)、化工、材料、化學(xué)、化工、生物和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域生物和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域工作者的研究熱點(diǎn)。工作者的研究熱點(diǎn)。 SEM下微膠囊的顯微形貌下微膠囊的顯微形貌 200 L

29、SCM下微膠囊表面形貌的照片下微膠囊表面形貌的照片不同放大倍數(shù)的海藻酸鈣微膠囊的不同放大倍數(shù)的海藻酸鈣微膠囊的SEM SEM 照片照片不同放大倍數(shù)的殼聚糖不同放大倍數(shù)的殼聚糖/ /海藻酸鈉微膠囊的海藻酸鈉微膠囊的SEM SEM 照片照片三、性質(zhì)：三、性質(zhì)：u 曾是酶固定化技術(shù)中的一種（曾是酶固定化技術(shù)中的一種（半透膜將酶包半透膜將酶包裹在球狀的微囊里，酶及大分子不能從微囊里透裹在球狀的微囊里，酶及大分子不能從微囊里透出，而小分子物質(zhì)可自由通過(guò)膜出，而小分子物質(zhì)可自由通過(guò)膜）。）。u 動(dòng)物細(xì)胞微囊化后，與游離細(xì)胞相比，動(dòng)物細(xì)胞微囊化后，與游離細(xì)胞相比，降低降低了培養(yǎng)時(shí)對(duì)細(xì)胞的剪切力，同時(shí)也能提供

30、很高的了培養(yǎng)時(shí)對(duì)細(xì)胞的剪切力，同時(shí)也能提供很高的細(xì)胞密度，使得產(chǎn)物濃度增加，純度提高。細(xì)胞密度，使得產(chǎn)物濃度增加，純度提高。u 動(dòng)物細(xì)胞微囊化培養(yǎng)的成功為干擾素、乙肝動(dòng)物細(xì)胞微囊化培養(yǎng)的成功為干擾素、乙肝表面抗原表面抗原(HBsAg)(HBsAg)、單克隆抗體、單克隆抗體(MAb)(MAb)等的產(chǎn)生提等的產(chǎn)生提供了廣泛應(yīng)用前景。供了廣泛應(yīng)用前景。 表表4 41 1 微膠囊制備材料微膠囊制備材料 來(lái)源來(lái)源類型類型 材料材料 天然天然脂質(zhì)脂質(zhì)卵磷脂、神經(jīng)鞘髓磷脂等卵磷脂、神經(jīng)鞘髓磷脂等 多糖多糖海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂、淀粉等海藻酸鹽、殼聚糖、瓊脂、淀粉等蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)明膠、白蛋白、纖維蛋白明膠、白蛋

31、白、纖維蛋白 半合成半合成纖維素類纖維素類衍生物衍生物羧甲基纖維素鈉、已基纖維素、醋羧甲基纖維素鈉、已基纖維素、醋酸纖維素及其酯等酸纖維素及其酯等 合成合成可降解型可降解型乳酸乳酸/ /乙醇酸共聚物、聚正酯、聚內(nèi)酯、聚乙醇酸共聚物、聚正酯、聚內(nèi)酯、聚酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸酐、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨基酸 非降解型非降解型聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙烯聚苯乙烯、乙烯醋酸乙酯共聚物、聚氯乙烯等等 制備方法制備方法 化學(xué)法化學(xué)法 界面聚合法、乳化法、輻射化學(xué)法界面聚合法、乳化法、輻射化學(xué)法 物理化學(xué)法物理化

32、學(xué)法 相分離法、溶劑蒸發(fā)法、界面沉積法、噴霧干燥法相分離法、溶劑蒸發(fā)法、界面沉積法、噴霧干燥法 物理法物理法 靜電沉積法、氣相沉積法、流化床噴霧包衣法靜電沉積法、氣相沉積法、流化床噴霧包衣法 圖圖2 2制備方法使用率比較制備方法使用率比較1 1乳化法，乳化法，2 2靜電法，靜電法，3 3聚合法，聚合法，4 4沉積法，沉積法，5 5相分離法，相分離法，6 6噴霧干燥法，噴霧干燥法，7 7溶劑蒸發(fā)法溶劑蒸發(fā)法 四、四、 微囊化培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn)微囊化培養(yǎng)技術(shù)要點(diǎn): : u操作：在無(wú)菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物操作：在無(wú)菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)及生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊質(zhì)及

33、生長(zhǎng)介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊, , 再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；u生長(zhǎng)介質(zhì)為生長(zhǎng)介質(zhì)為1.4%1.4%海藻酸鈉溶液海藻酸鈉溶液, , 半透膜由多聚賴氨半透膜由多聚賴氨酸形成；酸形成；u培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)；培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)；u微囊直徑控制在微囊直徑控制在200-400m200-400m為宜。為宜。 五、動(dòng)物細(xì)胞微囊化的制備五、動(dòng)物細(xì)胞微囊化的制備 主要是應(yīng)用海藻酸主要是應(yīng)用海藻酸聚氨基酸的方法聚氨基酸的方法 簡(jiǎn)單過(guò)程：簡(jiǎn)單過(guò)程：動(dòng)物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞與海藻酸海藻酸溶液混合攪拌，經(jīng)過(guò)微囊發(fā)溶液混合攪拌，經(jīng)過(guò)微囊發(fā)生

34、器將微球滴入生器將微球滴入氯化鈣氯化鈣(cacl(cacl2 2) )溶液中，形成凝溶液中，形成凝膠，膠，然后再用然后再用聚氨基酸聚氨基酸處理，使微球表面成膜，處理，使微球表面成膜，最后用最后用檸檬酸檸檬酸處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便處理去除微球內(nèi)的鈣離子，以便球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞得以懸浮在其球內(nèi)的海藻酸成液態(tài)，動(dòng)物細(xì)胞得以懸浮在其中。中。動(dòng)物細(xì)胞的微囊化中動(dòng)物細(xì)胞的微囊化中是關(guān)鍵材是關(guān)鍵材料。料。針頭針頭CaClCaCl2 2液液微珠微珠磁力攪拌器磁力攪拌器（微囊發(fā)生器）（微囊發(fā)生器）海藻酸海藻酸/ /細(xì)胞懸浮液細(xì)胞懸浮液聚氨基酸聚氨基酸檸檬酸檸檬酸聚賴氨酸聚賴氨酸/ /海藻酸微囊化

35、步驟海藻酸微囊化步驟：1.1.懸浮細(xì)胞膠狀液；懸浮細(xì)胞膠狀液；2.2.成滴器；成滴器；3.3.膠化小珠；膠化小珠；4.4.包被溶液；包被溶液；5.5.顯微鏡下微囊；顯微鏡下微囊；6.6.多孔微囊膜；多孔微囊膜；7.7.完成操作后的微囊。完成操作后的微囊。 制備注意事項(xiàng)：制備注意事項(xiàng)： 溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作；體和生理?xiàng)l件下操作； 所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害；所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害； 膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代膜的孔徑可控制，必須使?fàn)I養(yǎng)物和代謝物自由通過(guò)；謝物自由通過(guò)； 膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。膜應(yīng)有足夠機(jī)械強(qiáng)度抵抗培養(yǎng)中攪拌。 可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中受到物理?yè)p傷可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中受到物理?yè)p傷; ; 活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜活性蛋白不能從囊中自由出入半透